Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud
January 17th, 2014
Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.
Het algemene doel van deze procedure is om het effect van fenotypemodulatoren zoals hostgen-silencing of de impact van kleine moleculen op mycobacterium tuberculosis, intracellulaire replicatie te meten. Dit wordt bereikt door eerst kleine moleculen en 384-well platen uit te delen of cellen met irna te doorsnijden en in een complex te transfecteren. De volgende stap is om cellen te infecteren met groen fluorescerende eiwitten die mycobacterium tuberculosis of G-F-P-M-T-B uitdrukken, cellen toe te voegen aan de putten met kleine moleculen en de microplaat gedurende vijf dagen te incuberen.
Voor de RNAi-aanpak worden cellen toegevoegd aan RNAi-transfectiecomplex bevattende putten. De microplaat wordt drie dagen geïncubeerd en vervolgens worden cellen geïnfecteerd met G-F-P-M-T-B expresserend mycobacterium tuberculosis. Na het kleuren van de cellen is de laatste stap om de platen te lezen met behulp van een geautomatiseerde confocale microscoop.
Uiteindelijk wordt geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie gevolgd door op beelden gebaseerde analyse gebruikt om de veranderingen in G-F-P-M-T-V intracellulaire groei te meten. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals kolonievormende eenheidsjacht is dat het lange incubatieperiode bespaart en meer doorvoer toestaat. Het demonstreren van deze procedure zal worden gedaan door Christophe Keval of SONG en drie postdoctorale fellows uit mijn onderzoeksteam.
De protocollen voor SI RNA-bibliotheekscreening en verbindingenbibliotheekscreening gebruiken twee weken oude GFP-uitdrukkende MYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 RV-culturen. Om de G-F-P-M-T-B-bacteriesuspensie voor te bereiden, centrifugeert u de cultuur eerst gedurende vijf minuten bij 4.000 Gs, gooit de supernatant weg, suspendeert u de cultuur in DPBS en centrifugeert u opnieuw op deze manier. Was de cultuur drie keer met DPBS.
Na de derde wassing, gooit u het supernat weg en suspendeert u de bacteriële pellet in 10 milliliter 10%FBS bevattend RPMI 1640-medium. Laat de suspensie een uur op kamertemperatuur staan om de bacterie-aggregaten te laten sedimenteren. Verzamel de bacteriële supernat en meet de OD bij 600 nanometer en GFP-fluorescentie.
Met behulp van een microplaatlezer om de bacterieconcentratie te bepalen, moet de OD bij 600 nanometer tussen 0,6 en 0,8 liggen. Bereken het titer van de suspensie met behulp van een referentieregressielijn, waarbij de RFU-waarde wordt weergegeven als een functie van de CFU-waarde die vóór de experimenten werd gegenereerd op een andere cultuur die in dezelfde omstandigheden was bereid. Een typische concentratie is een keer 10 tot de achtste bacterie per milliliter.
Begin deze procedure door de gedroogde SI RNA-bibliotheek, die is opgeslagen in 96. Well moederplaten met een X-S-I-R-N-A-buffer, op te schalken tot een concentratie van twee micromolar. Breng 10 microliter van het mengsel over in elk putje van een 384 well dochterplaat. Breng 2,5 microliter SI RNA van elk putje van de dochterplaat over in een 384 well assayplaat naar dezelfde assayplaat.
Voeg 2,5 microliter van een negatieve en positieve controle IRNA toe aan hun respectieve putten. Als de dochterplaat niet onmiddellijk zal worden gebruikt, verzegel deze met een afplakbare aluminium verzegeling. De verzegelde plaat kan gedurende ten minste zes maanden en mogelijk tot twee tot drie jaar worden bewaard bij min 20 graden Celsius, afhankelijk van de IRNA.
Aanbevelingen van de bibliotheekfabrikant. Bereid de transfectiereagentia voor door deze te verdunnen in een X-D-P-B-S om voldoende oplossing te verkrijgen om 0,1 microliter voor elk te voorzien. Pre incubeer de verdunde transfectieoplossing gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.
Voeg 7,5 microliter van de verdunde transfectieoplossing toe aan elk putje van de 384 well assayplaat en incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur tot elk putje van de assayplaat 40 microliter van humane type twee pneumocyten, A 5 4 9 cellen gesuspendeerd in RPMI 1640-medium aangevuld met 10% foetaal bovien serum. Bewaar cellen gedurende een incubatieperiode van drie dagen bij 37 graden Celsius in een atmosfeer met 5% koolstofdioxide. Deze cellen delen zich om de 24 uur, dus ongeveer 12.000 cellen bevinden zich drie dagen na transfectie in elk putje.
Drie dagen na si. RNA-transfectie van een 5 49 cellen bereidt u een MTBH 37 RV GFP bacteriesuspensie voor. Zoals eerder gedemonstreerd.
De suspensie moet 2,4 keer 10 tot de zesde bacterie per milliliter bevatten, wat overeenkomt met een infectiemultipliciteit van vijf. Verwijder het medium in de 384 well assayplaat en voeg 25 microliter van de bacteriesuspensie toe per putje. Incubeer de 384 well assayplaat gedurende vijf uur bij 37 graden Celsius in een atmosfeer met 5% koolstofdioxide.
Na vijf uur. Verwijder het medium en was de cellen voorzichtig drie keer met RPMI-medium aangevuld met 10%FBS om de overgebleven extracellulaire bacteriën te doden. Behandel de cellen in elk putje met 50 microliter.
Een verse R-P-M-I-F-B-S-medium bevattend 50 microgram per milliliter van Amikacin. Incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een atmosfeer met 5% koolstofdioxide. Verwijder ten slotte het medium met Amikacin en voeg 50 microliter vers RPMI-medium toe aangevuld met 10%FBS per.Putje.
Incubeer de assayplaat gedurende vijf dagen bij 37 graden Celsius in een atmosfeer met 5% koolstofdioxide voordat u screent met confocale microscopie. Om deze procedure te beginnen, ontdooit u een 384 well moederplaat bevattende de verbindingenbibliotheek, opgelost in 100%DMSO bij kamertemperatuur. Breng 0,5 microliter van de verbindingen van de moederplaat over naar een 384 well dochterplaat bevattend 10 microliter per putje van RPMI 1640. Medium aangevuld met
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een fenotypisch assay voor hoogdoorvoerscherming van small-interfering RNA (siRNA), chemische verbindingen en Mycobacterium tuberculosis mutantenbibliotheken. De methode maakt gebruik van geautomatiseerde confocale microscopie om fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis binnen gastheercellen te detecteren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Hoogdoorvoerscherming
Achtergrond
- Mycobacterium tuberculosis is een belangrijk pathogeen dat tuberculose veroorzaakt.
- Het begrijpen van de intracellulaire replicatie is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen.
- Fenotypische assays kunnen helpen bij het identificeren van modulatoren van bacteriële replicatie.
- Geautomatiseerde microscopie maakt een efficiënte analyse van grote steekproeven mogelijk.
Doel van de studie
- Om de effecten van fenotype modulatoren op Mycobacterium tuberculosis te meten.
- Om de impact van kleine moleculen en RNA-interferentie op bacteriële replicatie te evalueren.
- Om een robuuste assay voor hoogdoorvoerscherming te ontwikkelen.
Gebruikte methoden
- Kleine moleculen uitdelen in 384-well platen.
- Cellen transfecteren met siRNA en incuberen.
- Cellen infecteren met GFP-expresserende Mycobacterium tuberculosis.
- Geautomatiseerde confocale microscopie gebruiken om resultaten te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van Mycobacterium tuberculosis binnen gastheercellen.
- Identificatie van potentiële modulatoren die de bacteriële replicatie beïnvloeden.
- Aangetoonde haalbaarheid van de hoogdoorvoerschermingsmethodologie.
- Inzichten geboden in de interacties tussen gastheercellen en Mycobacterium tuberculosis.
Conclusies
- De ontwikkelde assay is effectief voor het screenen van potentiële therapeutische middelen.
- Verdere studies kunnen uitbreiden op de geïdentificeerde modulatoren.
- Deze methode kan bijdragen aan het begrip van de pathogenese van tuberculose.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This phenotypic assay enables high-throughput quantification of intracellular Mycobacterium tuberculosis, supporting target validation and lead identification in anti-infective drug discovery. By providing image-based, multiparametric readouts of bacterial colonization within host cells, it delivers predictive confidence for mechanistic de-risking of host-directed and antimicrobial candidates. The assay’s adaptation to 384-well format and automated confocal microscopy positions it for scalable screening of siRNA, chemical compound, and mutant libraries, directly addressing the need for efficient target and pathway interrogation in tuberculosis research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying intracellular bacterial load upon host gene silencing or compound treatment.
- Operational Value: Supports functional target validation through phenotypic readouts that reflect pathogenesis-relevant mechanisms.
- Predictive Value: Generates quantitative data (e.g., bacterial area per cell, % infected cells) to prioritize targets with de-risked mechanistic roles in Mtb colonization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Optimized for 384-well microplates, enabling compatibility with siRNA, chemical compound, and Mtb mutant library screens.
- Quantitative Output: Delivers multiparametric analysis including total bacterial area, cellular area, and intracellular bacteria-to-cell ratio for robust hit selection.
- Scalability: Automated confocal microscopy and image-based analysis support high-content, high-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses GFP-expressing Mtb H37Rv in human alveolar epithelial (A549) and primary macrophage models, reflecting intracellular pathogenesis.
- Translational Continuity: Bridges early target hits to preclinical validation by measuring effects in physiologically relevant host-pathogen systems.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on dose-response relationships (e.g., IC50, MEC99) derived from compound screening.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy, particularly for host-directed therapeutics and novel antimicrobials targeting intracellular replication.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of host factors (e.g., DIN1) and pathways involved in Mtb intracellular survival via siRNA screening.
- Screening: Delivers standardized, reproducible infection models with quantitative fluorescence readouts for compound library evaluation.
- Analytics: Provides image-derived metrics (GFP signal co-localization, host cell normalization) enabling comparison across conditions and plate-based Z-score calculation.
- Translational Research: Uses primary human macrophages infected with Mtb, supporting relevance to human infection and biomarker-aligned mechanism exploration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening genetic and chemical modulators of intracellular bacterial growth across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking genotype or compound treatment to phenotypic changes in intracellular bacterial burden.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through automated imaging and defined infection protocols (e.g., MOI=5, 5-day incubation).
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing quantitative, pathogenesis-linked efficacy data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits based on dose-response and target modulation data, reducing late-stage failure risk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, mycobacterial handling (BSL-3), transfection, and automated confocal microscopy operation.
- Dependent on access to automated confocal microscopes with laser/excitation settings for GFP (488 nm/520 nm) and far-red dyes, plus image analysis software (e.g., Acapella).
- Necessitates cross-team standardization of infection timing, antibiotic wash steps (e.g., Amikacin), and fluorescence staining protocols for consistent readouts.
- Adaptation to alternative host cells or pathogens requires validation of labeling, infection efficiency, and signal separation in multiplex channels.
- Practical limitations include biosafety constraints for Mtb handling and the need for optimization when scaling to non-standard model systems or library formats.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:44
Preparation of the Bacterial Suspension
3:07
High-throughput Genome-wide siRNA Screening
6:16
High-throughput Compound Screening
8:27
Image Acquisition and Analysis
11:10
Results: Mtb Colonization in Host Cells is Inhibited by Silencing Dectin-1 and by Isonazid or Rifampicin Treatment
14:37
Conclusion
