Productie van RNA voor transcriptomische analyse van muis ruggenmerg motor neuron cellichamen door laser capture microdissection

Het algemene doel van deze procedure is het winnen van RNA van hoge kwaliteit uit motorneuronen van het ruggenmerg, zonder contaminatie door RNA van naburige cellen. Dit wordt bereikt door het merg eerst te isoleren, te verdelen en in te bedden in een cryo-inbeddingsmedium, gevolgd door invriezen bij -160 °C. De tweede stap bestaat uit het maken van cryosneden van het merg op pen-membraanplaatjes bij -20 °C.

Vervolgens worden de coupes gewassen in 70% ethanol en gekleurd met Azure B in 70% ethanol. De laatste stap is laser capture microdissectie van de geïdentificeerde cellichamen van motorneuronen in guanidine-thiocyanaat lysisbuffer. Uiteindelijk wordt totaal RNA geprepareerd uit de gecombineerde lysaten en getest om verschillen in algemene of specifieke RNA-transcriptie in neuronen van mutante versus wild-type dieren te ontsluiten.

Laser capture microdissectie maakt het mogelijk om motorneuron-cellichamen uit dwarsdoorsneden van het ruggenmerg terug te winnen zonder contaminatie door de talrijkere glia- en andere celtypen. Dit biedt de mogelijkheid om RNA voor te bereiden en de transcriptie te vergelijken tussen neuronen van een ziek dier en een gezond dier. Het meest lastige aspect bij de ontwikkeling van deze procedure was het vinden van een kleuringsmethode waarmee motorneuronen in ruggenmergsecties konden worden gedetecteerd, terwijl een hoge mate van RNA-integriteit en extraheerbaarheid behouden bleef, zowel vóór als tijdens de laser capture.

We stelden vast dat het kleuren van coupes in Azure B en 70% ethanol aan deze criteria voldeed wanneer dit werd gecombineerd met het direct verzamelen van de gedissecteerde cellichamen in Guine Thiocyanaat lysebuffer, wat aantoont dat de procedure effectief is. Van Padia, een postdoc in ons laboratorium, adviseert het volgende voor de beste resultaten. Zorg ervoor dat alle apparatuur is gereinigd met een RNA-decontaminatie-oplossing, gevolgd door RNA-vrije 70% ethanol na euthanasie en transcardiale perfusie. Isoleer het ruggenmerg zorgvuldig. Spoel het merg 10 seconden in RNA-vrije.

Spoel met vrij water om eventueel resterend bloed te verwijderen en plaats het weefsel zeer voorzichtig maar snel op een RNAse-vrij glazen objectglas. Verdeel vervolgens het ruggenmerg transversaal met een schoon scheermesje in negen tot 10 stukjes. Plaats de stukjes in een cryovorm gevuld met OCT en richt ze verticaal uit met behulp van een schone naald.

Plaats de mal in een ondiepe schaal met twee methylbutaan die is voorgekoeld met vloeibare stikstof. Om RNA-degradatie te voorkomen, wordt de schaal in een bad van vloeibare stikstof geplaatst om de stukjes ruggenmerg snel te laten invriezen.

Bewaar het in OCT ingebedde blok bij -80 °C tot zes maanden voor het maken van coupes. Wanneer de coupes gemaakt moeten worden, plaatst u het in OCT ingebedde blok in een gekoelde cryostaat. Maak coupes van 20 µm, waarbij elke coupe negen tot 10 dwarsneden van het ruggenmerg bevat.

Plaats de coupes op een RNAse-vrij membraan. De objectglazen van twee micron worden aanvankelijk op kamertemperatuur gehouden om ervoor te zorgen dat de coupes hechten. Bevries de coupe vervolgens onmiddellijk opnieuw op een oppervlak van -20 °C in de cryostaat.

Bewaar de coupes bij -80 °C op een schoon rek tot gebruik. Vul zes conische buizen van 50 mL met RNAse-vrije 70% ethanol. De vloeistofdiepte moet voldoende zijn om alle secties op een objectglas te bedekken wanneer het objectglas wordt ondergedompeld.

Plaats vervolgens een 1% Azure B-oplossing in hetzelfde rek. Om de tijd tussen het wisselen van oplossingen tijdens het wassen of kleuren te minimaliseren, houdt u drie of vier laboratoriumdoekjes voor het rek om overtollige oplossing snel af te voeren. Haal de objectglazen uit de vriezer van -80 °C wanneer u klaar bent en plaats ze op droogijs; ontdooi één objectglas door het op een handschoen-bedekte handpalm te plaatsen.

Verwijder het grootste deel van het vocht en de condensatie op het objectglas door dit af te vegen met een laboratoriumdoekje, waarbij u er zorgvuldig op let dat u de coupes niet aanraakt. Plaats het objectglas gedurende 30 tot 40 seconden op verse silicagel-droogmiddel in een Petrischaal om het volledig te laten drogen. Wanneer het droog is, dompelt u het objectglas in de eerste buis met RNase-vrije 70%ethanol.

Laat het objectglas 30 seconden weken en was vervolgens het OCT weg door het objectglas 45 seconden tot één minuut op en neer te bewegen. Haal daarna het objectglas uit de oplossing en laat het overtollige vloeistof weglopen op laboratoriumdoekjes. Herhaal dit proces door het objectglas in de tweede buis met 70% ethanol te dopen.

Als er nog OCT rond de dwarsneden van het ruggenmerg aanwezig is, herhaal dan het wassen in de derde buis. Laat het overtollige vloeistof weglopen en dompel de objectglas 30 tot 45 seconden onder in een 1% Azure B-oplossing in 70% RNAse-vrije ethanol. Laat het overtollige Azure B weglopen op een laboratoriumdoekje.

Op dit punt zal de hele slide blauw zijn. Dompel de slide in de volgende buis met 70%ethanol en beweeg deze snel drie tot vier keer op en neer om overtollige kleurstof te verwijderen en de specifieke kleuring van de motorneuronen zichtbaar te maken. Als de coupes zeer donker gekleurd lijken, herhaal dan de destaining-stap in een nieuwe buis met 70%ethanol.

Als de kleuring te licht lijkt, breng de slide dan nogmaals voor 32 seconden terug in de Azure B-oplossing en herhaal de DES-kleuring. Als de kleuring naar tevredenheid is, laat de slide dan kort aan de lucht drogen en ga door naar de volgende stap. Na de DES-kleuring en het drogen zal de grijze stof lichtblauw zijn en zullen de donkerblauw gekleurde motorneuronen gemakkelijk zichtbaar zijn.

Begin de dissectie onmiddellijk nadat de microscoop is ingeschakeld. Maak de buishouder leeg om de dop van een 0,6 millimeter microfugebuisje te bevestigen. Voor de monstername worden 30 µL guanidine-thiocyanaatlysebuffer in de dop gedaan en wordt het oppervlak bedekt door de oplossing te verspreiden.

Lijn de dop met een pipetpunt uit met het gat en het objectief. Houd de dop met de microscopesoftware in de gesloten positie tot het laser-captureproces wordt gestart. Plaats de aan de lucht gedroogdepreparaat ondersteboven op de tafel van de microscoop, zodanig dat de membraanzijde naar beneden is gericht en het snede is uitgelijnd met het gat.

Zet de objectglasplaat in positie, stel scherp op een dwarsdoorsnede van het ruggenmerg met het 5 x objectief en schakel vervolgens over naar het 20 x objectief voor dissectie. Markeer eerst een controlegebied met de lichtpen en laat de laser dit uitsnijden zonder het te verzamelen. Dit ontspant het membraan, waardoor het mogelijk wordt om opeenvolgend meerdere regio's te markeren en uit te snijden.

Herfocus vervolgens en identificeer de motorneuronen in de regio van het ventrale hoorn. Deze neuronen zijn herkenbaar aan hun locatie, hun morfologie, hun grote omvang en de donkerblauwe kleuring met Azure B. Selecteer met de lichtpen het tekeninstrument en markeer de rand van de motorneuronen door een volledige omtrek te trekken. Probeer de omtrek zo dicht mogelijk bij het motorneuron te houden om contaminatie door andere cellen te voorkomen.

Meerdere cellen kunnen worden gemarkeerd voordat het snijden begint, aangezien de software de posities onthoudt. Wanneer u klaar bent om te snijden, plaatst u de dop onder de snijpositie en klikt u op de startknop om de dissectie van de motorneuronen met de laser te starten. Verzamel alle motorneuronen uit alle secties op één objectglas in de dop van één microcentrifugebuisje. Nadat de verzameling is voltooid, haalt u het microcentrifugebuisje uit de houder door de lade te lossen en het buisje voorzichtig te verwijderen; anmeten de motorneuronen en buffer volledig op te lossen door de oplossing herhaaldelijk met een pipet op te zuigen en weer uit te stoten.

Breng de oplossing door middel van centrifugatie naar de bodem van de buis, vries het monster onmiddellijk in droogijs in en bewaar het bij -80 °C na kleuring met Azure B. De motorneuronen verschijnen als grote, donkergekleurde cellichamen. Deze worden bevestigd door kleuring met anti-CHATT-antilichamen en zijn gemakkelijk te onderscheiden van kleinere naburige cellen. In dit voorbeeld zijn de cellichamen van de motorneuronen met de lichtpen omlijnd en door de software genummerd.

Hier zijn de cellichamen met de laser uitgesneden en in de opvangbuis gedeponeerd terwijl de contounen waren uitgeschakeld. De omvang van de laserschade aan aangrenzende regio's is duidelijk zichtbaar. Hier worden typische resultaten getoond van een elektroforetische analyse van de RNA-integriteit van een monster van ongeveer 4.000 cellichamen van muismotorneuronen die via LMD zijn verzameld.

Let op de prominente ribosomaal RNA-pieken. Dit proces, van de kleuring van het preparaat tot de dissectie van de motorneuronen, moet binnen 30 minuten worden voltooid voor alle coupes op één objectglas om RNA-degradatie te minimaliseren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden zo snel mogelijk te werken, zowel bij de initiële dissectie en inbedding van het ruggenmerg als bij de laatste stappen van de kleuring en laser capture microdissectie van de motorneuronen.