FIBS-enabled Noninvasive metabole

Het algemene doel van deze procedure is om het niveau van intracellulaire glucose of glutamine op een niet-invasieve manier te monitoren met behulp van genetisch gecodeerde biosensoren op basis van eiwitten. Dit wordt bereikt door eerst de betreffende cellen te transfecteren met het plasmide dat het biosensor-gen bevat en vervolgens te selecteren op de cellen die de biosensor tot expressie brengen. In de tweede stap worden celkweekmonsters genomen uit batch- of fed-batchculturen en worden hun FRET-ratio's gemeten.

De intracellulaire glucose- of glutamineconcentratie van de monsters kan vervolgens worden bepaald met een onafhankelijke assay. Uiteindelijk kan de FRET-ratio van de monsters worden gebruikt om de intracellulaire concentratie van glucose of glutamine non-invasief en in real-time te berekenen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de verbetering van bioprocessen, omdat dit een betrouwbare methode is voor het verkrijgen van real-time metabole informatie die kan worden gebruikt voor online optimalisatie en controle.

Hoewel de methode kan worden gebruikt om inzicht te verschaffen in bioprocessing, kan deze ook worden toegepast in andere systemen, waaronder de detectie van ziektebiomarkers. Begin met het revitaliseren van CHO-cellen in negen milliliter volledig groeimedium. Centrifugeer vervolgens de cellen, resuspendeer het pellet in 10 milliliter vers groeimedium en tel de cellen middels trypaanblauw-uitsluiting.

Start vervolgens een kweek bij een zaaidichtheid van 3 × 10⁵ cellen per milliliter in 125 milliliter schudkolven bij 37 °C en 5% CO2 op een orbitale schudplatform. Subcultiveer de cellen elke drie tot vier dagen in het volledige groeimedium bij een zaaidichtheid van 2 × 10⁵ cellen per milliliter met een rotatiesnelheid van 125 RPM voor celtransfectie.

Houd de cellen gedurende 12 tot 24 uur vóór de transfectie op 37 °C en 5% CO2 om ervoor te zorgen dat de cellen actief delen. Tel vervolgens, nadat het plasmide-DNA is voorbereid, de cellen met de trypaanblauw-uitsluitingsmethode en verdun de cellen tot een werkvolume van 20 milliliters celkweekmedium in een schudkolf van 125 milliliter, bij een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter.

Gebruik een geschikte transfectiekit voor de gebruikte cellijn, inclusief ten minste één negatieve controleput met cellen, maar zonder DNA. Incubeer de getransfecteerde cellen gedurende vier dagen in statische modus. Voeg nu het passende antibioticum voor plasmideselectie toe in een geschikte concentratie, zoals bepaald door een kill-curve.

In deze studie werd bijvoorbeeld zin toegevoegd tot een eindconcentratie van 400 grams per milliliter voor selectie van de getransfecteerde cellen, waarna de culturen werden overgebracht naar een schudplatform dat roteerde met 125 RPM. Vervang het medium met een voor de cellijn gepast tijdsinterval en voeg elke keer antibioticum toe totdat de cellen in de controleput zijn afgestorven. Gebruik de putten met de hoogste confluentie voor de overstap naar de schudculturen.

Bevries de cellen vervolgens in cryovials met 1 × 10⁷ levensvatbare cellen in 1 mL vriesmedium om batch- en fed-batch groeicurves te genereren. Stel eerst triplaat celculturen op van de getransfecteerde CHO-cellen in 250 mL schudkolven met een werkvolume van 50 mL. Plaats de culturen vervolgens in een bevochtigde celincubator met schudfunctie en neem elke 24 uur monsters van 4,1 mL af uit elke groeiende cultuur. Voeg bij de fed-batch culturen op dag zes de juiste hoeveelheid glucose of glutamine toe om de concentraties te herstellen naar hun beginwaarden.

Voed de controlecturen met hetzelfde volume zuiver water; gebruik dagelijks 100 µL van de 4,1 mL monsters uit 4.2 om de cellen te tellen middels trypaanblauw-uitsluiting totdat de concentratie levensvatbare cellen tot nul is gereduceerd. Om de FRET-ratio te bepalen, centregeer twee milliliter van de dagelijkse monsters en resuspendeer het pellet in twee milliliter ijskoud PBS. Draag de helft van de celsuspensie over naar een zeswellplaat en voeg aan één well een blanco monster zonder cellen toe. Meet vervolgens onmiddellijk de niveaus van blauwe en gele fluorescentie bij een excitatiegolflengte van 430 nm met een bandbreedte van 35 nm en emissiegolflengten van 465 nm met een bandbreedte van 35 nm en 520 nm met een bandbreedte van 10 nm voor respectievelijk de blauwe en gele fluorescentie.

Bereken de FRET-ratio's door de verhouding tussen de gedetecteerde gele fluorescentie en de blauwe fluorescentie te bepalen. Centrifugeer nu de laatste twee milliliter van de dagelijkse monsters en was het pellet vervolgens twee keer in ijskoud PBS; voer na de tweede wasbeurt de volgende stap uit. Sonicate het monster vijf keer gedurende drie minuten per keer met een puls van 15 seconden aan en 15 seconden uit.

Voer ten slotte de metabolietanalyses uit volgens de instructies van de fabrikant en gebruik de resulterende standaardcurven om de intracellulaire glucose- of glutamineniveaus te berekenen, naar gelang de situatie. In dit representatieve experiment werden batch-overgroeiculturen van twee cellijnen onderhouden zoals zojuist gedemonstreerd, waarbij dagelijkse monsters werden gebruikt voor de in vivo kalibratie van elke fibs. Een representatief groeiprofiel van levensvatbare cellen van de twee cellijnen in relatie tot hun intracellulaire glucose- of glutamineniveaus wordt in deze grafiek weergegeven, en de overeenkomstige fret-metingen en intracellulaire metabolietconcentraties bepaald door de enzymatische analyses worden in deze tabel gepresenteerd.

Er werd vastgesteld dat de lage celgetallen tijdens de eerste vier dagen van de cultuur leidden tot een onbetrouwbaar FRET-signaal. Evenzo zorgde het hoge niveau van cellysaat na de achtste dag van de cultuur voor een aanzienlijke hoeveelheid lichtverstrooiing. Daarom worden alleen de gegevens van dag vier tot en met acht gebruikt voor het opstellen van de kalibratiecurves voor de glucose- en glutamine-fibs.

De resultaten geven aan dat het FIB-signaal een betrouwbare correlatie produceert met de intracellulaire concentraties tussen één en vijf millimolar voor glucose en 0,3 en twee millimolar voor glutamine. Om de FIB-bevindingen te valideren, werden fed-batch kweekexperimenten uitgevoerd met overgegroeide culturen van de twee cellijnen. Op dag zes van de celkweek werd een voeding met een hoge substraatconcentratie toegevoegd om de extracellulaire concentraties van het substraat te verhogen.

Zoals de grafieken laten zien, vertonen de fret-ratio's op elke dag een duidelijke reactie op de voeding. De trend die zij tot dag zes volgden, is omgekeerd. In de met glucose gevoede culturen steeg de extracellulaire glucoseconcentratie bijvoorbeeld weer tot 36 millimolar.

Terwijl in de met glutamine gevoede culturen de glutamineconcentratie toenam tot 4 mM. In het glucose-experiment nam de FRET-ratio voor de glucose-fibs gekozen cellijn op dag zeven af als reactie op de toevoeging van glucose. Aangezien de glucose-fibs de APO-on configuratie volgen.

Op dezelfde wijze nam in het glutamine-experiment de FRET-ratio voor de glutamine-fibs-cellijn toe als reactie op de toevoeging van glutamine, in overeenstemming met het principe van de APO-off-sensoren. Deze FRET-metingen werden uiteindelijk gebruikt om de overeenkomstige intracellulaire glucose- en glutamineconcentraties te berekenen op basis van de eerder genoemde kalibratiecurves. Deze worden vergeleken met de werkelijke intracellulaire concentraties van deze substraten, zoals bepaald met de enzymatische glucose- en glutamine-assays, en vertonen na de ontwikkeling een adequate overeenstemming.

Deze techniek baant de weg voor onderzoekers in het vakgebied om het effect van verschillende mediumformuleringen op de proteinproductiviteit te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe genetisch gecodeerde biosensoren kunnen worden gebruikt om intracellulaire metabolietconcentraties te monitoren.