Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

Het algemene doel van deze procedure is om subpopulaties van multipotente precursorcellen afgeleid van menselijke bloedvaten te isoleren en te zuiveren uit een enkele skeletspierbiopsie. Eerst wordt de spierbiopsie gedissocieerd en gedigesteerd met een combinatie van collagenase type een, twee en vier. Vervolgens wordt de cellsuspensie gelabeld met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen die een combinatie van geselecteerde celoppervlaktemarkers herkennen. Daarna wordt fluorescentie-geactiveerde celsortering uitgevoerd via flowcytometrie.

Bekijk en breid de gesorteerde cel-subtypen uit in specifieke kweekcondities bij optimale dichtheden. Uiteindelijk wordt de analyse na sortering van gezuiverde cellen, evenals daaropvolgende flowcytometrie- en RT-PCR-analyse van gekweekte cel-subsets, gebruikt om de zuiverheid van deze homogene BVSE-subsets aan te tonen. Deze methode kan antwoord geven op de vraag wat de oorsprong is van deze mesenchymale stamcellen van kamelen.

Aangezien veel onderzoekers verschillende typen stamcellen in diverse weefsels hebben aangetroffen, denk ik dat dit inzicht kan bieden in de oorsprong van deze stamcellen, evenals in de rol die perivasculaire cellen en andere uit bloedvaten afgeleide cellen spelen bij weefselregeneratie en -herstel. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, net als bij de spierbiopsie.

Dissociatiestappen kunnen moeilijk te leren zijn. Technische details en de optimalisatie van de collagenasedigestie zijn zeer kritisch voor de opbrengst en de zuivering van de doelcellen. Transporteer het menselijke skeletspierbiopt op ijs.

In DM M aangevuld met 5% FBS en 1% penicilline-streptomycine onder steriele omstandigheden. Was het monster tweemaal met PBS met 2% antibiotica-antischimmelmiddel en vervolgens in DMS, aangevuld met 2% aa. Verwijder het aanhechtende vet- en bindweefsel.

Verwijder daarnaast de grote bloedvaten onder een dissectiemicroscoop. Snijd het spierpreparaat vervolgens in kleine stukjes. Breng de monsters over naar 20 milliliters bewaarmedium voor opslag bij vier graden Celsius voor maximaal vijf dagen.

Op de dag van de celisolatie. Verwijder de stukjes spierweefsel en was deze tweemaal in PBS met 2% pen strip. Voeg nu, om de digestiesolution te maken, 100 mg/mL van elk collagenase type 1, type 2 en type 4 toe aan pm.

Hak ten slotte de stukjes spierweefsel fijn en maal deze mechanisch met een kleine hoeveelheid pm. Laat de oplossing door een serologische pipet van 10 milliliter lopen en controleer hierbij op de afwezigheid van stolsels. Verwijder tijdens dit proces het resterende vet- en bindweefsel.

Overbreng vervolgens de helft van de volwassen monster tot 20 milliliters of het gehele foetale monster tot 10 milliliters van de digestie-oplossing. Digereer een monster gedurende 50 tot 60 minuten bij 37 degrees Celsius op een orbitale schudmachine bij 70 tot 80 RPM. Controleer de status van de digestie elke 15 tot 20 minuten.

Optimaliseer de celopbrengst en het behoud van oppervlakteantigenen door de digestietijd en/of agitatiesnelheid dienovereenkomstig aan te passen op basis van de hoeveelheid weefsel; wanneer de troebeling bijna is verdwenen, moet het gedigesteerde weefsel krachtig drie tot vijf keer gepipetteerd worden. Voeg een gelijke hoeveelheid PM toe om de reactie te stoppen en centrifugeer vervolgens bij 400 Gs gedurende vier minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant om het pellet te wassen en resuspendeer in 10 milliliters PM. Filtreer door een cellzeef van 100 micron, centrifugeer bij 400 Gs gedurende vier minuten en verwijder voorzichtig het supernatant.

Resuspendeer vervolgens de pellets in erytrocyt-lysebuffer en filter deze door een celzeef van 70 micron om een enkelcel-suspensie te verkrijgen. Na 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur wordt de suspensie gefilterd door een celzeef van 70 micrometer. Indien er neerslag wordt waargenomen, worden de cellen door centrifugatie geresuspendeerd.

Suspendeer in 0,5 milliliters PBS en tel het aantal cellen voor de kleuring. Verdun de single-cell-suspensie met een PBS-aliquot tot minder dan 5 miljoen cellen per milliliter; breng 50 tot 100 microliters van de celsuspensie over en verdeel dit over 11 buisjes voor de ongeverfde controle, de negatieve controles en de enkelkleurige positieve controles. Indien nodig kan de single-cell-suspensie 10 minuten bij vier graden Celsius worden geblokkeerd in serum van muis.

Voeg de antilichaamoplossingen toe volgens het experimentele ontwerp en incubeer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Pelleteer de cellen door centrifugatie en was elk monsterpellet één keer in verdunde PM bij een uiteindelijke concentratie van 5 miljoen cellen per milliliter voor uitsluiting van dode cellen bij een verdunning van 1:100 van seven a a d en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voor de negatieve controle en de enkelkleurige positieve controles. Resuspendeer de celpellets in 0,5 milliliter verdunde pm.

Overbreng alle cel-suspensies naar ronde bodem polystyreen flowcytometrie-buisjes. Bereid nu celopvangbuisjes voor met 500 µL van het geschikte coer-medium. Transporteer de cel-suspensies op ijs naar de cel.

Voer de sortering van de cel-suspensies uit op de cel-sorter in de volgorde van de ongekleurde controle, negatieve controles, enkelkleurige positieve controles en de hoofdcel-suspensie, terwijl de laserintensiteit, kanaalcompensatie en gating van de celpopulatie strikt worden aangepast om de celzuiverheid te maximaliseren. Verzamel de gewenste celpopulaties in de juiste opvangbuisjes. Bewaar de verzamelde cellen bij vier graden Celsius.

Indien er niet onmiddellijk wordt gezaaid: zaai vers gesorteerde myogene endotheelcellen in MPM op platen die vooraf waren gecoat met Type one collagen voor de daaropvolgende verpakking van ECS seed.

Zaai 3.500 tot 4.000 cellen per vierkante centimeter in MPM op platen of flessen die vooraf zijn gecoat met type one collagen. Zaai vers gesorteerde parasieten in egm two op platen die vers zijn gecoat met 0,2% gelatine voor de eerste en tweede passage. Splits de cellen in een verhouding van 1:3 in PC-medium op reguliere polystyreen-kweekplaten.

Platen vanaf passage drie. Zaai de cellen in PC-medium op reguliere polystyreen kweekplaten met een dichtheid van 6.500 tot 7.000 cellen per vierkante centimeter. Voor kolven: zaai de vers gesorteerde advent-weefselcellen in AC-medium op reguliere polystyreen kweekplaten voor het daaropvolgende uitplaten van ACS-zaadcellen bij 6.000 tot 7.000 cellen per vierkante centimeter in AC-medium op reguliere polystyreen kweekplaten.

De parameters van de kolven worden eerst gecorrigeerd op basis van de gegevens verkregen uit de ongekleurde controle, negatieve controles en enkelkleurige positieve controles; na uitsluiting van dode cellen wordt de fluorescentiegelabelde cel-suspensie onderworpen aan een reeks negatieve en positieve selecties van celoppervlaktemarkers. Eerst worden CD 45-positieve cellen weggefilterd. Vervolgens worden CD 56-positieve en CD 56-negatieve cellen gescheiden van de CD 45-negatieve fractie.

De CD 56-positieve fractie wordt vervolgens onderworpen aan CD 34- en CD 1 44-selectie, waarbij alleen dubbelpositieve cellen als myogene endotheelcellen worden aangemerkt en vervolgens worden verzameld. Op dezelfde wijze wordt de CD 56-negatieve fractie verder onderworpen aan CD 34- en CD 1 46-selectie, waarbij alleen CD 34-negatieve CD 1 46-positieve cellen als parasieten worden aangemerkt en vervolgens worden verzameld; de CD 34-positieve CD 1 46-negatieve fractie wordt onderworpen aan een aanvullende negatieve CD 31-selectie om endotheelcellen uit te sluiten, waarbij alleen de CD 34-positieve CD 31-negatieve subset als adv-cellen wordt aangemerkt voor verzameling. Hier kan CD 1 44 worden gebruikt als vervanging voor CD 31 voor de uitsluiting van EC.

Deze H-P-V-S-C-subsets werden gezuiverd uit spierbiopten van een enkele donor. In tegenstelling tot de typische heterogene spierstamcellen, blijven culturen van subsets van menselijke bloedvat-afgeleide stamcellen homogeen, zelfs na langdurige expansie. Zoals u weet, vind ik het zeer belangrijk dat onderzoekers dezelfde techniek gebruiken om die bloedvat-afgeleide stamcellen te isoleren die wij in onze laboratoria hebben beschreven.

Wij geloven daarom dat deze techniek, in een zij-aan-zijvergelijking, mensen in staat zal stellen om onze resultaten te reproduceren en de resultaten van het ene team echt te vergelijken met die van het andere. Vergeet niet dat het werken met vers menselijk weefsel uiterst gevaarlijk kan zijn. Tijdens het uitvoeren van deze procedure moeten voorzorgsmaatregelen worden getroffen, zoals het dragen van nitrielhandschoenen en oogbescherming.