Name: Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Leer een fenotypische test voor high-throughput screening van Mycobacterium tuberculosis met geautomatiseerde confocale microscopie. Deze methode kwantificeert intracellulaire bacteriële groei voor tuberculoseonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Financiële steun voor deze werkzaamheden werd verleend door de Europese Gemeenschap (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), de Agence Nationale de Recherche, de Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) en de regio Nord Pas de Calais. We erkennen dankbaar de technische assistentie van Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni en Frank Lafont van het platform BICeL.

1. SiRNA-screening met hoge doorvoer genoombreed
Screening uitgevoerd in een menselijke Type-II pneumocyten model A549 cellijn bij infectie met Mtb H37Rv uitdrukkend Groen Fluorescerend Eiwit (GFP). Deze procedure is beschreven in figuur 1A.
<ol><li>Resuspend de gedroogde siRNA-bibliotheek die is opgeslagen in moederplaten (96-putplaten) met 1x siRNA-buffer om een concentratie van 4 μM te bereiken en breng vervolgens 10 μl van het mengsel over in een 384-put dochterplaat (dochterplaat 1).</li>
	<li>Voeg 10 μl 1x siRNA buffer toe in dochterplaat 1 om siRNA 2 keer te verdunnen. Na siRNA resuspensie worden platen verzegeld met afpelbare aluminium afdichting en kunnen ze ten minste 6 maanden en maximaal 2-3 jaar bij -20 °C worden bewaard, maar de bewaartijd kan variëren afhankelijk van de aanbevelingen van de fabrikant van de siRNA-bibliotheek.</li>
	<li>Verdun siRNAs in dochterplaat 1 in dochterplaat 2 om een concentratie van 500 nM te bereiken. Na siRNA resuspensie worden platen verzegeld met afpelbare aluminium afdichting en kunnen ze ten minste 6 maanden en maximaal 2-3 jaar bij -20 °C worden bewaard, maar de bewaartijd kan variëren afhankelijk van de aanbevelingen van de fabrikant van de siRNA-bibliotheek.</li>
	<li>Ontdooi voor gebruik dochterplaat 2 bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Neem 2,5 μl siRNA van dochterplaat 2 en plaats het in een 384-well assay plaat.</li>
	<li>Voeg in dezelfde 384-well assay plaat in stap 1.5 2,5 μl negatieve en positieve controle siRNA toe aan hun respectievelijke putten.</li>
	<li>Verdun het transfectiereagens in 1x D-PBS om voldoende oplossing te leveren om 0,1 μl transfectiereagens in elke put te leveren en de verdunde transfectieoplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur voor te stellen.</li>
	<li>Voeg 7,5 μl van het mengsel van transfectiereagens/PBS-oplossing toe aan elke put in de testplaat en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg 40 μl A549-cellen (1.500 cellen/put) toe die zijn gesuspendeerd in RPMI 1640 medium, aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS). Cellen gedurende een incubatieperiode van 3 dagen bij 37 °C bewaren in een atmosfeer met 5% CO2. Deze cellen delen elke 24 uur, dus ongeveer 12.000 cellen bevinden zich drie dagen na transfectie in de putten.</li>
	<li>Was een twee weken oude GFP-expresserende Mtb H37Rv-cultuur uit met D-PBS (vrij van MgCl2 en CaCl2)door centrifugeren op 4.000 x g gedurende 5 minuten en gooi de wasbeurten weg. Herhaal deze stap 3x. (Voor GFP-Mtb H37Rv cultuuromstandigheden zie Protocol 3).</li>
	<li>Schors de bacteriële pellet in 10 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en decanteer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om bacteriële aggregaten te laten bezinken.</li>
	<li>Verzamel het bacteriële supernatant en meet OD600 (OD600 moet tussen 0,6-0,8) en GFP-fluorescentie (RFU-waarde) zijn met behulp van een microplaatlezer om de bacteriële concentratie te bepalen. Bereken de titer van de suspensie met behulp van een referentieregressielijn met RFU-waarde = f (CFU-waarde) die vóór het experiment was gegenereerd op een andere cultuur die onder dezelfde omstandigheden was voorbereid. Bereid bacteriële suspensie voor die 2,4 x10 6 bacteriën/ml bevat, wat overeenkomt met een veelheid aan infecties (MOI) van 5.</li>
	<li>Verwijder het medium in de 384-well assay plate en voeg 25 μl vers bereide bacteriële suspensie toe.</li>
	<li>Incubeer de 384-well assay plaat bij 37 °C gedurende 5 uur in een atmosfeer die 5% CO2bevat .</li>
	<li>Verwijder het medium en was de cellen voorzichtig met RPMI medium aangevuld met 10% FBS 3x.</li>
	<li>Om de resterende extracellulaire bacteriën te doden, moet u de cellen behandelen met 50 μl vers RPMI-FBS-medium met 50 μg/ml amikacine bij 37 °C gedurende 1 uur in een atmosfeer met 5% CO2.</li>
	<li>Verwijder het medium bevattende amikacine en voeg 50 μl vers RPMI-medium toe, aangevuld met 10% FBS. Incubeer de 384-well assay plaat bij 37 °C gedurende 5 dagen in een atmosfeer die 5% CO2bevat .</li>
	<li>Voeg vóór het verkrijgen van het beeld 10 μl vers bereide 30 μg/ml DAPI toe in PBS (eindconcentratie 5 μg/ml) en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Plaats de plaat in een geautomatiseerde confocale microscoop. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a></li>
	<li>Stel de belichtingsparameters in. Registreer DAPI fluorescentie met excitatielaser 405 nm met emissiefilter 450 nm en GFP fluorescentie met excitatielaser 488 nm met emissiefilter 520 nm. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a></li>
	<li>Selecteer de putten en de velden in elke aan te verkrijgen put, die vervolgens lay-out- en sublayoutparameters wordt genoemd. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a></li>
	<li>Genereer het experimenteerbestand met behulp van de parameters uit stap 1.20 en 1.21 en voer de automatische verwerving uit. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a></li>
	<li>Afbeeldingen overbrengen naar een externe server. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a></li>
	<li>Evalueer afbeeldingen met behulp van beeldanalysesoftware. Detecteer celkernen van het DAPI-kanaal met behulp van het nuclei-detectiealgoritme en het bacteriële gebied van het GFP-kanaal met behulp van het algoritme pixelintensiteitseigenschappen (figuur 4A).</li>
</ol>Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd om het effect van genuitschakeling op de intracellulaire Mtb-groei te bestuderen. Mtb is een langzaam groeiende bacterie die zich elke 20 uur in optimale omstandigheden verdeelt. Na 5 dagen na infectie is de hoeveelheid extracellulaire Mtb nog steeds laag bij afwezigheid van cellysis en had geen invloed op de kwaliteit van de analyse. Dit protocol moet worden geoptimaliseerd in termen van lengte van antibioticabehandeling en incubatietijd om te worden aangepast voor siRNA-schermen met behulp van snelgroeiende bacteriën zoals Mycobacteria smegmatis en Escherichia coli die uitgebreid worden vrijgegeven en nieuwe cellen kunnen infecteren.
2. Compound Screening met hoge doorvoer
Screening uitgevoerd op Mtb H37Rv geïnfecteerde hostcellen. Deze procedure is beschreven in figuur 1B.
<ol><li>Ontdooi de 384-put moederplaten met de samengestelde bibliotheek oplosbaar in DMSO 100%. Breng 0,5 μl van de verbindingen over in 384-well dochterplaten met 10 μl RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS.</li>
	<li>Was een twee weken oude GFP-expresserende Mtb H37Rv-cultuur uit met D-PBS (vrij van MgCl2 en CaCl2)door centrifugeren op 4.000 x g gedurende 5 minuten en gooi de wasbeurten weg. Herhaal deze stap 3x (Voor GFP-Mtb H37Rv cultuuromstandigheden zie Protocol 3).</li>
	<li>Schors de bacteriële pellet in 10 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en decanteer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om bacteriële aggregaten te laten bezinken.</li>
	<li>Verzamel het bacteriële supernatant en meet OD600 (OD600 moet tussen 0,6-0,8) en GFP-fluorescentie (RFU-waarde) met behulp van een microplaatlezer. Bereken de titer van de suspensie met behulp van een referentieregressielijn met RFU-waarde = f (CFU-waarde) die vóór het experiment was gegenereerd. Typische concentratie is 1 x 108 bacteriën/ml.</li>
	<li>Oogst 6 dagen oude primaire menselijke macrofagen bij 4 x 105 cellen/ml in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 50 ng/ml recombinante humane M-CSF (Voor menselijke perifere bloedmonocytencellen zuivering en macrofagen differentiatie zie Protocol 4).</li>
	<li>Incubeer de verdunde primaire cellen met bacillen bij verschillende MOI, variërend van 1-5, in suspensie met mild schudden bij 90 tpm gedurende 2 uur bij 37 °C.</li>
	<li>Was de geïnfecteerde cellen door centrifugeren op 350 x g om de extracellulaire bacteriën te verwijderen. Na elke centrifugeerstap, resuspend de pellet in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS. Herhaal deze stap 2x.</li>
	<li>Schorste de geïnfecteerde cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en amikacine bij 50 μg/ml en incubeer de suspensie met mild schudden gedurende 1 uur bij 37 °C.</li>
	<li>Verwijder het celkweekmedium dat amikacine bevat door centrifugeren bij 350 x g en was de geïnfecteerde cellen met een compleet RPMI 1640-medium aangevuld met 10% FBS en 50 ng/ml recombinant humaan M-CSF. Herhaal dit één keer.</li>
	<li>Voeg in stap 2.1 40 μl van de geïnfecteerde macrofagensususpensie toe in dezelfde testplaat, die al 10 μl van de samengestelde verdunningen bevat. De uiteindelijke concentratie DMSO in elke put is nu 1%.</li>
	<li>Incubeer de testplaten gedurende 5 dagen bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2.</li>
	<li>Bevlek de levende cellen met celdoorlatende verrode fluorescerende kleurstof.</li>
	<li>Plaats de plaat in een geautomatiseerde confocale microscoop. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a></li>
	<li>Stel de belichtingsparameters in. Registreer verrode fluorescentie met excitatielaser 640 nm met emissiefilter 690 nm en GFP fluorescentie met excitatielaser 488 nm met emissiefilter 520 nm. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a></li>
	<li>Selecteer de putten en de velden in elke aan te verkrijgen put, die vervolgens lay-out- en sublayoutparameters wordt genoemd. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a></li>
	<li>Genereer het experimenteerbestand met behulp van de parameters uit stap 2.14 en 2.15 en voer de automatische acquisitie uit. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a></li>
	<li>Afbeeldingen overbrengen naar een externe server. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a></li>
	<li>Evalueer afbeeldingen met behulp van beeldanalysesoftware. Detecteer celgebied vanaf een ver rood kanaal met behulp van het algoritme pixelintensiteitseigenschappen en het bacteriële gebied van het GFP-kanaal met behulp van het algoritme pixelintensiteitseigenschappen (figuur 4B).</li>
</ol>Opmerking: Dit protocol kan worden aangepast voor Mtb mutant library screening door verbindingen te vervangen door mutanten die een fluorescerend eiwit uitdrukken (One well/One mutant) (Figuur 1C, zie ook Brodin et al. 4). Fluorescerende mutanten worden eerst in putten gezaaid (20 μl bacteriële suspensie per put). Bacteriën worden dan teruggewonnen door 30 μl celsuspensie. Na centrifugeren bij 350 x g gedurende 1 min wordt de plaat bij 37 °C geïncubeerd in een atmosfeer met 5% CO2. Incubatietijd en MOI zijn afhankelijk van de test. Als voorbeeld, voor visualisatie van vroege cellulaire gebeurtenissen zoals fagosome verzuring, kunnen de cellen gedurende 2 uur worden geïnfecteerd met MOI variërend van 1-20. Lysosomen worden gekleurd met Lysotracker-kleurstof bij 2 μM gedurende 1,5 uur bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2 en vervolgens gefixeerd met 10% formaline of 4% paraformaldehyde (PFA). Confocale afbeeldingen worden verkregen en uiteindelijk geanalyseerd met behulp van beeldanalysescripts met geschikte algoritmen voor lysosomendetectie en subcellulaire lokalisatie4.
3. Groene fluorescerende eiwit uitdrukken mycobacterium tuberculosis H37Rv (GFP-H37Rv) cultuuromstandigheden
Voor langdurige opslag werd GFP-H37Rv ingevroren in D-PBS (ongeveer 1 x 108 mycobacteriën per flacon).
<ol><li>Resuspend één bevroren flacon GFP-H37Rv in een Erlenmeyer met 50 ml 7H9 bouillonmedium aangevuld met Middlebrook OADC verrijking 10%, Glycerol 0,5%, Tween-80 0,05% en Hygromycine B (50 μg/ml).</li>
	<li>Incubeer 8 dagen bij 37 °C.</li>
	<li>Meet OD600 van de GFP-H37Rv cultuur.</li>
	<li>Verdun de GFP-H37Rv-cultuur om OD600 = 0,1 te verkrijgen in vers 7H9 bouillonmedium aangevuld met Middlebrook OADC-verrijking 10%, Glycerol 0,5%, Tween-80 0,05% en Hygromycine B (50 μg/ml).</li>
	<li>Incubeer de GFP-H37Rv bij 37 °C gedurende 8 dagen meer voor gebruik voor de test.</li>
</ol>4. Menselijke perifere bloedmonocytcellen zuivering van volbloed of Buffy-coat voorbereiding
<ol><li>Verdun het bloedzakje 2x in 1x D-PBS (vrij van MgCl2 en CaCl2) met 1% FBS.</li>
	<li>Isoleer de monocyten door Ficoll dichtheid gradiënt centrifugeren op 400 x g gedurende 20 min.</li>
	<li>Verzamel de geïsoleerde monocyten.</li>
	<li>Was de monocyten 3x met 1x D-PBS (vrij van MgCl2 en CaCl2) met 1% FBS door centrifugeren op 400 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Concentreer de cellen tot 1 x 107 cel/ml.</li>
	<li>Zuiver monocyten met behulp van CD14-magnetische kralen volgens het protocol van de fabrikant (zie Materialen).</li>
	<li>Na de zuivering van CD14-monocyten, zaait u de cellen op 1,5 x10 6 cel/ml in RPMI 1640 aangevuld met 10% FBS en 40 ng/ml menselijke macrofagen koloniestimulerende factor (hM-CSF) en gedurende 4 dagen geïncubeerd bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2.</li>
	<li>Vervang na 4 dagen het medium door verse RPMI 1640 aangevuld met 10% FBS en 40 ng/ml hM-CSF en gedurende 2 dagen geïncubeerd bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2.</li>
	<li>Na 6 dagen kunnen de cellen worden gebruikt voor de test.</li>
</ol>

<ol><li>Gandhi, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug-resistant+and+extensively+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+threat+to+global+control+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis.</a> Lancet. 375, 1830-1843 (2010).</li>
<li>Barry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+latent+tuberculosis%3A+rethinking+the+biology+and+intervention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).</li>
<li>Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+imaging+of+Mycobacterium+tuberculosis-infected+macrophages%3A+an+in+vitro+model+for+tuberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery.</a> Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).</li>
<li>Brodin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+phenotypic+cell-based+visual+screen+identifies+Mycobacterium+tuberculosis+acyltrehalose-containing+glycolipids+involved+in+phagosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling.</a> PLoS Pathog. 6, (2010).</li>
<li>Bermudez, L. E., Goodman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+invades+and+replicates+within+type+II+alveolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells.</a> Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).</li>
<li>Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrosis+of+lung+epithelial+cells+during+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis+is+preceded+by+cell+permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation.</a> Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).</li>
<li>McDonough, K. A., Kress, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+for+lung+epithelial+cells+is+a+virulence-associated+phenotype+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis.</a> Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).</li>
<li>Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dectin-1+is+inducible+and+plays+an+essential+role+for+mycobacteria-induced+innate+immune+responses+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells.</a> J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Birmingham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).</li>
<li>Carralot, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-throughput+siRNA+transfection+in+raw+264.7+macrophages%3A+a+case+study+for+optimization+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure.</a> J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illustration+of+SSMD%2C+z+score%2C+SSMD%2A%2C+z%2A+score%2C+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).</li>
<li>Song, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal-based+method+for+quantification+of+diffusion+kinetics+in+microwell+plates+and+its+application+for+identifying+a+rapid+mixing+method+for+high-content%2Fthroughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening.</a> J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten aangegeven.

We beschrijven hier de methoden die nodig zijn voor een fenotypische test met behulp van een GFP-expresserende Mtb H37Rv-stam om fluorescerend gelabelde hostcellen te infecteren, waardoor het geschikt is voor schermen met een hoog gehalte / hoge doorvoer. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala aan verbindingen, fluorescerende sondes en Mtb-mutanten. Voor elk hierboven beschreven protocol kunnen fixatie- en immunolabelingstappen worden uitgevoerd voorafgaand aan het verkrijgen van afbeeldi...

Onder de opkomende en opnieuw opkomende infectieuze pathogenen die de afgelopen jaren zijn gemeld, heeft Mycobacterium tuberculosis (Mtb) een prominente plaats in voor 1,4 miljoen sterfgevallen en 8,7 miljoen nieuwe infecties in 2011 (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Ondanks de beschikbaarheid van multidrug therapieën, het aantal geïnfecteerde mensen is nog steeds in opkomst en multidrug resistente (MDR) evenals uitgebreid drug resistente (XDR) Mtb zijn snel verspreid over de hele wereld1. Bovendien, wanneer rekening wordt gehouden met de aanwezigheid van Mtb-antigenen, is het duidelijk dat een derde van de wereldbevolking wordt beschouwd als latent geïnfecteerd door Mtb. Statistisch gezien is er in één van de tien gevallen evolutie naar de actieve vorm van de ziekte met daaropvolgende klinische symptomen2. Daarom zijn er dringend nieuwe middelen nodig om Mtb te bestrijden. In deze context ontwikkelden we een in vitro visuele fenotypische test gebaseerd op het monitoren van Mtb-invasie en -vermenigvuldiging in gastheercellen door geautomatiseerde confocale fluorescentiemicroscopie3. De aanpassing van de test in 384-well microtiterplaten in combinatie met geautomatiseerde beeldverwerving en -analyse maakte High-content/High-throughput Screening (HC/HTS) van middelgrote bibliotheken van verbindingen, siRNAs en bacteriële mutanten mogelijk. De screening van een genoombrede RNAi-bibliotheek op deze fenotypische test maakte het dus mogelijk om de belangrijkste gastheerfactoren te identificeren die betrokken zijn bij Mtb-handel en intracellulaire replicatie, maar ook de opheldering van gastheerroutes die door de tuberkel bacillus worden geëxploiteerd. Een andere aanpassing van deze specifieke fenotypische test was voor de identificatie van bacteriële factoren die essentieel zijn voor Mtb intra-phagosomale persistentie. De arrestatie van fagosome rijping wordt bijvoorbeeld beschouwd als een van de belangrijkste mechanismen die het overleven en repliceren van Mtb in macrofaag vergemakkelijkt. De monitoring van de subcellulaire lokalisatie van Mtb knock-out mutanten in fluorescerend gelabelde zure compartimenten maakte het mogelijk om bacteriële genen te identificeren die betrokken zijn bij het overlevingsproces4. Ten slotte biedt de hoog-inhoud beeldvorming van Mtb ook een uitstekende methode om de efficiëntie van geneesmiddelen te kwantificeren voor het remmen van verschillende verschijnselen zoals intracellulaire bacteriële groei3. Al met al maakt dit type fenotypische test met hoge doorvoer het mogelijk om de ontdekking van geneesmiddelen tegen tbc te versnellen en de gegevens die door deze verschillende benaderingen worden verzameld, dragen bij aan een beter begrip van de gastheermanipulatie die door Mtbwordt uitgeoefend .

<table><tbody><tr><td>&micro;clear-plate zwart, 384-well</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781091</td><td>127.8/86/15 MM met deksel, TC behandeld</td></tr><tr><td>CellCarrier 384-well plate</td><td>PerkinElmer</td><td>6007550</td><td>Zwart, Clear Bottom, met deksel, TC behandeld</td></tr><tr><td>V-bodem wit, 384-well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781280</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ademende, steriele dichtingstape</td><td>Corning</td><td>3345</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Life Technologies</td><td>13778150</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34943</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + GlutaMAX-I</td><td>Life Technologies</td><td>61870-010</td><td>Cellenkweekmedium</td></tr><tr><td>D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Saline Buffer</td></tr><tr><td>D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-091</td><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Saline Buffer</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Life Technologies</td><td>2610040-79</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ficoll Paque PLUS</td><td>Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>Ficoll voor zuivering van monocyten uit perifeer bloed</td></tr><tr><td>CD14 MicroBeads, humaan</td><td>Miltenyi</td><td>130-050-201</td><td>Zuivering van CD14+ Monocyten</td></tr><tr><td>Humaan M-CSF, premium gr. (1000 &mu;g)</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-493</td><td>Macrofaagkoloniestimulerend factor</td></tr><tr><td>LS Kolommen</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Kolommen voor isolatie van CD14+ Monocyten</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Euromedex</td><td>2002-A</td><td>Mycobacteriëncultuur</td></tr><tr><td>Glycerol hoge zuiverheid&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>50405-EX</td><td>Mycobacteriëncultuur</td></tr><tr><td>&nbsp;Middlebrook OADC verrijking</td><td>Becton-Dickinson</td><td>211886</td><td>Mycobacteriëncultuur</td></tr><tr><td>7H9</td><td>Becton-Dickinson</td><td>W1701P</td><td>Mycobacteriëncultuur</td></tr><tr><td>Versene 1x</td><td>Life Technologies</td><td>15040033</td><td>Nonenzymatische celdissociatieoplossing</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>Kernkleurstof</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Kernkleurstof</td></tr><tr><td>Syto60</td><td>Life Technologies</td><td>S11342</td><td>Kern/cytoplasma kleurstof</td></tr><tr><td>Formaline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5014</td><td>Celfixatieoplossing</td></tr><tr><td>siRNA targeting Dectin-1</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-63276</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>*siGenome* niet-doelgerichte siRNA pool&nbsp;</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rifampicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td>antibioticum</td></tr><tr><td>Isoniazide (INH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3377-50G</td><td>antibioticum</td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>Life Technologies</td><td>10687-010</td><td>antibioticum</td></tr><tr><td>Amikacine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1774</td><td>antibioticum</td></tr><tr><td>Geautomatiseerde confocale microscoop OPERA</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Beeldverwerving</td></tr><tr><td>Columbus 2.3.1 Server Database</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Gegevensoverdracht, opslag en analyse</td></tr><tr><td>Acapella 2.6 software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Beeldgebaseerde analyse</td></tr><tr><td>GraphPad Prism5 software</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Statistische analyse</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Statistische analyse</td></tr></tbody></table>

een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Ondanks de beschikbaarheid van therapie en vaccin blijft tuberculose (tbc) een van de meest dodelijke en wijdverspreide bacteriële infecties ter wereld. Sinds enkele decennia is de plotselinge uitbarsting van multi- en uitgebreid resistente stammen een ernstige bedreiging voor de bestrijding van tuberculose. Daarom is het essentieel om nieuwe doelen en paden te identificeren die van cruciaal belang zijn voor de veroorzaker van de tuberculose, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en om te zoeken naar nieuwe chemicaliën die tbc-medicijnen kunnen worden. Een aanpak is het opzetten van methoden die geschikt zijn voor de genetische en chemische schermen van grootschalige bibliotheken, waardoor het zoeken naar een naald in een hooiberg mogelijk is. Hiervoor ontwikkelden we een fenotypische test gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mtb in fluorescerend gelabelde hostcellen met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie. Deze in vitro test maakt een beeldgebaseerde kwantificering van het kolonisatieproces van Mtb in de host mogelijk en is geoptimaliseerd voor het 384-well microplate-formaat, dat geschikt is voor schermen van siRNA-, chemische verbindingen- of Mtb-mutantbibliotheken. De beelden worden vervolgens verwerkt voor multiparametrische analyse, die voorlezen geeft over de pathogenese van Mtb in gastheercellen.

SiRNA-screening met hoge doorvoer voor het hele genoom
Mtb is in staat om immuuncellen in vitro te koloniseren, evenals verschillende andere longepitheelcellen. Mtbis bijvoorbeeld in staat om A549-epitheelcellen te infecteren en te beschadigen die vaak worden gebruikt als model voor pneumocyten van het menselijke type II5-7. Dectine-1 werd gemeld als een gastheercelreceptor die betrokken is bij de opname van Mtb, pro-inflammatoire respons en antibact...

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Het algemene doel van deze procedure is om het effect van fenotype-modulatoren, zoals gastheergensilencing, of de impact van kleine moleculen op de intracellulaire replicatie van mycobacterium tuberculosis te meten. Dit wordt bereikt door eerst kleine moleculen in 384-wells platen te dispenseren of cellen te transfecteren met irna en transfectiecomplexen. De volgende stap is om de cellen te infecteren met mycobacterium tuberculosis die het groen fluorescent eiwit tot expressie brengt, of G-F-P-M-T-B, de cellen toe te voegen aan de wells die de kleine moleculen bevatten en de microplaat vijf dagen te incuberen.Voor de RNAi-benadering worden cellen toegevoegd aan wells die het RNAi-transfectiecomplex bevatten. Incubeer de microplaat gedurende drie dagen en infecteer de cellen vervolgens met G-F-P-M-T-B-expresserende mycobacterium tuberculosis. Na het kleuren van de cellen is de laatste stap het uitlezen van de platen met een geautomatiseerde confocale microscoop.Uiteindelijk wordt geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie gevolgd door beeldgebaseerde analyse gebruikt om de veranderingen in de intracellulaire groei van G-F-P-M-T-V te meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek

a-microscopic-phenotypic-assay-for-quantification-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an assay to evaluate the efficacy of drugs against Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection. An in vitro infection model containing Mtb/macrophage aggregates is generated that mimics in vivo infection. Upon introducing suitable antibiotics, their efficacy is tested via resuzarin assay to monitor the survival of bacteria with increasing drug concentrations.

An Assay to Evaluate Drug Efficacy against a Mycobacterium tuberculosis Infection Model

De kolen agar rezazurin assay (CARA) is een semi-kwantitatief, medium-doorvoer methode om de activiteit van testmiddelen te beoordelen tegen mycobacteriën die zich vermenigvuldigen, niet vermenigvuldigen of beide. De CARA maakt een snelle evaluatie mogelijk van tijd- en concentratie-afhankelijke activiteit en identificeert parameters om na te streven door kolonievormende eenheid (CFU) assays.

Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

We hebben een modulair high-throughput screening ontwikkeld voor het ontdekken van nieuwe verbindingen tegen Mycobacterium tuberculosis, intracellulaire targeting en-bouillon kweken bacteriën en cytotoxiciteit tegen de zoogdiergastheercel.

Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Nieuwe modellen en testen die het vroege proces van geneesmiddelontwikkeling voor de volgende generatie tuberculosebestrijdende middelen zouden verbeteren, zijn zeer wenselijk. Hier beschrijven we een snelle, goedkope en BSL-2-compatibele test om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen Mycobacterium tuberculosis te evalueren, die gemakkelijk kan worden aangepast voor screening met hoge doorvoer.

Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Snelle en efficiënte kwantificering van intracellulaire M. tuberculosis-groei is cruciaal voor het nastreven van verbeterde therapieën tegen tuberculose (TB). Dit protocol beschrijft een op bouillon gebaseerde colorimetrische detectietest met behulp van een geautomatiseerd vloeistofkweeksysteem om de Mtb-groei te kwantificeren in macrofagen die worden behandeld met kandidaat-gastheergerichte therapieën.

Een geautomatiseerd kweeksysteem voor gebruik bij preklinische tests van gastheergerichte therapieën voor tuberculose

Deze studie ontwikkelde een test voor high-throughput screening tegen Mycobacterium abscessus met een recent gecreëerde dubbele reporterstam, waarbij fluorescentie en luminescentie worden gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën snel te beoordelen. Dit protocol zal relevant zijn voor onderzoekers die nieuwe geneesmiddelen willen screenen op deze resistente bacterie.

Ontwikkeling van tests voor high-throughput medicijnscreening tegen mycobacteriën

We beschrijven een alternatieve benadering voor de opsomming van...

Een functioneel geheel Bloed Test van de levensvatbaarheid van Mycobacteriën Meet, met behulp van Reporter-Gene Tagged BCG of M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Een parasiet-rescue en transformatie test met geïnfecteerde cellen...

Een Parasiet Rescue and Transformation Assay voor antileishmania Screening tegen intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Human acute monocytische leukemiecellijn

Een nieuwe methode gerichte evolutie eigen aan de thermostabiliteit van techniek is ontwikkeld en dus gevalideerd voor bacteriolytische enzymen. Na een ronde van willekeurige mutagenese, een geëvolueerd bacteriolytische enzym PlyC 29C3, weergegeven groter is dan tweemaal de restactiviteit in vergelijking met het wild-type eiwit na incubatie verhoogde temperatuur.

Een nieuwe screeningsmethode voor de gerichte evolutie van thermostabiele Bacteriolytic Enzymen

Coxiella burnetii is een obligaat intracellulaire Gram-negatieve bacterie die verantwoordelijk is voor de zoönose Q-koorts. Hier beschrijven we werkwijzen voor het genereren van Coxiella fluorescent transposon mutanten en de geautomatiseerde identificatie en analyse van de verkregen internalisatie, replicatie en cytotoxische fenotypes.

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Leer een fenotypische test voor high-throughput screening van Mycobacterium tuberculosis met geautomatiseerde confocale microscopie. Deze methode kwantificeert intracellulaire bacteriële groei voor tuberculoseonderzoek.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud (Video) | JoVE Journal

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Meer video's verkennen