Productie van RNA voor transcriptomische analyse van muis ruggenmerg motor neuron cellichamen door laser capture microdissection
13 januari 2014
Hoogwaardige totale RNA is bereid uit cellichamen van muis ruggenmerg motorneuronen door laser capture microdissection na het kleuren van ruggenmerg secties met Azure B in 70% ethanol. Voldoende RNA (~40-60 ng) wordt teruggewonnen uit 3.000-4.000 motorneuronen om downstream RNA-analyse door RNA-seq en qRT-PCR mogelijk te maken.
Het algemene doel van deze procedure is om hoogwaardig RNA te herstellen van motorische neuronen in het ruggenmerg zonder besmetting door RNA van aangrenzende cellen. Dit wordt bereikt door eerst het ruggenmerg te herstellen, te verdelen en in te bedden in cryo-inbeddingsmedium en te bevriezen bij min 160 graden Celsius. De tweede stap is om het ruggenmerg op penmembraan slides te cryo-sneden bij min 20 graden Celsius.
Vervolgens worden de slides gewassen in 70% ethanol en gekleurd met Azure B in 70% ethanol. De laatste stap is laser capture micro dissectie van geïdentificeerde motorische neuron cellichamen in guin thiocyanaat lysis buffer. Uiteindelijk wordt totaal RNA bereid uit de gecombineerde lysaten en getest om verschillen in algemene of specifieke RNA transcriptie in neuronen van mutant versus wildtype dieren te ontdekken.
Laser capture microdissectie maakt het mogelijk om motorische neuron cellichamen uit ruggenmergsecties te herstellen zonder besmetting door de talrijkere Scalia en andere celtypen. Dit biedt een kans om RNA te bereiden en transcriptie te vergelijken tussen neuronen van een ziek dier en een normaal dier. Het moeilijkste aspect bij het ontwikkelen van deze procedure was om een kleurmethode te vinden die ons zou toelaten om motorische neuronen in ruggenmergsecties te detecteren terwijl hoge niveaus van RNA-integriteit en extracteerbaarheid behouden blijven, zowel voor als tijdens laser capture.
We ontdekten dat het kleuren van secties in Azure B en 70% ethanol aan deze criteria voldeed in combinatie met het verzamelen van de gedissekteerde cellichamen direct in Guin Thiocyanate lysis Buffer, waardoor de procedure ine Van Padia, een postdoc in ons lab Voor de beste resultaten. Zorg ervoor dat alle apparatuur wordt gereinigd met RNAs decontaminating oplossing gevolgd door RNAs vrije 70% ethanol na euthanasie en trans cardial perfusie Zorgvuldig isoleer het ruggenmerg. Spoel het koord 10 seconden in RNAs.
Vrij water om eventueel restbloed weg te spoelen en leg het heel voorzichtig maar snel op een RNAs vrije glazen slide. Deel vervolgens het ruggenmerg dwars met een schone scheermes in negen tot 10 stukken. Plaats de stukken in een cryo mal gevuld met OCT en lijn ze verticaal uit met een schone naald.
Plaats de mal in een ondiepe bak met twee methyl butaan voorgekoeld met vloeibare stikstof. Om RNA degradatie te voorkomen, plaats de bak in een vloeibare stikstof bad. Om de ruggenmerg stukken snel te bevriezen.
Bewaar de OCT ingebedde blok bij min 80 graden Celsius gedurende maximaal zes maanden voordat je gaat snijden. Wanneer je klaar bent voor snijden, plaats het OCT ingebedde blok in een gekoelde cryostat. Produceer 20 micron plakken die elk negen tot 10 ruggenmerg dwarssecties bevatten.
Plaats de secties op een RNAs vrije pen membraan. Twee micron slides aanvankelijk op kamertemperatuur gehouden om ervoor te zorgen dat de secties hechten. Hervries onmiddellijk de sectie op een oppervlak van min 20 graden Celsius binnen de cryostat.
Bewaar de slides bij min 80 graden Celsius tot gebruik op een schone rek. Zes 50 milliliter conische buizen gevuld met RNAs vrije 70% ethanol. De diepte moet voldoende zijn om alle secties op een slide te bedekken wanneer de slide wordt ondergedompeld.
Plaats vervolgens 1% Azure B oplossing op dezelfde rek. Om de tijd tussen het verwisselen van oplossingen tijdens wassen of kleuren te minimaliseren, houd drie of vier laboratoriumdoekjes voor de rek om extra oplossing snel af te voeren. Wanneer je klaar bent, haal de slides uit de min 80 graden Celsius vriezer en plaats ze op droog ijs om een slide te ontdooien door deze op een behandschoende handpalm te plaatsen.
Verwijder het meeste vocht en condensatie op de slide door deze af te vegen met een laboratoriumdoekje, zorg ervoor dat je de secties niet aanraakt. Leg de slide op vers silica gel droogmiddel in een petrischaaltje gedurende 30 tot 40 seconden om volledig te drogen. Wanneer het droog is, dompel de slide in de eerste buis van RNAs vrije 70% ethanol.
Laat de slide 30 seconden weken en was vervolgens de OCT weg door hem 45 seconden tot een minuut op en neer te bewegen. Neem vervolgens de slide uit de oplossing en laat het overtollige vocht op laboratoriumdoekjes weglopen. Herhaal dit proces door de slide in de tweede buis van 70% ethanol te dompelen.
Als er nog OCT rond de ruggenmergsecties aanwezig is, herhaal het wassen in de derde buis. Na het weglekken van het overtollige vocht, dompel de slide 30 tot 45 seconden in 1% Azure B oplossing in 70% RNAs vrije ethanol. Laat het overtollige Azure B op een laboratoriumdoekje weglopen.
Op dit punt zal de hele slide blauw zijn. Dompel de slide in de volgende buis van 70% ethanol en dompel snel op en neer, drie tot vier keer om overtollig kleurstof te verwijderen en de specifieke motorische neuron kleuring zichtbaar te maken. Als de secties er erg donker gekleurd uitzien, herhaal de ontkleuringsstap in een verse buis van 70% ethanol.
Als de kleuring te licht lijkt, plaats de slide terug in de Azure B oplossing voor nog eens 32nd en herhaal de ontkleuring. Als de kleuring bevredigend is, laat de slide kort luchtdrogen en ga verder met de volgende stap. Na DES kleuring en drogen, zal de grijze materie lichtblauw zijn en de diepblauw gekleurde motorische neuronen zullen gemakkelijk zichtbaar zijn.
Begin direct met de dissectie nadat je de microscoop hebt ingeschakeld. Laad de buishouder uit om de dop van een 0,6 millimeter micro fuge buis te bevestigen. Voor monsterverzameling, doe 30 microliters van guin en thiocyanaat lysis buffer in de dop en bedek het oppervlak door de oplossing te verspreiden.
Met een pipettip, lijn de dop uit met het gat en het objectief. Met de microscoop software draag, houd de dop in de bedekkingspositie totdat je begint met laser capture. Plaats de luchtdrooge slide ondersteboven op het podium van de microscoop zodat de membraanzijde naar beneden gericht is en de sectie is uitgelijnd met het gat.
<Overzicht
Deze studie beschrijft een methode voor het herstellen van hoogwaardig RNA uit motorneuronen van de muizenruggenmerg met behulp van laser capture microdissectie. Het proces zorgt voor minimale besmetting van naburige cellen, waardoor nauwkeurige RNA-analyse mogelijk is.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Moleculair biologie
- Genexpressieanalyse
Achtergrond
- Motorneuronen zijn cruciaal voor het begrijpen van neurodegeneratieve ziekten.
- Extractie van hoogwaardig RNA is essentieel voor nauwkeurige genexpressiestudies.
- Besmetting van omringende cellen kan resultaten vertekenen.
- Laser capture microdissectie biedt een oplossing om specifieke celtypen te isoleren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het isoleren van RNA uit motorneuronen.
- Om RNA-transcriptie te vergelijken tussen mutante en wild-type dieren.
- Om RNA-integriteit tijdens extractie en analyse te behouden.
Gebruikte methoden
- Ruggenmergsecties werden ingebed in cryo-inbeddingsmedium en bevroren.
- Secties werden gekleurd met Azure B en gewassen in ethanol.
- Laser capture microdissectie werd uitgevoerd om motorneuronen te isoleren.
- Totaal RNA werd bereid uit de lysaten voor downstream-analyse.
Belangrijkste resultaten
- Hoogwaardig RNA (~40-60 ng) werd succesvol geëxtraheerd uit 3.000-4.000 motorneuronen.
- De methode minimaliseerde besmetting van andere celtypen.
- RNA-integriteit werd behouden gedurende de hele procedure.
- Downstream-analyses zoals RNA-seq en qRT-PCR kunnen worden uitgevoerd.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is effectief voor het isoleren van RNA uit specifieke neuronpopulaties.
- Het maakt vergelijkende studies mogelijk tussen zieke en normale neuronen.
- Deze techniek kan ons begrip van de biologie van motorneuronen bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolating high-integrity RNA from rare cell populations like motor neurons enables precise target validation in neurodegenerative disease models. This approach reduces biological noise and improves predictive confidence when comparing mutant versus wild-type transcriptional profiles. It supports early de-risking of therapeutic hypotheses by linking genotype to cell-type-specific gene expression changes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in disease-relevant motor neurons without confounding signals from glial or neighboring cells.
- Operational Value: Provides a reproducible method to isolate <10% of spinal cord cell population for target engagement studies.
- Predictive Value: Supports biomarker discovery and mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to cell-type-specific RNA expression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates qualified RNA inputs for downstream assays like qRT-PCR and RNA-seq with minimal cross-cell contamination.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through Azure B staining in 70% ethanol and direct lysis in guanidine thiocyanate buffer.
- Assay Readiness: Enables scalable profiling of motor neuron transcriptomes across genetic models or treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational continuity by allowing direct comparison of RNA profiles between diseased and normal motor neurons.
- Operational Value: Maintains RNA integrity from sectioning through lysis, enabling reliable detection of transcriptional differences.
- Risk Mitigation: Reduces false positives in target validation by isolating the cellular source of signal.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing purified molecular readouts from disease-relevant neurons.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation by isolating motor neuron-specific transcriptional responses.
- Screening: Produces assay-ready RNA with quantified integrity for consistent compound screening in neuronal models.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (e.g., RNA yield, RIN values) that enable statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validity through direct comparison of mutant and wild-type neuron transcriptomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable workflow for isolating rare neuronal populations across multiple CNS targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing mechanistic ambiguity from cellular heterogeneity.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized staining, laser capture, and lysis parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing cleaner, more interpretable transcriptional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on cell-type-specific expression changes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, laser capture microdissection, and RNA handling to prevent degradation.
- Dependent on cryostat, UV laser microdissection system, and RNase-free reagents for consistent performance.
- Necessitates cross-team standardization of staining timing and ethanol wash steps to ensure motor neuron visibility.
- Must account for tissue-specific adaptation when applying to other neuronal subtypes or disease models.
- Limited by RNA yield scaling; best suited for pooled samples from multiple sections or animals.
