DNBS / TNBS Colitis modellen: Inzicht geven Into Inflammatory Bowel Disease en effecten van vet in de voeding

Het algemene doel van deze procedure is om een alternatieve en goedkope methode aan te bieden voor het bestuderen van inflammatoire darmziekte of IBD met behulp van DY nitrobenzeenzonzuur of DNBS. Dit wordt bereikt door eerst DNBS intrarectaal toe te dienen via een voorzichtige inbreng in de anus. In de tweede stap worden weefselcoupes van de dikke darm verkregen voor histologische screening en om de myeloperoxidase-activiteit van de met DNBS uitgedaagde weefsels te beoordelen; uiteindelijk kunnen de effecten van dieetoliën op gewichtsverlies en colitis worden geëvalueerd via zowel macroscopische als microscopische methoden.

Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van de bestaande dextraansulfaatnatriummethode is dat de DNBS-methode eenvoudig uit te voeren is, minder kostbaar is en een hoge reproduceerbaarheid heeft. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het IBD-onderzoeksveld, zoals wat de rollen van stress en depressie zijn bij het recidief van IBD, of wat de onderliggende mechanismen zijn bij darmschade en -herstel. Begin voor de rectale toediening van DNBS bij muizen met het bevestigen van een spuit van 1 ml aan een naald van 19 gauge. Voorzie deze van een polyethyleen 50 katheter en zuig vervolgens vers bereide DNBS op in de katheter.

Breng vervolgens traangel aan bij een geanestheseerde muis en oefen met de vingertoppen lichte druk uit op het achterste uiteinde van het dier om eventuele feces in het distale colon te verwijderen. Injecteer nu een kleine hoeveelheid van de DNBS-oplossing om het colon te smeren voor een gemakkeligere inbreng, terwijl de katheter voorzichtig intrarectaal ongeveer drie tot vier centimeter wordt ingebracht. Zodra de katheter op zijn plaats zit, injecteert u 100 µL DNBS of een gelijk volume 50% ethanol voor de controledieren.

Positioneer het dier vervolgens 90 seconden met de kop naar beneden om verlies van de reagentia te voorkomen. Voer de dieren na toediening van DNBS 8% sucrosewater in 0,2% zoutoplossing om dehydratie tijdens de eerste week te voorkomen. Controleer de dieren dagelijks zorgvuldig op gewichtsverlies, dehydratie of distress gedurende de experimentperiode tot op het gewenste tijdstip.

Open na de DNBS-challenge de buikholte van het geëuthanaseerde dier en verwijder de gehele dikke darm. Open vervolgens de darm in de lengterichting. Macroscopische slijmvliesulceraties moeten waargenomen worden op ongeveer twee tot drie centimeter proximaal van het distale uiteinde van het colon.

Neem secties van 0,5 centimeter proximaal van de plaats van maximale macroscopische schade bij de experimentele dieren en segmenten van het colon van de overeenkomstige anatomische locaties bij de controledieren. Bevries vervolgens secties van 0,5 centimeter van één controledier en één NBS-behandeld dier direct in vloeibare stikstof voor de bepaling van de myeloperoxidase-activiteit en fixeer de overige secties gedurende de nacht in 10% neutraal gebufferde formaline voor histologische analyse. Was de in formaline gefixeerde weefsels de volgende ochtend met 70% ethanol en plaats deze in een cassette om naar een histologieafdeling te sturen voor inbedding in paraffine en kleuring met hematoxine en eosine voor histologische scoring.

Scoor vervolgens ten minste drie weefselcoupes van elk dier onder een lichtmicroscoop om de histologische beschadigingsscores voor elke groep te bepalen. Om de myeloperoxidase-activiteit van de met DNBS uitgedaagde weefsels te analyseren, worden eerst de snap-frozen controle- en experimentele weefsels gehomogeniseerd in myeloperoxidase-homogenisatiebuffer, zodat een suspensie van 50 milligram colonsegment per milliliter homogenisatiebuffer ontstaat. Verdeel de gehomogeniseerde oplossing vervolgens in porties van één milliliter en centrifugeer deze gedurende twee minuten bij 10.000 ×g en vier °C.

Breng vervolgens 100 µL van elk aliquot over naar individuele cuvetten en voeg 2,9 mL PBS toe, aangevuld met IDE, dihydrochloride en waterstofperoxide, terwijl u krachtig mengt. Meet tot slot de absorptiesnelheid met een spectrofotometer bij 460 nm. Dit volgt op de intrarectale uitdaging met DNBS zoals zojuist gedemonstreerd.

Er wordt een significant gewichtsverlies waargenomen na 48 uur bij ratten die supplementen van vis- of koolzaadolie kregen, en na 72 uur bij ratten die supplementen van saffloerolie kregen. Het maximale waargenomen gewichtsverlies treedt op na 48 uur bij de ratten die visolie kregen, en na 72 uur bij de ratten die supplementen van koolzaad- of saffloerolie kregen.

De gewichtstoename zette na 72 uur hervat en vijf dagen na toediening van DNBS vertoonden de met visolie en saffloerolie behandelde groepen lichaamsgewichten die vergelijkbaar waren met hun baseline-waarden. Controle-ratten die werden aangevuld met de diëtetische oliën en werden uitdaagd met intrarectale ethanol, namen gedurende de gehele studieperiode van vijf dagen gestaag in gewicht toe. De intestinale schade veroorzaakt door DNBS kan wijdverspreid zijn.

Het gebied met de maximale schade is echter over het algemeen gelokaliseerd in de distale zes centimeter van het colon bij ratten en de distale drie centimeter bij muizen. Bij een nadere histologische beoordeling wordt uitgebreide epitheliale beschadiging waargenomen, waaronder de vorming van ulcera, infiltratie van neutrofielen en lymfocyten, mucusdepletie en oedeem. Hoewel deze histologische tekenen van ontsteking en weefselschade duidelijk zichtbaar zijn in alle drie de groepen die met diëtetische olie werden gesuppleerd na uitdaging met DNBS, wordt de ernstigste schade gezien in de saffloeroliegroep, gevolgd door de koolzaadoliegroep.

Terwijl ratten in de visoliegroep minimale epitheliale beschadiging en een beperkte infiltratie van ontstekingscellen in de mucosa cosa vertonen. Verschillen in de histologische schade tussen de monsters kunnen worden gekwantificeerd om een betere vergelijking tussen de groepen mogelijk te maken. De grafiek illustreert de histologische scores voor weefselschade voor de drie diëtetische oliegroepen tijdens DNBS-colitis.

Zoals waargenomen in de met H&E gekleurde coupes, vertoont de groep die supplementen van saffloerolie kreeg de grootste mate van schade, gevolgd door de groep met koolzaadolie. Hoewel de visoliegroep de minste schade vertoont, kan de mate van infiltratie van ontstekingscellen, in het bijzonder neutrofielen, verder worden onderzocht door een myeloperoxidase-activiteitsassay uit te voeren. Dit is in overeenstemming met de histologische schade-scores.

Beoordeling van de myeloperoxidase-activiteit in rattecolons op dag vijf na DNBS-blootstelling onthult een toename van de activiteit in alle drie de groepen, waarbij de hoogste myeloperoxidase-activiteit werd waargenomen in de saffloeroliegroep, gevolgd door de koolzaadoliegroep en de visoliegroep. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de muizen licht te anesthetiseren en de DNBS-doseringen na ontwikkeling te optimaliseren. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van inflammatoire darmziekten om mechanismen te verkennen die intestinale inflammatie controleren in diermodellen van IBD.

Vergeet niet dat werken met DNBS extreem gevaarlijk kan zijn; neem daarom altijd voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van beschermende kleding, handschoenen, een veiligheidsbril en een mondmasker tijdens het bereiden van de oplossing.