FIBS-enabled Noninvasive metabole

Het algemene doel van deze procedure is om het niveau van intracellulaire glucose of glutamine niet-invasief te monitoren met behulp van genetisch gecodeerde eiwitgebaseerde biosensoren. Dit wordt bereikt door eerst de cellen van belang te transfecteren met het plasmide dat het biosensorgen bevat en vervolgens die cellen te selecteren die de biosensor tot expressie brengen. In de tweede stap worden cellencultuurmonsters genomen uit batch- of gevoede batchculturen en worden hun fret-verhoudingen gemeten.

De intracellulaire glucose- of glutamineconcentratie van de monsters kan vervolgens worden bepaald door een onafhankelijke test. Uiteindelijk kan de fret-verhouding van de monsters worden gebruikt om de intracellulaire concentratie van glucose of glutamine niet-invasief en in realtime te berekenen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de verbetering van bioprocessen omdat dit een betrouwbare methode is voor het verkrijgen van realtime metabole informatie die kan worden gebruikt voor online optimalisatie en controle.

Hoewel de methode kan worden gebruikt om inzicht te geven in bioprocessing, kan deze ook worden gebruikt in andere systemen, inclusief het detecteren van ziektemarkers. Begin met het herleven van CHO-cellen in negen milliliter volwaardig groeimedium. Draai vervolgens de cellen naar beneden, suspendeer de pellet in 10 milliliter vers groeimedium en tel de cellen door tripe in blauwe kleurstofuitsluiting.

Start vervolgens een cultuur met een zaaidichtheid van drie keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in 125 milliliter. Schokflessen bij 37 graden Celsius en 5%CO2 op een orbitale schudplatform. Met een rotatie van 125 RPM, subcultuur de cellen elke drie tot vier dagen in het volledige groeimedium met een zitdichtheid van twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter voor celtransfectie.

Bewaar de cellen gedurende 12 tot 24 uur bij 37 graden Celsius en 5%CO2 voorafgaand aan de transfectie om ervoor te zorgen dat de cellen actief delen. Tel na het bereiden van het plasmide-DNA de cellen door tripe en blauwe kleurstofuitsluiting en verdun de cellen tot een werkvolume van 20 milliliter cellencultuurmedium. In een 125 milliliter schudfles bij een concentratie van een keer 10 tot de zesde cellen per milliliter.

Gebruik een geschikt transfectiekit voor de gebruikte cellijn, inclusief ten minste één negatieve controleput met cellen, maar geen DNA. Incubeer de getransfecteerde cellen gedurende vier dagen in statische modus. Voeg nu het juiste antibioticum toe voor plasmideselectie tot een geschikte concentratie zoals bepaald door een killcurve.

Bijvoorbeeld, in deze studie, werd zin toegevoegd tot een eindconcentratie van 400 gram per milliliter voor selectie van de getransfecteerde cellen en vervolgens de culturen overgebracht naar een schudplatform dat met 125 RPM draaide. Ververs het medium op een geschikt tijdsinterval voor de cellijn, voeg elke keer antibioticum toe totdat de cellen in de controlepuit dood zijn. Gebruik de meest confluente putten om door te gaan naar de schudculturen.

Bevriest vervolgens de cellen in cryogeens vatjes met een keer 10 tot de zevende levensvatbare cellen in één milliliter vriesmix om batch- en gevoede batchgroeicurven te genereren. Eerst, stel triplicaatcellencultuur van de getransfecteerde CHO-cellen in 250 milliliter schudflessen met een werkvolume van 50 milliliter. Plaats vervolgens de culturen in een bevochtigde cellenincubator met schudbeweging en verwijder 4,1 milliliter monsters van elke groeiende cultuur op 24-uursintervallen. Voor de gevoede batchculturen, suppleer de cellen met de juiste hoeveelheid glucose of glutamine op dag zes om hun concentraties te herstellen naar hun oorspronkelijke waarden.

Voer de controleculturen met hetzelfde volume zuiver water, gebruik 100 microliters van de dagelijkse monsters van 4,2 daags om de cellen te tellen door tripe en blauwe kleurstofuitsluiting tot de levensvatbare celconcentratie tot nul is verminderd. Om de fret-verhoudingen te bepalen, centrifugeert u twee milliliter van de dagelijkse monsters en suspendeert u de pellet in twee milliliter ijskoud PBS, breng de helft van de celsuspensie over in een zes-putplaat en voeg een blanco monster toe dat geen cellen bevat aan één put. Meet vervolgens onmiddellijk de niveaus van blauwe en gele fluorescentie bij een excitatiegolflengte van 430 met een bandbreedte van 35 nanometer en een missiegolflengte van 465 met een bandbreedte van 35 nanometer en 520 met een bandbreedte van 10 nanometer voor de blauwe en gele fluorescentie respectievelijk.

Bereken de fret-verhoudingen door de verhouding van de gedetecteerde gele fluorescentie te bepalen ten opzichte van die van de blauwe fluorescentie. Draai vervolgens de laatste twee milliliter van de dagelijkse monsters naar beneden en was de pellet twee keer in ijskoud PBS na de tweede wasbeurt. Soniceer het monster vijf keer gedurende drie minuten elke keer bij een puls van 15 seconden aan en 15 seconden uit.

Ten slotte, voer de metabolietentests uit volgens de instructies van de fabrikant en gebruik de resulterende standaardcurven om de intracellulaire glucose- of Glutamineniveaus zoals passend te berekenen. In dit representatieve experiment werden batch-overgroeide culturen van twee cellijnen onderhouden zoals net gedemonstreerd met dagelijkse monsters die werden gebruikt voor de in vivo kalibratie van elke fibs. Een representatief profiel van levensvatbare celgroei van de twee cellijnen in relatie tot hun intracellulaire glucose- of glutamineniveaus wordt gedemonstreerd in deze grafiek en de bijbehorende fret-metingen en intracellulaire metabolietconcentraties bepaald door de enzymatische assays worden gepresenteerd in deze tabel.

Het werd vastgesteld dat de lage celgetallen die aanwezig waren in de eerste vier dagen van de cultuur leidden tot een onbetrouwbaar fret-signaal. Evenzo produceerde het hoge niveau van cellysaat dat aanwezig was na dag acht van de cultuur een grote hoeveelheid lichtverstrooiing. Daarom wordt alleen gegevens voor dagen vier tot acht gebruikt om de kalibratiecurven voor de glucose- en glutamine-fibs te construeren.

De resultaten geven aan dat het FIB-signaal een betrouwbare correlatie produceert met de intracellulaire concentraties tussen een en vijf millimolair voor glucose en 0,3 en twee millimolair voor glutamine. Om de fibs-bevindingen te valideren, werden gevoede bash-overgroeide culturen van de twee cellijn