Name: Na in Real Time de impact van Pneumokokken virulentiefactoren in een acute longontsteking Muis Model Met behulp van Bioluminescent Bacteriën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Leer hoe je in real time Streptococcus pneumoniae-infecties volgt in een muismodel voor pneumonie en sepsis met behulp van bioluminescente bacteriën. Deze methode maakt continue monitoring van infectieprogressie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek in het laboratorium werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) en het ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) Medische Infectie Genomics (FKZ 0315828A) naar SH.

Het dier infectie experimenten hier beschreven moeten worden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de lokale en internationale (bijv. European Health Law van de Federatie van Laboratory Animal Science Associations (FELASA)) richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren. De experimenten hebben door de lokale ethische raad en Institutional Animal Care Comite worden goedgekeurd. Alle experimenten met S. pneumoniae in het laboratorium of het dier infecties worden uitgevoerd in een klasse II bioveiligheid kabinet. 1. Voorbereiding van de Infectious Stock van Bioluminescent Pneumocococi <ol><li> Bereid voorraadoplossingen pneumococcen culturen in Todd-Hewitt bouillon aangevuld met 1% (w / v) gistextract en een uiteindelijke concentratie van 20% glycerol een onderhoud bij 80 ° C. </li><li> Plaat een kleine hoeveelheid diepgevroren stock pneumococcen cultuur op bloed agar plaat en incubeer de bacteriën gedurende 10 uur bij 37 ° C in 5% CO2. Thij bloedagarplaat bevat de juiste antibiotica zoals kanamycine (150 ug / ml) voor de transposon insertie van de luxABCDE gen cassette in het genoom. </li><li> Sub-cultiveren een verse kolonie op een nieuw bloed agar plaat voor een maximum van 10 uur. </li><li> Inoculeer THY medium aangevuld met 10% (v / v) hitte-geïnactiveerd (30 min bij 56 ° C) foetaal runderserum (FBS) met pneumokokken en start de kweek bij een OD 600 van 0,05-0,07. </li><li> Incubeer pneumococcen zonder schudden bij 37 ° C en 5% CO2 totdat de cultuur een OD 600 van 0,35-0,40 bereikt. Groei duurt tussen 3-4 uur. </li><li> Oogst pneumococcen door centrifugeren bij 3750 xg gedurende 10 min en resuspendeer bioluminescente pneumokokken in met fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,4 (PBS) aangevuld met 0,5% FBS. </li><li> Stel entmateriaal tot de gewenste concentratie in PBS/10% FBS. De infectie dosis is afhankelijk van de pneumococcen stam en de genetische achtergrond van de microfoone. Om outbred CD-1 muizen intranasaal besmet met S. pneumoniae D39 lux de infectie dosis moet worden aangepast tot 1 x 10 7 CFU in een suspensie van 20 pi aangevuld met 90 eenheden hyaluronidase. Niet schudden of vortex pneumokokken, omdat dit autolyse zal leiden. </li><li> Controleer de inoculumconcentratie door platen 10 voudige seriële verdunningen op bloed-agar en telling van de kolonies na groei gedurende de nacht bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Controleer de bioluminescentie van de pneumococcen inoculum door het meten van de bioluminescentie behulp van een optisch afbeeldingssysteem. </li></ol> 2. Intranasale en Intraperitoneale Infectie van Muizen met Bioluminescent Pneumokokken <ol><li> Gebruik vrouwelijke outbred muizen in de leeftijd van 7-10 weken voor de acute longontsteking en sepsis model. Het gewicht van deze muizen moet tussen 20-30 g. </li><li> Verdoven muizen door intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine. Maak een mengsel van 1,0 mgketamine en 0,1 mg xylazine in 100 pl steriele 0,9% (w / v) natriumchloride voor muizen met een lichaamsgewicht van 20 g. Dit komt overeen met een dosis van 50 mg / kg lichaamsgewicht voor ketamine en 5 mg / kg lichaamsgewicht xylazine. Om nauwkeurig te zijn, wegen muizen voor de injectie van de verdovingsmiddelen. </li><li> Injecteer het mengsel in de intraperitoneale holte en plaats de dieren terug in de kooi totdat de verdoving handelen en de dieren verdoofd. Ademhaling van muizen zal zeer langzaam en regelmatig te worden. Muizen volledig verdoofd zijn, zodat de intranasale inoculatie en inhalatie van de bacteriesuspensie niet zal leiden tot niezen en dus verlies van inoculum. Dit kan worden beoordeeld door te knijpen met de muis naar het einde van hun staart, een volledig verdoofd muis zal responsiviteit ontbreken. </li><li> Voorzichtig halen een verdoofd muis en houd de muisknop tussen de vingers en duim met de neus rechtop (Figuur 1). </li><li> Gebruik een pipet met lange smalle tips (Gel LoaderTips) en drop bioluminiscente pneumokokken in meerdere kleine druppeltjes op de neusgaten (10 ul / neusgat) van de muis 26-29. De muis zal onwillekeurig inhaleer de bacteriën. Houd de muis 1-2 min rechtop en kijk of de muis niest of houdt het inoculum. </li><li> Infect 7-10 weken oude CD-1 muizen intranasaal een infectie dosis van 1 x 10 7 of 7,5 x 10 7 pneumokokken van stam D39 en TIGR4 respectievelijk de besmetting in real time. De grens voor het detectiesysteem zonder absorptie door het gastheerweefsel ongeveer 1 x 10 6 bioluminescente bacteriën. </li><li> Infecteren muizen intraperitoneaal (IP) te beoordelen en te BioImage virulentie van pneumokokken in een sepsis muis infectie model. Gebruik 5 x 10 3 CFU in 100 pl van stam D39 en 1 x 10 4 van stam TIGR4. Muizen worden niet verdoofd bij gebruik van de IP-route. </li><li> Inoculeren controle muizen met PBS. <img alt="Figuur 1" fo:content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figuur 1. Intranasale infectie van CD-1 muizen met S. pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . </li></ol> 3. Visualiseren Pneumococcal Verspreiding in de Lung and Blood Met behulp van de Imaging System Afbeelding verspreiding van pneumococcen na intranasale infectie van vrouwelijke outbred CD1 muizen in real-time toepassing van een in vivo systeem. <ol><li> Schakel het beeldvormingssysteem en start de beeldanalyse software op de set vooringestelde computer. </li><li> Het weergavesysteem initialiseert automatisch de CCD camera thermo gekoeld tot 90 ° C alvorens actief. </li><li> De instellingen en binning afhankelijk van het aantal muizen gemetengelijktijdig en op grond van de bioluminescente signaal. Het gezichtsveld (FOV) de bioluminescentie van de dieren te controleren is variabel en de vergroting varieert tussen een FOV van 22,5 cm tot vijf muizen te meten, en een FOV van 3,9 cm tot een muis of delen van het dier, zoals de borst te meten of het hoofd. </li><li> Routinematig gebruik van een belichtingstijd van 1 min, een gemiddelde graad van binning, en een FOV van 22,5 cm (set D). Selecteer eerst de lichtgevende imaging-modus en vervolgens de beeldvorming parameters. </li><li> De emissie van het signaal afhankelijk van de bacteriestam en de muis stam, en het pigment van de muis. Scheer de borst van muizen bij gebruik bijvoorbeeld C57BL / 6 muizen, die voordelig kan zijn wanneer beeldvorming van de ontwikkeling van pneumonie bij deze muizen. </li><li> Afbeelding geïnfecteerde muizen op prechosen tijdsintervallen. Meet de bioluminescentie van muizen in de acute longontsteking model op tijdsintervallen van maximaal 8-12 uur. Monitor ook het welzijn van de geïnfecteerde muizen door observing hun uiterlijk, gedrag, en de bepaling van het verlies van gewicht. </li><li> Verdoven muizen in de verdovende kamer van de anesthesie-systeem van de beeldvormende apparatuur voor de metingen in de kamer. Begin inhalatie van een mengsel van isofluraan en zuurstof en wacht tot de muizen langzaam en regelmatig te ademen. </li><li> Plaats verdoofde dieren in de beeldvorming kamer van het systeem en houden muizen in rugligging. De CCD camera op de bovenzijde van de kamer zal dan het beeld murine luchtwegen. </li><li> Plaats de dieren met hun neus in buizen om inademing van de verdovingsmiddelen toe te staan. </li><li> Isofluraan binnenkomst in de beeldvorming kamer via een gas slang is toegestaan ​​om anesthesie te handhaven. </li><li> De CCD-camera op de top van de kamer te activeren en bioluminescentie optische beeldvorming, druk op &quot;Acquire&quot; starten in de imaging software. Onmiddellijk een foto van de muizen in de gesloten ruimte op het scherm. Na een minuut<html> meting een overlay van de bioluminescentie gegevens en de foto wordt weergegeven. </li><li> Stop verdoving na het beeld overlay verschijnt in het venster van de software en zet de muizen terug in hun kooien. </li><li> Muizen worden gecontroleerd voor herstel. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2.jpg" width="500px" /> Figuur 2. Anesthesie en monitoring van muizen geïnfecteerd met bioluminescentie pneumokokken met behulp van de IVIS anesthesie en IVIS Spectrum systeem, respectievelijk. A) De IVIS Spectrum imaging systeem. B) De IVIS anesthesie systeem met de incubatiekamer. C) Muizen verdoofd in de incubatiekamer . D) Muizen gelegen binnen de IVIS Spectrum beeldvorming kamer met hun neus inademen van de verdoving._blank &quot;&gt; Klik hier voor grotere afbeelding. </li></ol> 4. Kwantificering en evaluatie van de bioluminescentie van muizen geïnfecteerd met Bioluminescent S. pneumoniae <ol><li> Bepaal de bioluminescentie intensiteiten van de muizen of van een geselecteerd deel van de muizen door het kwantificeren van de totale foton emissie (fotonen / seconde) met behulp van beeldanalyse software. </li><li> Gebruik de waarden van de foton emissie die voorkomen in een Excel data fiche naar een grafiek bereiden. Aangezien de gegevens variatie vaak hoog in de gegroepeerde muizen, genereren een doos whisker grafiek om de verschillen in muizen geïnfecteerd met de verschillende pneumococcen stammen geven. </li><li> Bieden de fotonen per muizen of als alternatief de resultaten als het gemiddelde van straling (fotonen / sec / cm 2 / sr) van een geselecteerd gebied. </li><li> Meetgegevens van ROI (-regio of-interest) in foton modus kan kwantitatief worden vergeleken over verschillende in vivo imaging systemen met verschillende kwamra instellingen, sinds de metingen in eenheden van straling automatisch rekening met de camera-instellingen (bv. integratie tijd, binning, f / stop, en het gezichtsveld). </li></ol>

<ol><li>Niederman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+management+of+adults+with+community-acquired+pneumonia.+Diagnosis%2C+assessment+of+severity%2C+antimicrobial+therapy%2C+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).</li>
<li>WHO, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+disease%3A+2004+update%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">The global burden of disease: 2004 update.</a> World Health Organization. , (2008).</li>
<li>Bogaert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonisation+by+Streptococcus+pneumoniae+and+Staphylococcus+aureus+in+healthy+children%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children.</a> Lancet. 363, 1871-1872 (2004).</li>
<li>Gamez, G., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combat+pneumococcal+infections%3A+adhesins+as+candidates+for+protein-based+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development.</a> Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).</li>
<li>Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+pathophysiology+of+pneumococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).</li>
<li>Musher, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+contagious+are+common+respiratory+tract+infections%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">How contagious are common respiratory tract infections.</a> N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).</li>
<li>Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+escape+recombinants+emerge+after+pneumococcal+vaccination+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States.</a> PLoS Pathog. 3, (2007).</li>
<li>Munoz-Almagro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+invasive+pneumococcal+disease+caused+by+nonvaccine+serotypes+in+the+era+of+7-valent+conjugate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine.</a> Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).</li>
<li>Whitney, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+conjugate+pneumococcal+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Infect.+Dis.+J%22%5BJournal%5D)">Impact of conjugate pneumococcal vaccines.</a> Pediatr. Infect. Dis. J. 24, 729-730 (2005).</li>
<li>Whitney, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decline+in+invasive+pneumococcal+disease+after+the+introduction+of+protein-polysaccharide+conjugate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine.</a> N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).</li>
<li>Lynch, J. P. 3rd, Zhanel, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae%3A+epidemiology+and+risk+factors%2C+evolution+of+antimicrobial+resistance%2C+and+impact+of+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pulm.+Med%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines.</a> Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).</li>
<li>Singleton, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+pneumococcal+disease+caused+by+nonvaccine+serotypes+among+Alaska+native+children+with+high+levels+of+7-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage.</a> JAMA. 297, 1784-1792 (2007).</li>
<li>Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+pneumonia%3A+mechanisms+of+infection+and+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution.</a> Chest. 142, 482-491 (2012).</li>
<li>Lieberman, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+bacterial+evolution+within+multiple+patients+identifies+candidate+pathogenicity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes.</a> Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).</li>
<li>Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+bacterial+virulence+by+AraC-like+regulators+that+respond+to+chemical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals.</a> Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).</li>
<li>Young, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+dynamics+of+Staphylococcus+aureus+during+progression+from+carriage+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).</li>
<li>Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors+in+host+respiratory+colonization+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).</li>
<li>Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pneumococcal+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules+on+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization.</a> Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).</li>
<li>Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Streptococcus+pneumoniae+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system.</a> Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).</li>
<li>Paterson, G. K., Mitchell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+the+pneumococcus%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and the pneumococcus.</a> Microbiology. 152, 285-293 (2006).</li>
<li>Gerber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+Streptococcus+pneumoniae+meningitis+mimicking+several+features+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease.</a> Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).</li>
<li>Gingles, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+genetic+resistance+in+invasive+pneumococcal+infection%3A+identification+and+study+of+susceptibility+and+resistance+in+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains.</a> Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).</li>
<li>Holmes, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pavA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+encodes+a+fibronectin-binding+protein+that+is+essential+for+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence.</a> Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).</li>
<li>Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+understandings+on+the+pathophysiology+of+bacterial+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).</li>
<li>Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Murine model of pneumococcal pneumonia.</a> Methods Mol. Biol. 602, 405-410 (2010).</li>
<li>Hartel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+glutamine+transporters+on+pneumococcal+fitness+under+infection-related+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions.</a> Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).</li>
<li>Hermans, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+streptococcal+lipoprotein+rotamase+A+%28SlrA%29+is+a+functional+peptidyl-prolyl+isomerase+involved+in+pneumococcal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization.</a> J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).</li>
<li>Jensch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PavB+is+a+surface-exposed+adhesin+of+Streptococcus+pneumoniae+contributing+to+nasopharyngeal+colonization+and+airways+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections.</a> Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).</li>
<li>Kadioglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+protein+PavA+is+important+for+nasopharyngeal+carriage+and+development+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis.</a> Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).</li>
<li>Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+contributions+of+pneumococcal+virulence+factors+to+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis.</a> J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).</li>
<li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).</li>
<li>Basavanna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+methionine+acquisition+and+synthesis+on+Streptococcus+pneumoniae+growth+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Hartel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+central+carbon+metabolism+of+Streptococcus+pneumoniae+by+isotopologue+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling.</a> J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).</li>
<li>Hammerschmidt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+immune+regulator+factor+H+interacts+via+two+contact+sites+with+the+PspC+protein+of+Streptococcus+pneumoniae+and+mediates+adhesion+to+host+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells.</a> J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).</li>
<li>Voss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choline-binding+protein+PspC+of+Streptococcus+pneumoniae+interacts+with+the+C-terminal+heparin-binding+domain+of+vitronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin.</a> J. Biol. Chem. , (2013).</li>
<li>Cartwright, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+disease+in+western+Europe%3A+burden+of+disease%2C+antibiotic+resistance+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management.</a> Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).</li>
<li>vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+pneumococcal+isolates+from+pets+and+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Brehm,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+the+adenine+methylase+gene+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+pAM+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1.</a> Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

<html> Alle experimenten bij dieren hebben door de lokale overheden en ethische commissies worden goedgekeurd. In in vivo infectie experimenten de bacteriële verontreiniging in de verschillende gastheer niches van besmette dieren moet worden bepaald op verschillende tijdstippen na infectie. Onder deze experimentele omstandigheden de dieren worden opgeofferd voor de isolatie van de bacteriën uit het bloed, nasopharynx, bronchoalvelar lavage of organen zoals de longen, milt en hersenen. Om het aantal bacteriën per...

Luchtweginfecties veroorzaakt door virussen of bacteriën blijven een van de meest voorkomende gemeenschap verworven of klinische problemen veroorzaakt wereldwijd ongeveer een derde van alle overlijden wereldwijd. De belangrijkste bacteriële soorten Haemophilus influenzae en Streptococcus pneumoniae 2. Echter, deze bacteriesoorten gewoonlijk voorkomende bestanddelen van de natuurlijke luchtwegen flora. Aldus bacteriële wagen ook zeker risico voor invasieve ziekten en afhankelijk van de immuunstatus of predisposities van de individuen. De asymptomatische kolonisatie wordt geactiveerd om invasieve infecties. Streptococcus pneumoniae is de toonaangevende pathogeen van community-acquired pneumonie (CAP) en een van de meest voorkomende oorzaken van bacteriëmie bij de mens. Bij gezonde individuen S. pneumoniae (pneumokokken) zijn vaak asymptomatisch en onschadelijk kolonisatoren van de bovenste luchtwegen, wanneer zij worden geconfronteerd met niet-pathogene bacteriënvan de bewoner flora maar ook met ziekteverwekkers zoals Haemophilus spp. of Staphylococcus aureus en de eerste regel van het menselijke immuunsysteem afweersysteem. Vervoer tarieven zijn het hoogst bij jonge kinderen (37%) en zelfs hoger in overvolle opvangcentra (58%) 3-5. De jongste bevolking en ouderen, het ontvangen van de pneumokok via aërosol-transmissie van vervoerders en nasopharyngeal afscheidingen 6, behoren tot de risicogroepen en vaccinatie met behulp van een van de pneumokokken conjugaat vaccins (PCV10 of PCV13 bij kinderen en 23-valent polysaccharide PPSV23 bij volwassenen) wordt aanbevolen in de Verenigde Staten (VS) en vele Europese landen 4. De PPSV23 dekt serotypen verantwoordelijk voor ~ 90% van de bacteremic pneumokokken ziekten in de VS en Europa, het voorkomen zo effectief invasieve pneumokokken ziekten (IPD) bij volwassenen, terwijl de PCVs betrekking op de meest voorkomende serotypen bij kinderen. Bijgevolg IPD vanwege types vaccin (VT) zijn ReduCED maar nonvaccine serotypen weergeven van een hoge virulentie en antibioticumresistentie ontstaan ​​4,7-12. De nasopharynx als het reservoir is het startpunt voor pneumokokken te verspreiden naar de sinussen of middelste oren initiëren van schadelijke lokale infecties. Belangrijker, pneumokokken rechtstreeks verspreid via de luchtwegen naar de bronchiën en longen resulteert in levensbedreigende CAP 4,13. Longinfecties gaan vaak gepaard met weefsel en barrière vernietiging, waardoor het pathogeen te verspreiden in het bloed en veroorzaakt IPD. Incidentie van GLB en IPD zijn het hoogst in immuungecompromitteerde personen of bij de uitersten van leeftijd 4,13. De omstandigheden die verantwoordelijk is voor de omzetting van een commensaal een ziekteverwekker met een hoge virulentie zijn nog in discussie. Echter, naast veranderingen in de ontvangende gevoeligheid en evolutionaire aanpassing gepaard met hogere virulentie en de toename antibioticaresistenties zijn zouden een belangrijke invloed hebben op pneumococcal infecties 14-16. De ziekteverwekker is begiftigd met een veelheid van adhesines bemiddelen intiem contact te epitheelcellen mucosale. Na het overwinnen van de luchtwegen slijm, wordt pneumokokken aanhankelijkheid aan gastheercellen gefaciliteerd via directe interactie van het oppervlak blootgestelde adhesines met cellulaire receptoren en door de exploitatie van extracellulaire matrix componenten of serum-eiwitten als overbrugging moleculen 4,17,18. Zo veelzijdig ziekteverwekkers pneumokokken zijn ook uitgerust met factoren betrokken bij ontduiking van gastheer immune afweermechanismen. Bovendien hebben zij het ​​vermogen tot aanpassing aan verschillende ontvangende milieus zoals de longen, bloed en cerebrospinale vloeistof (CSF), respectievelijk 5,17,19,20. De impact van bacteriële factoren op de pathogenese en inflammatoire gastheer responsen wordt onderzocht in experimentele diermodellen van longontsteking, bacteriëmie of meningitis 21-25. Ondanks dat het een menselijk pathogeen, deze modellen zijn wijll-opgericht om pneumokokken weefseltropisme, virulentie mechanismen, of protectivity van pneumokokkenvaccin kandidaten ontcijferen. De genetische achtergrond van inteelt muizenstammen bepaalt de gevoeligheid voor pneumokokken. BALB / c muizen intranasaal geïnfecteerd met pneumococcen bleken resistent te zijn, terwijl CBA / Ca en SJL muizen gevoeliger tegen pneumokokkeninfecties 22. Dit betekent dat, gelijkaardig aan mensen, de genetische achtergrond en de gastheer afweermechanismen bepalend voor de uitkomst van de infectie. Vandaar dat verdere inspanningen nodig zijn om de weerstand loci ontrafelen in het genoom van de muizen minder gevoelig voor pneumokokkeninfecties. De bevindingen leidden tot veranderingen in virulentie in vivo protocollen. In plaats van de ingeteelde BALB / c muizen vaak gebruikt in het verleden, zijn de zeer gevoelige CD-1/MF1 outbred muizenstammen tegenwoordig vaak gebruikt om het effect van het verlies-van-functie pneumococcen virulentie factoren of geschiktheid 26-28 bestuderen. Bovendien beschikbaarheidvan bioluminescente pneumokokken en optische beeldvormingstechnieken kan de real-time bioluminescentie bioimaging infecties. In pneumococcen de geoptimaliseerde luxABCDE gencassette (plasmide Paul-A Tn 4001 luxABCDE Kmr) ingevoegd in een integratieplaats van het chromosoom door transposon mutagenese. Bioluminescentie pneumococcen zijn gebruikt om de demping van pneumococcen mutanten tekort aan virulentie of geschiktheid factoren en de translocatie ve anatomische plaats naar de andere 26,28-31 beoordelen. Hier bieden wij een protocol voor de bioimaging van pneumokokkeninfecties in een muizen-pneumonie of sepsis model. Amplificatie en verspreiding van bioluminescente pneumokokken in intranasaal of intraperitoneaal geïnfecteerde muizen kunnen eenvoudig worden gevolgd in de tijd met behulp van een optisch afbeeldingssysteem en hetzelfde dier op verschillende tijdstippen.

<table><tbody><tr><td>Todd Hewitt bouillon</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland</td><td>X936.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland</td><td>2363.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bloedagarplaten</td><td>Oxoid, Wesel, Duitsland</td><td>PB5039A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland</td><td>T832.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Erytromycine</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland</td><td>E6376</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum (FRS)</td><td>PAA Laboratories, Coelbe, Duitsland</td><td>A11-151</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CD-1 muizen, vrouwelijk</td><td>Charles River, Sulzfeld, Duitsland</td><td>CD1SIFE06W08W</td><td>vrouwelijke CD-1 muizen, zes tot acht weken oud</td></tr><tr><td>Ketamin 500 mg, Curamed injectieoplossing</td><td>Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Duitsland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rompun 2%, injectieoplossing</td><td>Bayer Animal Health, Monheim, Duitsland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BD Plastipak 1 ml spuiten</td><td>Becton Dickinson, Heidelberg, Duitsland</td><td>300015</td><td>steriele Luer-Lok spuiten met naald</td></tr><tr><td>Gel Loader Tips</td><td>PeqLab</td><td>81-13790</td><td>M&micro;ltiFlex Tips</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884-100mg</td><td>Hyaluronidase Type IV-S van rundertest</td></tr><tr><td>Zuurstof</td><td>Air Liquide, D&uuml;sseldorf, Duitsland</td><td>M1001L50R2A001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Baxter, Unterschlei&szlig;heim, Duitsland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pGEM-T Easy</td><td>Promega, Mannheim, Duitsland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligonucleotiden&nbsp;</td><td>Eurofins MWG, Ebersberg, Duitsland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Qiaprep Spin Midiprep Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Duitsland</td><td>27104</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR DNA zuiveringskit</td><td>Qiagen, Hilden, Duitsland</td><td>28106</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Living Image 4.1 software</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Duitsland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>XGI-8 Gas Anesthesiesysteem</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Duitsland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum Beeldvormingssysteem&nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Duitsland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Biofotometer</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

na in real time de impact van pneumokokken virulentiefactoren in een acute longontsteking muis model met behulp van bioluminescent bacteriën

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Longontsteking is een van de grootste problemen in de gezondheidszorg in ontwikkelingslanden en geïndustrialiseerde landen en wordt geassocieerd met een aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit. Ondanks de vooruitgang in kennis van deze ziekte, de beschikbaarheid van intensive care units (ICU), en het gebruik van krachtige antimicrobiële middelen en effectieve vaccins, de sterftecijfers hoog blijven 1. Streptococcus pneumoniae is de toonaangevende pathogeen van community-acquired pneumonie (CAP) en een van de meest voorkomende oorzaken van bacteriëmie bij mensen. Dit organisme is uitgerust met een arsenaal van oppervlakte blootgestelde adhesinen en virulentie factoren longontsteking en invasieve pneumokokken (IPD). De evaluatie van de in vivo rol van bacteriële fitness of virulentie factoren is van het grootste belang te ontrafelen S. pneumoniae pathogeniteit mechanismen. Murine modellen pneumonie, bacteriëmie en meningitis worden gebruikt om het effect van pneumokokken factoren verschil bepalenlende stadia van de infectie. Hier beschrijven we een protocol om in real-time pneumokokken verspreiding in muizen na intranasale of intraperitoneale infecties met bioluminescentie bacteriën. De resultaten tonen de replicatie en verspreiding van pneumokokken in de onderste luchtwegen en bloed, die kunnen worden gevisualiseerd en geëvalueerd middels een afbeeldingssysteem en de bijbehorende analyse software.

De overname en de opname van methionine is van centraal belang voor pneumokokken tot fitness in hun gastland niche 32,33 handhaven. De methionine ABC transporter lipoproteïne is gecodeerd in D39 door de spd _ 0151 gen (TIGR4: sp_0149) en noemde MetQ 32. Pneumokokken verder produceren methionine biosynthese enzymen (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, MetE en metF). Het ontbreken van methionine in een chemisch gedefinieerd medium bevordert de groei van pneum...

Streptococcus pneumoniae is de toonaangevende ziekteverwekker waardoor ernstige community-acquired pneumonie en verantwoordelijk voor meer dan 2 miljoen doden wereldwijd. De invloed van bacteriële factoren betrokken bij fitness of virulentie kan worden gevolgd in real-time in een acute muis longontsteking of bacteriëmie model met behulp van bioluminescentie bacteriën.

Na in Real Time de impact van Pneumokokken virulentiefactoren in een acute longontsteking Muis Model Met behulp van Bioluminescent Bacteriën

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Het algemene doel van deze procedure is om in real-time een infectie met Streptococcus pneumoniae te volgen in een model voor pneumonie of sepsis bij muizen. Dit wordt bereikt door een infectiedosis Streptococcus pneumoniae voor te bereiden na cultivatie in het complexe medium THY. De tweede stap is de intranasale of intraperitoneale infectie van muizen met Streptococcus pneumoniae.De laatste stap is de kwantificering van de bioluminescentie-intensiteiten van de muizen, of van een geselecteerd gebied van de muizen, om de totale fotonemissie te bepalen. Uiteindelijk tonen de bioluminescentie-intensiteiten van een groep muizen de veranderingen in de infectie over een bepaalde periode. Daarnaast wordt een analyse van individuele beelden van bioluminescente muizen uitgevoerd.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het bepalen van de bacteriële load in de longen of in verschillende weefsels, is dat u het verloop van de infectie kunt volgen met slechts één dier. De implicaties van deze techniek reiken tot in het fundamenteel onderzoek, omdat deze techniek ook kan worden toegepast om de effectiviteit van bacteriële factoren en anti-infectiva te evalueren. Deze methode kan inzicht bieden in deze groep promo Cox bij muizen.Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals de bepaling van de bacteriële belasting in de organen. Over het algemeen zullen onderzoekers deze methode gemakkelijk kunnen leren, omdat het gebruik van het bio-imaging systeem eenvoudig is en er software beschikbaar is voor de bewerking van de beelden. Ik had direct het idee om deze methode toe te passen in infectie-experimenten met bios en primo oxide toen ik met het bio-imaging systeem werd geïntroduceerd.Een demonstratie van deze methode is cruciaal vanwege de vereiste speciale behandeling van de dieren, en aangezien kritieke stappen zoals de inoculatie moeilijk uit te leggen zijn. Begin met het voorbereiden van een voorraad infectieuze bioluminescente pneumokokken zoals beschreven in het tekstprotocol. Inoculeer vervolgens een buis met 40 milliliter FBS-gesupplementeerd THY-medium met de pneumokokken en start een cultuur bij een OD 600 van 0,08. Incubeer de pneumokokken zonder agitatie bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende drie tot vier uur totdat de cultuur een OD 600 van 0,35 tot 0,40 bereikt.Oogst vervolgens de pneumokokken door centrifugatie bij 3.750 ×g gedurende zes minuten. Verwijder daarna het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet. Pas het inoculum in ongeveer één milliliter PBS bij pH 7,4, aangevuld met 0,5% FBS, aan naar de gewenste concentratie in een suspensie van 20 µL PBS met 10% FBS en 90 units hyaluronidase.Schud of vortex de pneumokokken niet, aangezien dit autolyse zal triggeren. Gebruik vervolgens een optisch beeldvormingssysteem om de bioluminescentie van de pneumokokken te verifiëren. Anestheseer een zeven tot 10 weken oude vrouwelijke outbred muis door intraperitonele injectie van ketamine en xylazine. Controleer of de diepte van de anesthesie correct is door in de staart te knijpen.Zodra de muis volledig is geanestheseerd, houdt u de muis tussen de vingers en de duim met de neus omhoog. Druppel vervolgens met een pipet met een lange, smalle tip 10 µL van de bioluminescente pneumokokken in elk neusgat. De muis inhaleert de bacteriën onvrijwillig.Houd de muis gedurende één tot twee minuten rechtop om te observeren of de muis niest of het inoculum vasthoudt. Voltooid. De inhalatie van de infectiedosis moet worden gewaarborgd, zodat de muis de geselecteerde infectiedosis inademt. Daarom moet de muis langzaam en regelmatig ademen.Zorg ervoor dat de muis niet niest, zodat er geen delen van de infectiedosis verloren gaan. Markeer na een succesvolle inoculatie de staart voor latere identificatie en plaats de muis in een nieuwe kooi.Injecteer vervolgens, om de virulentie in een sepsis-infectiemodel te beoordelen, 100 µL van een pneumokokkenstam intraperitoneaal in een geanestheseerde muis. Plaats de muis na het markeren van de staart terug in een kooi als controles. Injecteer een andere groep muizen met PBS.De verspreiding van de pneumokokken wordt bepaald via software voor beeldanalyse. Stel eerst de beeldmodus in op luminescent en stel vervolgens de beeldparameters als volgt in. Stel de belichtingstijd in op één minuut.Een gemiddelde graad van binning en een FOV van 22,5 centimeter. Anestheseer de muizen in de anesthesiekamer van de beeldvormingsapparatuur met een mengsel van isofluraan en zuurstof. Wanneer de muizen langzaam ademen, worden ze in rugligging in de beeldvormingskamer geplaatst, waarbij hun neuzen in buisjes worden gestoken die zijn aangesloten op het anesthesiesysteem.Om de CCD-camera bovenop de kamer te activeren en bioluminescente optische beeldvorming te starten, druk onmiddellijk op 'acquire' in de software voor beeldvorming. Een foto van de muizen in de gesloten kamer verschijnt op het scherm. Na één minuut meting wordt een overlay van de bioluminescentiegegevens en de foto getoond.Stop nu de anesthesie ongeveer 20 seconden voor het einde van de blootstelling. Plaats de muizen terug in hun kooi en laat ze volledig herstellen van de anesthesie voordat de kooi terug in het rek wordt geplaatst. Blijf de geïnfecteerde muizen elke acht tot 10 uur beelden, naast het monitoren van hun uiterlijk, gedrag en gewicht.Gebruik tenslotte de software voor beeldanalyse om de bioluminescentie-intensiteiten per tijdstip en muisgroep te bepalen door de totale fotonenemissie te kwantificeren. De bioluminescente optische beeldvorming van muizen die intranasaal zijn geïnfecteerd met D 39 lux of de isogene mutant D 39 luxe delta MET Q wordt hier getoond. De beeldvorming begon 24 uur na infectie en werd elke acht uur voortgezet tot de dood of tot 120 uur na infectie in elke groep. Zeven van de 10 muizen ontwikkelden ernstige ziekteverschijnselen en stierven, terwijl de andere drie muizen geen bioluminescentie vertoonden en overleefden.Let op dat de bioluminescentie in twee van de muizen in feite spill-over is van de intense bioluminescentie in de naburige muizen. Muizen die succesvol waren geïnfecteerd met de bioluminescente wildtype D 39 lux ontwikkelden 32 uur na infectie een ernstige longinfectie, die binnen acht tot 16 uur overging in sepsis. Alle muizen die na infectie met D 39 lux pneumonie en sepsis ontwikkelden, waren tegen 96 uur na infectie overleden.Het verlies van functie van het methionine-bindende lipoproteïne verminderde de virulentie van de pneumokokken aanzienlijk. Na 32 uur vertoonde slechts één muis die was geïnfecteerd met de mEq-mutant een zwakke longinfectie, in vergelijking met infecties in alle vatbare D 39 lux-muizen. Echter, na 48 uur werden ernstige longinfecties zichtbaar bij de muizen die met de mutant waren geïnfecteerd.Als gevolg hiervan ontwikkelden deze muizen 72 uur na infectie sepsis en werden ze later dan 72 uur na infectie talrijker, wat aantoont dat in het acute pneumonie-infectiemodel de deficiëntie van met Q de pneumokokken remt. De waarden van de bioluminescentie-intensiteiten van de gegroepeerde muizen worden weergegeven voor de aangegeven tijdspunten. De kwantificering van de bioluminescente flux vertoonde significante verschillen tussen geïnfecteerde wild-type muizen en met q-geïnfecteerde muizen 32 en 40 uur na de infectie.Zo vermindert het verlies van functie van met q de virulentie van pneumokokken en resulteert dit in een significante vertraging van de invasieve infectie, maar leidt dit niet tot een virulente lint-bacterie zodra deze is beheerst. Deze techniek kan, mits correct uitgevoerd, worden gebruikt om 10 groepen van vier muizen binnen één uur te monitoren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om er zeker van te zijn dat de lum volledig is en door de muizen is geïnhaleerd. Na deze procedure kunnen ook andere methoden, zoals co-infectie in muizen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over lichte attenuatie en bacteriële mutanten na de ontwikkeling ervan.Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de infectiebiologie om pneumokokkenpneumonie of sepsis bij muizen te onderzoeken en te visualiseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u muizen infecteert en een pneumokokkeninfectie in realtime volgt met behulp van een bio-imagingsysteem. Vergeet niet dat het werken met menselijke pathogene bacteriën zoals pneumokokken gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het werken onder een veiligheidskast klasse II, moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

following-real-time-impact-pneumococcal-virulence-factors-an-acute

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een gelijktijdige infectie met influenza A-virus is een van de factoren betrokken bij de inductie van invasieve pneumokokkeninfecties bij...

Met behulp van Bioluminescent Imaging naar Synergie Onderzoek Between Streptococcus pneumoniae En influenza A-virus bij jonge muizen

Methoden voor bioluminescentie beeldvorming van bacteriële infecties bij levende dieren beschreven. Ziekteverwekkers worden aangepast om luciferase te drukken waardoor optisch het gehele lichaam van infecties in levende dieren. Diermodellen kunnen besmet zijn met luciferase uitdrukken pathogenen en de daaruit voortvloeiende beloop van de ziekte gevisualiseerd in real-time door bioluminescentie imaging.

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Source: Valentine, M. E., et al. Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of bioluminescence to visualize and compare the in vivo behavior of virulent and attenuated bacterial strains in mice. It outlines the preparation of bioluminescent bacterial suspensions and their intraperitoneal injection into mice. The virulent strain exhibits...

Tracking Bacterial Infection Dynamics in a Mouse Using Bioluminescence

Source: de Vries, C. R., et al., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates a bioluminescent imaging technique to monitor bacterial infection progression in a live mouse model. Pathogenic bacteria engineered with the luxABCDE reporter system emit light at the infection site, allowing visualization of metabolically active bacteria. By imaging the mouse over time, researchers can non-invasively track infection...

Bioluminescence Imaging of Bacterial Infections in Mice

Source: Valentine, M. E., et al., Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of a bioluminescence-based imaging approach to monitor bacterial infection in a live mouse model. Sequential bioluminescent and X-ray imaging enables real-time visualization and anatomical localization of infection spread throughout the host.

Real-Time Imaging of Bacterial Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor het modelleren van bacteriële pneumonie bij muizen. Hierin beschrijven we een niet-invasieve, goedkope, snelle werkwijze voor het induceren via aspiratie pneumonie (bijvoorbeeld inhalatie) van een bacterieel inoculum gepipetteerd in de orofarynx. Downstream methoden voor de beoordeling van de pulmonaire aangeboren immuunrespons zijn ook gedetailleerd.

Een niet-invasieve en Technisch Niet-intensieve methode voor Inductie en fenotypering van experimentele bacteriële longontsteking in Muizen

Een methode voor het veroorzaken van longinfecties bij immuungeschikt knaagdieren wordt beschreven. Met vaardigheid kan deze methode snel en eenvoudig worden uitgevoerd om een stabiele infectie te induceren met veel isolaten van S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae en A. baumannii.

Een robuuste Longontsteking Model in Immunocompetente Knaagdieren om Antibacteriële Werkzaamheid Evalueer tegen<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; of<em&gt; A. baumannii</em

De hier beschreven werkwijze maakt het mogelijk om visualisatie van IL-8 promotorafhankelijke ontstekingsactivering in de longen van muizen door middel van niet-invasieve bioluminescentie beeldvorming (BLI). Het zelfde dier kan meerdere keren tot BLI worden onderworpen tot maximaal twee maanden vanaf de tijd van afgifte van het luciferase reporterconstruct.

Een IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model voor de<em&gt; In Vivo</em&gt; Lange termijn monitoring van inflammatoire reacties

Hier beschrijven we een eenvoudig en reproduceerbaar Protocol van muismodel van infectie om de verzwakking van de genetisch gemodificeerde stammen van Pseudomonas aeruginosa te evalueren in vergelijking met de Amerikaanse Food and Drug ADMINISTRATION (FDA)-goedgekeurde Escherichia coli voor commerciële toepassingen.

Generatie van in-frame Gendeletie mutanten in Pseudomonas aeruginosa en testen op virulentie demping in een eenvoudig muis model van infectie

Infectie van neonatale muizen met bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulteert in een septische infectie met significante longontsteking en longpathologie. Hier beschrijven we procedures om neonatale sepsis te modelleren en verder te bestuderen met behulp van longitudinale intravitale beeldvorming parallel met de opsomsoming van systemische bacteriële lasten, ontstekingsprofilering en longsentopathologie.

Een neonatale beeldvorming model van gram-negatieve bacteriële sepsis

Dit artikel beschrijft een nieuw muismodel voor de overgang van pneumokokken van een asymptomatische kolonisator naar een ziekteverwekkende ziekteverwekker tijdens virale infectie. Dit model kan gemakkelijk worden aangepast om polymicrobiële en gastheer-pathogeen interacties te bestuderen tijdens de verschillende fasen van ziekteprogressie en tussen verschillende gastheren.

Een muismodel voor de overgang van Streptococcus pneumoniae van kolonisator naar pathogeen bij virale co-infectie vat leeftijdsverergerde ziekte samen

Leer hoe je in real time Streptococcus pneumoniae-infecties volgt in een muismodel voor pneumonie en sepsis met behulp van bioluminescente bacteriën. Deze methode maakt continue monitoring van infectieprogressie mogelijk.

Na in Real Time de impact van Pneumokokken virulentiefactoren in een acute longontsteking Muis Model Met behulp van Bioluminescent Bacteriën (Video) | JoVE Journal

Na in Real Time de impact van Pneumokokken virulentiefactoren in een acute longontsteking Muis Model Met behulp van Bioluminescent Bacteriën

Meer video's verkennen