Name: FIBS-enabled Noninvasive metabole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-03T15:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer FIBS-calibratie voor niet-invasieve metabole profilering met FRET-biosensoren. Deze methode meet intracellulaire glucose- en glutamineniveaus in realtime voor optimalisatie van bioprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Professor Wolf Frommer (Carnegie Institution for Science, Stanford University) voor vriendelijk ons ​​met de glucose FRET plasmide en Dr Uwe Ludewig (Universität Hohenheim) voor vriendelijk het leveren van de glutamine FRET bouwen in de pUTKan plantenexpressievector. AB wordt gefinancierd door de BBSRC Gerichte Priority Studentships programma. Zowel CK en KP worden ondersteund door RCUK beurzen in Biopharmaceuticals Processing. CK wil ook Lonza Biologics bedanken voor hun financiële steun. Het Centrum voor Synthetische Biologie en Innovatie is royaal ondersteund door de EPSRC.

1. Cellijn Revival en onderhoud <ol><li> Revive CHO-cellen in 9 ml CD-CHO medium aangevuld met 8 mM L-glutamine en 10 ml / L 100x hypoxanthine / thymidine supplement (compleet groeimedium). </li><li> Centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de cellen in 10 ml vers compleet groeimedium. </li><li> Verwijderen van een 1 ml monster en bepaal de levensvatbare cel concentratie met lichtmicroscopie met de trypanblauw kleurstof uitsluiting methode in een hemocytometer. </li><li> Start een cultuur op een seeding dichtheid van 3 x 10 5 cellen / ml in 125 ml schudflessen. </li><li> Handhaaf de cultuur in een incubator bij 37 ° C, een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2, op een orbitale schudden platform roteert met 120 rpm. </li><li> Subcultuur elke 3-4 dagen in hele groeimedium in een zaaidichtheid van 2 x 10 5 cellen / ml. </li></ol> 2. Transfectie van de cellijn met het plasmide Containing de biosensor Gene <ol><li> Bereid plasmide-DNA met een grootschalige plasmide zuiveringskit. </li><li> Handhaaf cellen bij de geschikte omstandigheden (37 ° C, 5% CO2) 12-24 uur voor transfectie te zorgen voor de cellen actief delende op het moment van transfectie. </li><li> Tel de cellen met de kleurstof trypan blauw uitsluiting werkwijze vervolgens een werkvolume van 20 ml celkweek in een 125 ml schudkolf bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Gebruik een geschikte transfectie kit voor de cellijn in gebruik. Het plasmide DNA transfectie reagentia ratio zal afhankelijk van de cellijn en vector zijn. Aanbevolen wordt het geoptimaliseerd door het testen van verschillende verhoudingen binnen het bereik van de fabrikant gespecificeerde alvorens zij de uiteindelijke transfecties. Ook houden tenminste een negatieve controle kweek die de cellen maar geen DNA. </li><li> Incubeer gedurende 4 dagen in de statische modus en vervolgens overbrengen naar een shaking platform draaien op 125 rpm. </li><li> Voeg de juiste antibioticum voor plasmide selectie naar een geschikte concentratie, zoals bepaald door een kill-curve. In deze studie werd zeocine toegevoegd tot een eindconcentratie van 400 ug / ml voor de selectie van getransfecteerde cellen. </li><li> Verander media op een geschikt moment interval voor de cellijn, antibiotica telkens voegen, totdat de cellen in de controle goed zijn gestorven. </li><li> Gebruik de meest samenvloeiing putten om de voortgang te schudden culturen. </li><li> Stel een cel bank bevroren cellen in cryogene flesjes die 10 7 levensvatbare cellen in 1 ml bevriezen mengsel. In dit werk, die bestaat uit 92,5% groeimedium en 7,5% dimethylsulfoxide. </li></ol> 3. Batch en Fed-batch celgroei Curve <ol><li> Volg de instructies voor celonderhoud hierboven om drievoud celculturen van de getransfecteerde CHO-cellen in 250 ml vestigen schud kolven met een werkvolume van 50 ml. </li><li> Handhaving van de cultures in een bevochtigde cel incubator bij 37 ° C met 5% CO2, op een orbitale schudden platform roteert met 125 rpm en verwijder 4,1 ml monsters van elke groeiende kweek van 24 uur intervallen. </li><li> Gebruik 100 ul van het monster op de levensvatbare celconcentratie en levensvatbaarheid van de cellen met de kleurstof trypan blauw uitsluiting methode bepalen. </li><li> Herhaal dit totdat de levensvatbare cel concentratie tot nul wordt gereduceerd. </li><li> Herhaal de fed-batch celculturen te vullen met de geschikte hoeveelheid glucose of glutamine op dag 6 met de concentratie respectievelijk herstellen naar hun initiële waarden van 36 mM en 4 mM. Aanbevolen wordt extra controle kweken ook worden gehandhaafd, die worden gevoed met hetzelfde volume (12 ml in dit geval) zuiver water. </li></ol> 4. FRET Ratio Metingen <ol><li> Neem 2 ml van de dagelijkse monsters verwijderd in stap 3.2 en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Resuspeindigde de celpellet in 2 ml ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Breng deze in een 6-wells plaat en voeg een blanco monster dat geen cellen aan een putje. </li><li> Meet de niveaus van blauwe en gele fluorescentie onmiddellijk bij een excitatie golflengte van 430/435 nm en emissie golflengten van 465/435 nm (blauw) en 520/510 nm (geel). </li><li> Bereken de FRET ratio (verhouding van gele fluorescentie gedetecteerd over blauwe fluorescentie gedetecteerd). </li></ol> 5. Metaboliet Testen <ol><li> Neem 2 ml van de dagelijkse monsters verwijderd in stap 3.2 en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 3 ml ijskoude PBS en centrifugeer opnieuw bij 100 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 3 ml ijskoude PBS zoals hierboven. Ultrasone trillingen het monster 5x gedurende 3 min elk bij een puls van 15 seconden aan en 15 seconden uit. Op dit punt, de cel extracts kan worden bevroren, indien gewenst. </li><li> Gebruik een geschikte glucose-assay kit volgens de instructies van de fabrikant voor monsters van celextracten de intracellulaire glucoseconcentratie bepalen (zie tabel materialen). Opmerking: Gebruik de juiste normen om een ​​standaard curve construeren. In dit werk, de concentratie van de normen varieerde van 0-100 mm. </li><li> De metingen van de normen, bouwen de standaardcurve en vind de lineaire vergelijking best passende (hier: y = 1310.51x - 723,43 waarbij y de absorptie lezen en x de glucoseconcentratie). </li><li> Bereken de concentraties glucose met de standaardcurve en rekening houdend met de verdunningsfactor. De intracellulaire glucoseconcentratie kan dan berekend door de vergelijking: <img alt="" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51200/book_bg.png" width="500" /> Voor CHO-cellen, werd het enkelvoudige celvolume berekend met een celdiameter van 12 pM 12 </sup&gt;. </li><li> De geschikte glutamine assay kit volgens de instructies van de fabrikant voor monsters van celextracten de intracellulaire glutamine concentratie kan worden bepaald (zie tabel materialen). Opmerking: Gebruik de juiste normen om een ​​standaard curve construeren. In dit werk, de concentratie van de normen varieerde tussen 0-2 mm. </li><li> Zoals in 5.5 hierboven, bouwen de kalibratiecurve (in dit geval y = + 17,1 203.1x waarbij y de absorptie lezen en x de glucoseconcentratie) </li><li> De standaardcurve Bereken de glutamine concentratie van de monsters, waarbij de verdunning wordt gehouden. De intracellulaire glutamine concentratie kan worden berekend met vergelijking 1 hierboven. </li></ol>

<ol><li>Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+arrays+for+simultaneous+measurement+of+glucose%2C+lactate%2C+glutamate%2C+and+glutamine%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine.</a> Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).</li>
<li>Billingsley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nano-optodes+for+glucose+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nano-optodes for glucose detection.</a> Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).</li>
<li>Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Determination+of+Glutamine+Using+a+Genetically+Engineered+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein.</a> Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).</li>
<li>Kfouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+miniaturized+wireless+fluorescence-based+diagnostic+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+J.+Sel.+Top.+Quantum+Electron%22%5BJournal%5D)">Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).</li>
<li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+detection+in+microfluidic+channels%E2%80%94the+Holy+Grail+in+muTAS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).</li>
<li>Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensors+for+monitoring+dynamic+changes+of+intracellular+metabolite+levels+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).</li>
<li>Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+cytosolic+glucose+and+ATP+levels+in+yeast+using+optical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors.</a> Biochem. J. 432, 399-406 (2010).</li>
<li>Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%28%2B%29-independent+glutamine+transport+in+plant+root+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">H(+)-independent glutamine transport in plant root tips.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+high-cavacity+bidirectional+glucose+transport+across+the+endoplasmic+reticulum+membrane+by+genetically+encoded+fluorescence+resonance+energy+transfer+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).</li>
<li>Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET+pairs+for+ratiometric+imaging+of+dual+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors.</a> Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).</li>
<li>Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+hierarchical+relationship+of+Src+and+Rac+at+subcellular+locations+with+FRET+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+recombinant+Chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).</li>
<li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li>
<li>Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+N-Glycosylation+gene+expression+in+CHO+cell+Fed-batch+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures.</a> Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).</li>
<li>Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Monitoring+of+Intracellular+Glucose+and+Glutamine+in+CHO+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+binding+proteins%3A+a+versatile+superfamily+for+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De FIBS mogelijk in vivo en in situ kwantificering van sleutelmoleculen in casu groei beperkende voedingsstoffen, onzekerheden van gevolg van afschrikken en extractiemethoden. De resultaten suggereren dat er een goede correlatie tussen de FIBS signaal en de intracellulaire concentraties in het traject van 1-5 mM glucose en 0.3-2 mM glutamine. In batch CHO-celkweek, zijn deze concentraties aangetroffen in de exponentiële, stationaire en vroege daling fasen. De exponentiële en stationaire fasen zijn de m...

Metaboliet controle heeft diverse toepassingen in bioprocessing, inclusief procesontwikkeling, media en diervoeders ontwerp en metabolic engineering. Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor concentratiemetingen door middel van enzymatische 1, 2 chemisch of bindingstesten 3. Een interessante optie is het gebruik van fluorescente, basis van eiwitten in vivo biologische sensoren als reporters van de intracellulaire concentratie van belangrijke metabolieten. In ultra-low volume assays, fluorescentie is een handig hulpmiddel als miniaturisatie feite verbetert de signaal-ruisverhouding 4,5 en eiwit gebaseerde sensoren kunnen genetisch gecodeerd zin dat geen exogene reagens nodig metabolietanalyse zijn. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensoren uit twee fluorescerende eiwitten verbonden door een ligand bindend domein. FRET is een nonradiative overdracht van energie van een foto-enthousiast donor naar een acceptor fluorescerend molecuul locat<html> ed in de nabijheid (&lt;100). Ligand splitsing of binding veroorzaakt een conformationele verandering in de sensor, die op zijn beurt veroorzaakt een verandering in de nabijheid van de fluoroforen, wat leidt tot een verandering in FRET efficiëntie gemeten door de verandering in het emissiespectrum. FRET geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) wordt constitutief geproduceerd in de cellijn en de spectrale eigenschappen veranderen gebaseerd op de concentratie van metaboliet in de cel. FIBS hebben snelle responstijden waardoor ze ideaal zijn voor het nemen van metingen van dynamische modellen 6. Vorige toepassingen zijn onder meer het toezicht op enkele 7-9 en meerdere 10 metabolieten en het verstrekken van gegevens over de tijdruimtelijke verdeling 11. FIBS kunnen worden gemaakt in twee configuraties: Apo-Max, wanneer ligandbinding verstoort de nabijheid van de fluoroforen verlagen energieoverdracht en Apo-Min, wanneer ligandbinding brengt de twee fluoroforen in nauwer contact (figuur 1). _content &quot;&gt; In dit werk wordt een protocol gepresenteerd voor de bouw van Chinese hamster ovarium (CHO) cellijnen die constitutief een FIBS voor een metaboliet, glucose of glutamine. Een methodologie vastgesteld voor de kalibratie van de sensor in vivo om toekomstige kwantitatieve staat metingen van intracellulaire metaboliet concentratie zoals aangegeven in figuur 2. Op basis daarvan de intracellulaire concentratie van glucose of glutamine kan worden bepaald fed-batch CHO celkweken, waarbij de twee nutriënten werden toegevoegd in hoge concentraties in het proces. de resultaten blijkt dat met het fluorescerende signaal van de FIBS en de eerder geconstrueerde ijkcurve nauwkeurig voorspellen van de intracellulaire concentratie mogelijk, zoals bevestigd door een onafhankelijke enzymatische test. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen boven de huidige analytische technieken omdat het invasieve, goedkope en snel, het geven van een real-time signaal van de FIBS die maan kan zijnitored de hele cultuur.

<table><tbody><tr><td>CHO-S Cellen</td><td>Life Technologies</td><td>11619-012</td><td>De cellijn varieert afhankelijk van de doelen van de studie</td></tr><tr><td>pCDNA4/TO vector&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransIT-PRO Transfectie Reagens</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 5700</td><td>Transfecties kunnen worden uitgevoerd met behulp van elke methode die geschikt is voor de onderzochte cellijn</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD-CHO medium</td><td>Life Technologies</td><td>10743-011</td><td>Het celgroeimedium is afhankelijk van de onderzochte cellen</td></tr><tr><td>100x HT Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>11067-030</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>InfinitePRO 200 plate reader</td><td>Tecan</td><td>FLx800TBI</td><td>Elke 96-wells fluorescentie plate reader die toegang heeft tot de vereiste golflengten kan worden vervangen</td></tr><tr><td>Filters voor plate reader</td><td>Tecan</td><td>30000463</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Plasmid Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Elke geschikte kit kan worden vervangen</td></tr><tr><td>Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>A22189</td><td>Elke geschikte kit kan worden vervangen</td></tr><tr><td>EnzyChrom&nbsp; Glutamine Assay Kit</td><td>BioAssay Systems</td><td>EOAC-100</td><td>Elke geschikte kit kan worden vervangen</td></tr><tr><td>Improved Neubauer hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>MNK-420-010N</td><td></td></tr><tr><td>Incubator&nbsp;</td><td>Nuaire</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr></tbody></table>

fibs-enabled noninvasive metabole

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In het tijdperk van de computationele biologie, nieuwe high throughput experimentele systemen die nodig zijn om aan te vullen en te verfijnen modellen, zodat ze kunnen worden gevalideerd voor voorspellende doeleinden. Idealiter dergelijke systemen zou een laag volume, dat de bemonstering en destructieve analyses in de weg staat wanneer de tijd cursus data zijn te verkrijgen zijn. Wat nodig is, is een in situ monitoring tool die de nodige informatie in real-time en niet-invasief te kunnen melden. Een interessante optie is het gebruik van fluorescente, basis van eiwitten in vivo biologische sensoren als reporters intracellulaire concentraties. Een specifieke klasse van in vivo biosensoren die toepassingen heeft in metaboliet kwantificering is gebaseerd op Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee fluorescente eiwitten verbonden door een ligand bindend domein. FRET geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) worden constitutief geproduceerd binnen de cellijn, ze hebben snelle responstijden en hun spectrale chagenschappen veranderen gebaseerd op de concentratie van metaboliet in de cel. In dit artikel wordt de werkwijze voor het construeren van de Chinese hamster ovarium (CHO) cellijnen die constitutief een FIBS glucose en glutamine en kalibreren van de FIBS in vivo in batch celkweek om toekomstige kwantificering van intracellulaire metaboliet concentratie inschakelen beschreven. Gegevens van fed-batch CHO celkweken aantoont dat de FIBS kon telkens de resulterende verandering in de intracellulaire concentratie detecteren. De fluorescerende signaal van de FIBS en de eerder geconstrueerde ijkcurve werd de intracellulaire concentratie nauwkeurig bepaald bevestigd door een onafhankelijke enzymatische test.

Een overzicht van de methode is weergegeven in figuur 2. In het werk die hierin werden CHO-cellen getransfecteerd met de vector FIBS en stabiele cellijnen werden geselecteerd in een antibioticum druk van 400 ug / ml zeocine. Twee afzonderlijke stabiele cellijnen constitutief glucose en glutamine sensoren zijn derhalve gecreëerd. Figuur 1 toont de configuratie van de twee biosensoren in deze studie. De glucosesensor is het Apo-Max principe en de overeenkomstige plasmide pRSET-FLIPglu600μ...

Een beschrijving van hoe je Förster Resonance Energy Transfer geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) kalibreren voor in situ metabool profiel wordt gepresenteerd. De FIBS kan worden gebruikt om de intracellulaire niveaus van metabolieten invasief leveren aan de ontwikkeling van metabole modellen en hoge doorvoer screening van bioproces omstandigheden te meten.

FIBS-enabled Noninvasive metabole

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Het algemene doel van deze procedure is om het niveau van intracellulaire glucose of glutamine op een niet-invasieve manier te monitoren met behulp van genetisch gecodeerde biosensoren op basis van eiwitten. Dit wordt bereikt door eerst de betreffende cellen te transfecteren met het plasmide dat het biosensor-gen bevat en vervolgens te selecteren op de cellen die de biosensor tot expressie brengen. In de tweede stap worden celkweekmonsters genomen uit batch- of fed-batchculturen en worden hun FRET-ratio's gemeten.De intracellulaire glucose- of glutamineconcentratie van de monsters kan vervolgens worden bepaald met een onafhankelijke assay. Uiteindelijk kan de FRET-ratio van de monsters worden gebruikt om de intracellulaire concentratie van glucose of glutamine non-invasief en in real-time te berekenen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de verbetering van bioprocessen, omdat dit een betrouwbare methode is voor het verkrijgen van real-time metabole informatie die kan worden gebruikt voor online optimalisatie en controle.Hoewel de methode kan worden gebruikt om inzicht te verschaffen in bioprocessing, kan deze ook worden toegepast in andere systemen, waaronder de

fibs-enabled-noninvasive-metabolic-profiling

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Metabolische herprogrammering is een kenmerkend en vereist kenmerk voor M1 en M2 macrofaagpolarisatie. Dit manuscript beschrijft een test voor de meting van fundamentele parameters van glycolyse en mitochondriale functie in muis-beenmerg-afgeleide macrofagen. Deze tool kan worden toegepast om te onderzoeken hoe bepaalde factoren het metabolisme en fenotype van macrofagen beïnvloeden.

Metabole karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 Bone Marrow-afgeleide macrofagen met behulp van real-time extracellulaire Flux Analysis

Dit werk toont de haalbaarheid aan van een in vivo fosfor-31 magnetische resonantiespectroscopie (31PMRS) techniek om mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) capaciteit in menselijke skeletspier te kwantificeren.

Fosfor-31 magnetische resonantie spectroscopie: een instrument voor het meten In Vivo Mitochondrial Oxydatieve Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Deze studie beschrijft een protocol dat 18F-FDG en positronemissietomografie/computertomografie (PET/CT) beeldvorming, samen met kinetiekmodellering, gebruikt om de in vivo, real-time opname van 18F-FDG in weefsels te kwantificeren.

Het bepalen van glucosemetabolisme Kinetics Met behulp<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG Micro-PET / CT

Hier introduceren we een methode voor het gebruik van een intra-ventrikel optische katheter in geperfundeerd harten om Absorptie spectroscopie uit te voeren over de hart muur. De verkregen gegevens bieden robuuste informatie over de zuurstofspanning van het weefsel, evenals substraat gebruik en membraanpotentiaal gelijktijdig met cardiale prestatie maatregelen in deze alomtegenwoordige voorbereiding.

Intra-cardiale side-afvuren licht katheter voor het monitoren van cellulaire metabolisme met behulp van Transmural extinctie spectroscopie van Geperfectiongebruikt zoogdieren harten

Real-time cel metabole flux assay meet het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuringssnelheid, die overeenkomt met mitochondriale en glycolytische adenosinetrifosfaatproductie, met behulp van pH- en zuurstofsensoren. Het manuscript legt een methode uit om de energiestatus van osteoblasten en de karakterisering en interpretatie van de cellulaire bio-energetische status te begrijpen.

Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren

Dit protocol beschrijft fluorescentiebeeldvorming en analyse van de endogene metabole co-enzymen, gereduceerd nicotinamide-adenine (fosfaat) dinucleotide (NAD (P) H) en geoxideerd flavine-adenine dinucleotide (FAD). Autofluorescentie beeldvorming van NAD(P)H en FAD biedt een labelvrije, niet-destructieve methode om het cellulaire metabolisme te beoordelen.

Autofluorescentie beeldvorming om cellulair metabolisme te evalueren

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Hier beschrijven we in detail methoden voor het extraheren van macrofagen uit het beenmerg, de milt en het hartinfarct, en vervolgens het beoordelen van de metabole flux in levende cellen.

Analyse van ex vivo metabole flux in milt- en cardiale macrofagen en beenmergmonocyten

Door gebruik te maken van een multimodaal platform dat labelvrije optische beeldvormingsmodaliteiten combineert, hebben we een protocol ontwikkeld voor het visualiseren en kwantificeren van cellulaire dynamiek en metabolisme. Door middel van beeldvorming via multifotonfluorescentie, tweede harmonische generatie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie kunnen we een holistisch overzicht van de cellulaire en moleculaire omgeving genereren.

Multimodaal optisch beeldvormingsplatform voor het bestuderen van cellulair metabolisme

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

Leer FIBS-calibratie voor niet-invasieve metabole profilering met FRET-biosensoren. Deze methode meet intracellulaire glucose- en glutamineniveaus in realtime voor optimalisatie van bioprocessen.

FIBS-enabled Noninvasive metabole

Meer video's verkennen