Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Het algemene doel van deze procedure is om het effect van fenotypemodulatoren zoals hostgen-silencing of de impact van kleine moleculen op mycobacterium tuberculosis, intracellulaire replicatie te meten. Dit wordt bereikt door eerst kleine moleculen en 384-well platen uit te delen of cellen met irna te doorsnijden en in een complex te transfecteren. De volgende stap is om cellen te infecteren met groen fluorescerende eiwitten die mycobacterium tuberculosis of G-F-P-M-T-B uitdrukken, cellen toe te voegen aan de putten met kleine moleculen en de microplaat gedurende vijf dagen te incuberen.

Voor de RNAi-aanpak worden cellen toegevoegd aan RNAi-transfectiecomplex bevattende putten. De microplaat wordt drie dagen geïncubeerd en vervolgens worden cellen geïnfecteerd met G-F-P-M-T-B expresserend mycobacterium tuberculosis. Na het kleuren van de cellen is de laatste stap om de platen te lezen met behulp van een geautomatiseerde confocale microscoop.

Uiteindelijk wordt geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie gevolgd door op beelden gebaseerde analyse gebruikt om de veranderingen in G-F-P-M-T-V intracellulaire groei te meten. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals kolonievormende eenheidsjacht is dat het lange incubatieperiode bespaart en meer doorvoer toestaat. Het demonstreren van deze procedure zal worden gedaan door Christophe Keval of SONG en drie postdoctorale fellows uit mijn onderzoeksteam.

De protocollen voor SI RNA-bibliotheekscreening en verbindingenbibliotheekscreening gebruiken twee weken oude GFP-uitdrukkende MYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 RV-culturen. Om de G-F-P-M-T-B-bacteriesuspensie voor te bereiden, centrifugeert u de cultuur eerst gedurende vijf minuten bij 4.000 Gs, gooit de supernatant weg, suspendeert u de cultuur in DPBS en centrifugeert u opnieuw op deze manier. Was de cultuur drie keer met DPBS.

Na de derde wassing, gooit u het supernat weg en suspendeert u de bacteriële pellet in 10 milliliter 10%FBS bevattend RPMI 1640-medium. Laat de suspensie een uur op kamertemperatuur staan om de bacterie-aggregaten te laten sedimenteren. Verzamel de bacteriële supernat en meet de OD bij 600 nanometer en GFP-fluorescentie.

Met behulp van een microplaatlezer om de bacterieconcentratie te bepalen, moet de OD bij 600 nanometer tussen 0,6 en 0,8 liggen. Bereken het titer van de suspensie met behulp van een referentieregressielijn, waarbij de RFU-waarde wordt weergegeven als een functie van de CFU-waarde die vóór de experimenten werd gegenereerd op een andere cultuur die in dezelfde omstandigheden was bereid. Een typische concentratie is een keer 10 tot de achtste bacterie per milliliter.

Begin deze procedure door de gedroogde SI RNA-bibliotheek, die is opgeslagen in 96. Well moederplaten met een X-S-I-R-N-A-buffer, op te schalken tot een concentratie van twee micromolar. Breng 10 microliter van het mengsel over in elk putje van een 384 well dochterplaat. Breng 2,5 microliter SI RNA van elk putje van de dochterplaat over in een 384 well assayplaat naar dezelfde assayplaat.

Voeg 2,5 microliter van een negatieve en positieve controle IRNA toe aan hun respectieve putten. Als de dochterplaat niet onmiddellijk zal worden gebruikt, verzegel deze met een afplakbare aluminium verzegeling. De verzegelde plaat kan gedurende ten minste zes maanden en mogelijk tot twee tot drie jaar worden bewaard bij min 20 graden Celsius, afhankelijk van de IRNA.

Aanbevelingen van de bibliotheekfabrikant. Bereid de transfectiereagentia voor door deze te verdunnen in een X-D-P-B-S om voldoende oplossing te verkrijgen om 0,1 microliter voor elk te voorzien. Pre incubeer de verdunde transfectieoplossing gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.

Voeg 7,5 microliter van de verdunde transfectieoplossing toe aan elk putje van de 384 well assayplaat en incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur tot elk putje van de assayplaat 40 microliter van humane type twee pneumocyten, A 5 4 9 cellen gesuspendeerd in RPMI 1640-medium aangevuld met 10% foetaal bovien serum. Bewaar cellen gedurende een incubatieperiode van drie dagen bij 37 graden Celsius in een atmosfeer met 5% koolstofdioxide. Deze cellen delen zich om de 24 uur, dus ongeveer 12.000 cellen bevinden zich drie dagen na transfectie in elk putje.

Drie dagen na si. RNA-transfectie van een 5 49 cellen bereidt u een MTBH 37 RV GFP bacteriesuspensie voor. Zoals eerder gedemonstreerd.

De suspensie moet 2,4 keer 10 tot de zesde bacterie per milliliter bevatten, wat overeenkomt met een infectiemultipliciteit van vijf. Verwijder het medium in de 384 well assayplaat en voeg 25 microliter van de bacteriesuspensie toe per putje. Incubeer de 384 well assayplaat gedurende vijf uur bij 37 graden Celsius in een atmosfeer met 5% koolstofdioxide.

Na vijf uur. Verwijder het medium en was de cellen voorzichtig drie keer met RPMI-medium aangevuld met 10%FBS om de overgebleven extracellulaire bacteriën te doden. Behandel de cellen in elk putje met 50 microliter.

Een verse R-P-M-I-F-B-S-medium bevattend 50 microgram per milliliter van Amikacin. Incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een atmosfeer met 5% koolstofdioxide. Verwijder ten slotte het medium met Amikacin en voeg 50 microliter vers RPMI-medium toe aangevuld met 10%FBS per.Putje.

Incubeer de assayplaat gedurende vijf dagen bij 37 graden Celsius in een atmosfeer met 5% koolstofdioxide voordat u screent met confocale microscopie. Om deze procedure te beginnen, ontdooit u een 384 well moederplaat bevattende de verbindingenbibliotheek, opgelost in 100%DMSO bij kamertemperatuur. Breng 0,5 microliter van de verbindingen van de moederplaat over naar een 384 well dochterplaat bevattend 10 microliter per putje van RPMI 1640. Medium aangevuld met