Name: Super-resolution Imaging van Neuronal Dense-core Blaasjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Leer superresolutiebeeldvorming van dichte-kernblaasjes in neuronen met PALM-microscopie. Deze methode onthult vesikelorganisatie en clustering op nanometerschaal voor inzicht in synaptische functie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health verleent 2 R15 GM061539-02 (aan BAS), 2 R15 NS40425-03 (naar JEL), MH 66.179 (dr. Gary Banker van Oregon Health &amp; Science University / OHSU), en P30 NS061800 (dr. Sue Aicher van OHSU). Wij danken Barbara Smoody voor uitgebreide ondersteuning met de cultuur van hippocampale neuronen, en Drs. Brian Long en James Abney voor een kritische lezing van dit manuscript.

1. Monstervoorbereiding <ol><li> Bereid DNA dat voor een photoconvertible of fotoactiveerbare chimeer gericht op DCVS, met behulp van standaard moleculair biologische technieken. Opmerking: Een mogelijkheid is DNA dat codeert voor een weefselplasminogeenactivator-Dendra2 chimera (TPA-Dendra2). Dendra2 is een photoconvertible eiwit dat overschakelt van groen naar rood emissie bij blootstelling aan ultraviolet licht 12. </li><li> Cultuur hippocampusneuronen op high performance # 1.5 dekglaasjes voor ~ 5-10 dagen, volgende standaard protocollen 13. </li><li> Transfecteren ontwikkeling hippocampale neuronen met behulp van een kationogeen lipide reagens. Opmerking: Virale-gemedieerde infectie is effectiever voor volwassen neuronen. Deze alternatieve benadering is elders in detail beschreven 14. <ol><li> Bereid een 1,5 ml buis met ~ 1 ug DNA en 250 ul minimaal essentieel medium (MEM) en een tweede buis van 1,5 ml met 4 ui van het kationische lipide reagens en 250 glMEM. </li><li> Incubeer de oplossing gedurende 5 minuten. </li><li> Combineer de twee oplossingen en incubeer het verkregen mengsel nog eens 30 minuten. </li><li> Tijdens de incubatie stelt een schotel met meerdere ml kweekmedium verwarmd tot 37 ° C. </li><li> Zacht overdracht dekglaasjes bevattende neuronen aan het schaaltje met warm medium en voeg de transfectie mengsel. </li><li> Kantel de schotel voorzichtig en plaats deze vervolgens in een incubator bij 37 ° C gedurende 90 minuten. </li><li> Terug neuronen naar hun &quot;home gerecht&quot; en wacht ~ 12-18 uur. </li></ol></li><li> Fix cellen voor 45 minuten in 4% paraformaldehyde / 4% sucrose in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) opgewarmd tot 37 ° C. Opmerking: In PALM experimenten, is het belangrijk om een goede bewaring van ultrastructuur bereiken en formaldehyde fixatie standaard protocollen gebruikt voor immunofluorescentie kleuring typisch onvoldoende 15. Een belangrijke reden voor de slechte structurele behoud onvoldoende fixation tijd, omdat formaldehyde fixatie gaat adductvorming en eiwit verknoping, en het laatste proces is vrij traag 16. Een 45 minuten fixatie helpt dit probleem verminderen zonder waarneembare overfixation-geïnduceerd verlies van fluorescentie. </li><li> Wash dekglaasjes ~ 10x met gefilterd PBS. Opmerking: Dit vermindert fluorescente verontreinigingen. Afbeelding monsters relatief snel na fixatie. In de tussentijd, bewaar de cellen bij 4 ° C in gefilterd PBS in een lichtdichte verpakking. </li><li> Mount dekglaasjes bevattende neuronen in een kamer in gefilterd PBS. Opmerking: Het monster moet in een waterig medium, zoals PBS, met brekingsindex lager dan die van glas worden gemonteerd uitvoering totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) gebaseerde verlichting. -TIRF gebaseerde verlichting is erg handig omdat alleen dekglas-proximale fluoroforen zijn enthousiast, en er is een grote bijbehorende daling van de achtergrond fluorescentie 17. </li></ol> 2. Image Acquisition &lt;/ P&gt; <ol><li> Zet de super-resolutie imaging systeem. <ol><li> Schakel de booglamp. </li><li> Flip de &quot;systeem / pc&quot; en &quot;component&quot; schakelaars (op de kracht externe schakelaar) op &quot;on.&quot; </li><li> Zet de computer aan (na de microscoop controle tablet / dock gaat branden). Opmerking: Het docking station kan worden gebruikt om vele eigenschappen van de optica en lichtpad, met name gekozen doelstelling en concentratie besturen en bewaken. </li><li> Dubbelklik op het software icoon en kies de &quot;start-systeem&quot; in het login dialoog. </li></ol></li><li> Onderzoek het monster. <ol><li> Open de voor-en bovenkant toegang panelen op de laser veiligheidskabinet. </li><li> Kantel het doorgelaten licht arm om het podium en doelstellingen. </li><li> Doe olie op de alpha Plan-Apochromat 100X numerieke lensopening / NA = 1,46 (TIRF) doelstelling. Opmerking: Een 63X hoge NA doel kan worden gebruikt in plaats van de 100X. </li><li> Monteer het monster op het podium, en verhogen the doelstelling richting van het monster. </li><li> Bewaken van de lens aan met de XYZ functie van het docking station. Stoppen wanneer de lens zich in de marge van de focus (bijvoorbeeld z ~ 2.50 mm). </li><li> Volledig sluiten de toegang panelen. Opmerking: Om de laser veiligheid bezighouden. </li><li> Fine-tunen van de focus met de lenzen en de knoppen in het tabblad te vinden. Opmerking: Het lokaliseren tabblad biedt toegang tot knoppen die arc lampen op basis van de verlichting te produceren en vergemakkelijkt directe observatie van het monster met de oculairen. Ook het tabblad overname biedt toegang tot tools die laser-gebaseerde verlichting te produceren en vergemakkelijkt het vastleggen van beelden van de camera. <ol><li> Ga naar het tabblad te vinden, kiest u &quot;Trans On.&quot; </li><li> Klik op de oculaire expansie symbool. Let op: Deze actie zal een schema van het lichtpad. Attributen van het lichtpad kan worden gewijzigd door met de linkermuisknop te klikken op de juiste pictogrammen in het schema of met behulp van het touch screen op het docking station. Bijvoorbeeld, een filtergeschikt voor het bekijken van emissie uit Dendra2 kan worden gekozen met behulp van het pictogram reflector revolver. </li><li> Kijk in de oculairs, en breng de cellen in beeld met behulp van het docking station als een gids. Opmerking: Het monster zal zeer dun bevolkt met fluorescerende cellen omdat hippocampusneuronen zijn moeilijk te transfecteren, en het kan dus een beetje lastig om scherp te stellen met gereflecteerd verlichting. Als dit het geval is, gebruik doorvallende verlichting en de z lezing van het docking station als een gids. </li><li> Toggle the light &quot;Uit&quot; na het scherpstellen. </li></ol></li></ol></li><li> Identificeer een cel die is vrij helder, vertoont punctata fluorescentie, en heeft een klassieke morfologie, die indicatief is voor een goede gezondheid. <ol><li> Kies gereflecteerd licht en de filter geschikt is voor het bekijken van groene emissie uit Dendra2. </li><li> Scan de dekglas voor cellen die Dendra2 chimaera&#39;s met behulp van lage intensiteit excitatie licht. </li></ol></li><li> Schakel over naar de ACQtabblad uisition. <ol><li> Gebruik de &quot;experiment manager&quot; een PALM overname configuratie die goed doordacht systeem is eenvoudig aan te passen of te laden. Opmerking: Indien een dergelijke experiment bestaat, het ontwerpen van een beginnend experimentele configuratie met de volgende instellingen als leidraad: macht van de laser schuiven: 405 nm (~ 0,01% voor een 50 mW laser); 488 nm (~ 3% voor een 100 mW laser); 561 nm (~ 40% voor een 100 mW laser); Sluitertijd: ~ 50 msec; Camera winst: ~ 200; Multidimensionale overname: tijdreeksen (cycli = 30.000, interval = 0); Tracks: 488 nm met epi-verlichting, en 561 nm met TIRF-gebaseerde verlichting (zie stap 2.5.1); Doelstelling: 100X (NA = 1,46); TIRF hoek slider: invalshoek ~ 67-72 °; Pixelgrootte: 100 nm; Gezichtsveld: TIRF (de alternatieve keuzes leveren een hogere laser intensiteiten en worden voor fluoroforen die moeilijker te bleken). </li><li> Klik op &quot;ja&quot; als een pop-up menu verschijnt met een vraag over het inschakelen van lasers. </li></ol></li><li> Breng het beeldvan de cel in beeld op de camera vlak. <ol><li> Kies de 488 nm epi-verlichting laser spoor. Opmerking: Tracks zijn beam configuraties gebruikt tijdens de beeldvorming. Hier worden tracknamen bepaald door de golflengte die de emissie die wordt doorgegeven aan de camera produceert. Bijvoorbeeld, de 561 nm spoor maakt gebruik van zowel de 405 en 561 nm laser lijnen, maar de filter kubus laat alleen emissie van photoconverted Dendra2 opgewekt door 561 nm licht naar de camera. </li><li> Scherp op het beeld van de cel op de camera met behulp van de &quot;continu&quot; overname knop. </li></ol></li><li> Verzamel afbeelding een conventionele groothoek. <ol><li> Gebruik de &quot;Snap&quot; knop. </li><li> Sla de afbeelding op door te gaan naar het menu &quot;Bestand&quot; en te kiezen voor &quot;opslaan / opslaan als.&quot; </li></ol></li><li> Stel de-TIRF gebaseerde verlichting. <ol><li> Kies de 488 spoor en over te schakelen naar &quot;TIRF&quot; met de EPI / TIRF knop. </li><li> Kies &quot;continu&quot; overname. </li><li> Pas thij-TIRF gebaseerde verlichting slider. Opmerking: TIRF wordt bereikt wanneer er een plotselinge verduistering van de achtergrond en het model kan worden gericht in een vlak 18. Als er nieuwe functies worden duidelijk via scherp te stellen in het monster, de invalshoek is te laag, want in TIRF is er slechts een vlak van focus. </li><li> Controleer de TIRF hoek met de 561 track met de 405 nm laser &quot;off.&quot; </li><li> Draai de 405 nm laser terug &quot;aan&quot; voor het starten van een PALM experiment. </li></ol></li><li> Verzamelen PALM gegevens. <ol><li> Hit &quot;start experiment.&quot; Opmerking: Indien gewenst, opent u het tabblad &quot;online processing opties&quot; en vink &quot;online verwerking PALM&quot; en &quot;Fit Gauss2D&quot; (voordat het experiment) om het beeld gereconstrueerd PALM bewaken tijdens het verzamelen van ruwe data. Hierdoor wordt de beoordeling van de kwaliteit van de gegevens en dus de waarde van aanhoudende relatief tijdrovende gegevensverzameling te vergemakkelijken. </li><li> Visueelmonitoren photoconversion. </li><li> Verhoog de intensiteit van de 405 nm (photoconverting) laser wanneer Dendra2 photoconversion afneemt (meestal na de overname van ~ 10.000 ruwe beelden). </li><li> Blijven het experiment als photoconversion toeneemt. Anders stopt het experiment (zonder verlies van gegevens) door op de &quot;stop&quot; huidige stap knop. </li><li> Sla de beelden bij het verzamelen van gegevens is voltooid (na ~ 15 min). </li></ol></li></ol> 3. Beeldverwerking, Display, en Analyse <ol><li> Bij het ontbreken van online verwerking, proces rauwe beelden die zijn opgeslagen op schijf. <ol><li> Klik op het tabblad bewerken, opent u het tabblad methode, en selecteer &quot;PALM.&quot; </li><li> Kies &quot;PALM&quot; weer uit de vier subopties. </li><li> Ga naar het menu Bestand, open en bekijk het dossier van belang, en druk &quot;te selecteren.&quot; </li><li> Hit &quot;van toepassing.&quot; Opmerking: Dit zal piek / fluorophore bevinding en piek lokalisatie starten met standaard options. Indien nodig pieken ook kunnen worden gegroepeerd via het tabblad &quot;PAL-groep&quot;. Groepering kent pieken die voorkomen in meerdere opeenvolgende frames om een ​​enkel molecuul als de piek coördinaten voldoende vergelijkbaar zijn. Daarnaast kunnen de gegevens worden gecorrigeerd voor steekproef drift gebruik modelgebaseerde drift alignment optie van de software. </li></ol></li><li> Filteren slecht gelokaliseerde en slecht bemonsterd componenten in de piek-gelokaliseerde gegevens. <ol><li> Gooi fluoroforen met lokalisatie precisie, σ,&gt; 35 nm, waarbij de &quot;PAL-Filter&quot; tool. </li><li> Gooi fluoroforen in gebieden waar de gemiddelde afstand tussen de pieken, d, is te groot om blaasjes met een diameter van, D. lossen <ol><li> Pak de gemiddelde lokalisatie precisie, σ, uit de lokalisatie precisie histogram. </li><li> Bereken een maximaal aanvaardbare waarde voor d op basis van σ, en de Shannon-Nyquist criteron 19, zoals belichaamd in de resolutiebenadering 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2. </li><li> Stel de drempel in de &quot;Verwijder PALM uitschieters&quot; tool om pieken omringd door minder dan πD 2 / (4d 2) verwijderen buren binnen een straal van D / 2. </li></ol></li><li> Zetten de verwerkte gegevens PALM PALM afbeelding met behulp van de &quot;PAL-Rendering&quot; tool een in; zie figuur 1. </li><li> Kwantificeren maten en scheidingen door te kiezen voor de &quot;Profile&quot;-functie. <ol><li> Controleer de bijbehorende lijn en tafel opties, en trek een lijn langs de gewenste richting in het beeld. </li><li> Kwantificeren diameters door het bepalen van de volledige breedte op halve maximale intensiteit. </li><li> Kwantificeren scheidingen door het bepalen van de piek-tot-piek afstanden van intensiteit profielen. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li>
<li>Combs, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%3A+a+concise+guide+to+current+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2010).</li>
<li>Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cell+structure+and+function+with+point-localization+superresolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging.</a> Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).</li>
<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , Garland Science Publishing. (2007).</li>
<li>Bury, L. A., Sabo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+trafficking+of+synaptic+vesicle+and+active+zone+proteins+prior+to+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation.</a> Neural Dev. 6, 24 (2011).</li>
<li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activity-dependent+secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+from+axon+and+dendrite%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite.</a> J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).</li>
<li>Tao-Cheng, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+localization+of+active+zone+and+synaptic+vesicle+proteins+in+a+preassembled+multi-vesicle+transport+aggregate%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate.</a> Neuroscience. 150, 575-584 (2007).</li>
<li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembling+the+presynaptic+active+zone%3A+a+characterization+of+an+active+zone+precursor+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle.</a> Neuron. 29, 131-143 (2001).</li>
<li>Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+presynaptic+active+zones+from+cytoplasmic+transport+packets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets.</a> Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).</li>
<li>Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis.</a> Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).</li>
<li>Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+29+kDa+intracellular+chloride+channel+p64H1+is+associated+with+large+dense-core+vesicles+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> Biotechniques. 42, (2007).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Scalettar, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindered+submicron+mobility+and+long-term+storage+of+presynaptic+dense-core+granules+revealed+by+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking.</a> Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat Methods. 6, 21-23 (2009).</li>
<li>Helander, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+binding+in+brain+and+kidney%3A+A+kinetic+study+of+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation.</a> Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+and+calibration+of+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems.</a> Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).</li>
<li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+in+the+presence+of+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IRE%22%5BJournal%5D)">Communication in the presence of noise.</a> Proc IRE. 37, 10-21 (1949).</li>
<li>Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh+resolution+imaging+of+biomolecules+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Zhong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivated+localization+microscopy+%28PALM%29%3A+an+optical+technique+for+achieving+%7E10-nm+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Lochner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+copackaging+and+cotransport+yields+postsynaptic+colocalization+of+neuromodulators+associated+with+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity.</a> Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).</li>
<li>Geisler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drift+estimation+for+single+marker+switching+based+imaging+schemes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Drift estimation for single marker switching based imaging schemes.</a> Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

PALM en aanverwante super-resolutie fluorescentie microscopie technieken zijn onlangs naar voren gekomen als een waardevolle aanvulling om beter gevestigde vormen van optische microscopie en elektronenmicroscopie (EM) 22-24. Positieve eigenschappen van PALM omvatten relatief eenvoudige monstervoorbereiding en minimale steekproef verstoring. In principe PALM ook worden gebruikt om levende cellen te bestuderen. Waarschijnlijk de belangrijkste negatieve eigenschap van PALM is tijdrovend data-acquisitie, die aanz...

Een aantal cellulaire processen afhankelijk nauwkeurige en efficiënte vesikel gemedieerde transport van biomoleculen specifieke subcellulaire bestemmingen. Een prominent voorbeeld is synaptische vergadering, die wordt voorafgegaan door lange varieerden,-blaasje bemiddelde levering van synaptische bestanddelen van sites van biogenese in de neuronale soma om potentieel distale pre-en postsynaptische plaatsen 1. Fluorescentie microscopie is een krachtige en populaire methode van de bestudering blaasje mensenhandel. Sterke punten van de techniek zijn onder meer de sensitiviteit, specificiteit, en compatibiliteit met live beeldvorming 2. Helaas, tot voor kort, is de techniek te lijden van een grote zwakte, buigingsbegrensd resolutie 2, die studies van structuren met afmetingen kleiner dan ~ 250 nm belemmert. Onlangs, laterale resolutie in fluorescentie microscopie overtroffen de diffractie barrière met de introductie van de super-resolutie fluorescentie microscopy technieken, zoals PALM 3. De laterale resolutie van PALM, tientallen nanometers, is uitermate geschikt voor de studie van blaasjes, die dimensies die doorgaans variëren van ~ 50-250 nm 4 hebben. Het is nu dus mogelijk om fluorescentie te gebruiken, met zijn talloze krachten, om een ​​spectrum van eerder ontoegankelijke attributen van vesicles, waaronder aspecten van de handel naar specifieke subcellulaire locaties helderen. PALM is niet triviaal te implementeren en succesvolle strategieën vaak moet worden afgestemd op het type systeem onder studie. Hier beschrijven we hoe PALM studies van vesiculaire structuren voeren, en we de doelmatigheid van onze aanpak bij DCVS in hippocampale neuronen. In het bijzonder, maken we gebruik van PALM om de hypothese te staven dat de handel van DCVS om synapsen in de hippocampus neuronen wordt gemedieerd door DCV clusters 5-8. -Cluster gemedieerde transport van blaasjes aan synapsen in het ontwikkelen van neurons is een intrigerende mogelijkheid, omdat het snelle synaptische stabilisatie en assemblage 9,10 kan vergemakkelijken. Voorstanders van geclusterde handel in DCVS noemen de grote schijnbare grootte van extrasynaptic fluorescerende puncta herbergen exogene DCV lading als bewijs dat clustering 6. Echter, deze puncta verschijnen in beelden geproduceerd met buigingsbegrensde fluorescentiemicroscopie technieken die niet geschikt zijn onderscheidende maat effecten van diffractie van die welke uit clustering. Om dit probleem op te lossen, hebben we verzameld conventionele groothoek fluorescentie en PALM beelden van de hippocampus neuronen die hersenschimmen gericht op DCVS. Analyse van deze beelden bleek dat&gt; 92% van de vermeende extrasynaptic DCV clusters in conventionele beelden worden opgelost als 80 nm (individuele DCV-en kleinbedrijf) 11 puncta in PALM beelden. Zo, deze gegevens grotendeels vervalt de clustering hypothese zoals toegepast op DCVS in ontwikkelingslanden HippocaMpal neuronen.

<table><tbody><tr><td>Zeiss PALM</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Elyra PS.1</td><td>Met Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software en fluorescentie filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8501</td><td></td></tr><tr><td>Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0059095</td><td></td></tr></tbody></table>

super-resolution imaging van neuronal dense-core blaasjes

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

<html> Detectie van fluorescentie vormt de basis voor vele grote schaal gebruikt en snel voortschrijdende microscopie technieken die in de moderne biologische en medische toepassingen. Sterke punten van fluorescentie zijn onder meer de sensitiviteit, specificiteit, en compatibiliteit met live beeldvorming. Helaas, conventionele vormen van fluorescentie microscopie lijden aan een grote zwakte, buigingsbegrensd resolutie in het beeldvlak, die studies van structuren met afmetingen kleiner dan ~ 250 nm belemmert. Onlangs is deze beperking overwonnen door de invoering van superresolutie fluorescentie microscopie technieken, zoals fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM). In tegenstelling tot de conventionele tegenhangers, kan PALM beelden te produceren met een laterale resolutie van tientallen nanometers. Het is nu dus mogelijk om fluorescentie te gebruiken, met zijn talloze krachten, om een ​​spectrum van eerder ontoegankelijke attributen van cellulaire structuur en organisatie helderen. _content &quot;&gt; Helaas, PALM is niet triviaal te implementeren en succesvolle strategieën vaak moet worden afgestemd op het type systeem onder studie. In dit artikel laten we zien hoe een kleur PALM studies van vesiculaire structuren te implementeren in vaste, gekweekte neuronen. PALM is bij uitstek geschikt om de studie van blaasjes, die dimensies die doorgaans variëren van ~ 50-250 nm. Belangrijke stappen in onze aanpak zijn hebben etikettering neuronen met photoconvertible (groen naar rood) hersenschimmen van blaasje lading, het verzamelen van een klein aantal RAW-afbeeldingen met een super-resolutie microscopie-systeem, en de verwerking van de ruwe beelden op de foto om een ​​hoge-resolutie PALM produceren. we de effectiviteit van onze aanpak aan te tonen ook door de presentatie bijzonder goed opgelost beelden van dense-core blaasjes (DCVS) in gekweekte hippocampale neuronen, die weerleggen de hypothese dat extrasynaptic handel in DCVS grotendeels wordt gemedieerd door DCV clusters.

Figuur 1 toont een eindproduct van beeldvorming en verwerking. In dit beeld Palm, zijn laterale coördinaten van gelokaliseerde fluoroforen getoond met behulp van het zwaartepunt weergavemodus, en de super-resolutie afbeelding van de bijbehorende DCV wordt weergegeven met behulp van de Gauss weergavemodus. Figuur 2A toont analoog groothoek en PALM beelden van de soma en proximale processen van een acht dagen in vitro hippocampus neuron uiten tPA-Dend...

We beschrijven hoe de uitvoering fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM)-gebaseerde studies van blaasjes in vaste, gekweekte neuronen. Belangrijke onderdelen van ons protocol etiket voorzien blaasjes met photoconvertible hersenschimmen, het verzamelen van een klein aantal RAW-afbeeldingen met een super-resolutie microscopie-systeem, en de verwerking van de ruwe beelden op de foto om een ​​super-resolutie te produceren.

Super-resolution Imaging van Neuronal Dense-core Blaasjes

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Het algemene doel van de volgende procedure is om superresolutie-fluorescentiebeelden te verkrijgen die belangrijke aspecten van de vesikelorganisatie verduidelijken bij een resolutie die anders onbereikbaar zou zijn met fluorescentiemicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst hippocampale neuronen te transfecteren met DNA dat codeert voor fotoconverteerbare chimera's van vesikelvracht. In de tweede stap worden schaars bemonsterde ruwe beelden verzameld met het superresolutie-microscopiesysteem.Vervolgens worden de ruwe afbeeldingen verwerkt om een superresolutie-afbeelding te genereren. In de laatste stap worden de gegevens gekwantificeerd om de organisatie van de vesicles te verduidelijken. Uiteindelijk kunnen lijnprofielen van de puncta-intensiteit worden gebruikt om de scheiding tussen de vesicles te vergelijken met de breedte van de vesicles, om zo via deze procedure te bepalen of de vesicles dicht genoeg bij elkaar liggen om een cluster te vormen.Single color photo activated localization microscopy of PaLM kan worden gebruikt om de organisatie van organellen in de meeste typen gekweekte cellen te bestuderen. Om het superresolutie-beeldvormingssysteem voor beeldacquisitie op te starten, begint u met het inschakelen van de stroomtoevoer naar de booglamp. Zet vervolgens de schakelaars van de systeem-pc en de componenten op de afstandsbediening voor de stroomvoorziening om.Zet de schakelaar op 'on' zodra de tablet voor de microscoopbesturing is opgestart, zet de computer aan en start de software. Vergroot het venster met de opstartstatus om te controleren of het systeem normaal laadt en kies de optie 'start system' in het inlogscherm. Open de voor- en bovenpanelen van de lasersbeveiligingskast en kantel de arm voor het doorgelaten licht om toegang te krijgen tot de tafel en de objectieven, zodat het monster voor visualisatie gepositioneerd kan worden.Breng vervolgens olie aan op de alpha plan APO Chromat 100 x totaal interne reflectie, fluorescentie- of turf-objectief. Kies daarna een objectief met een lage vergroting voor de initiële focusstap. Plaats nu het monster op de tafel en breng het objectief naar het monster toe.Controleer de lenspositie met de X, Y, Z-functie van de bedieningstablet. Stop wanneer de lens zich in de buurt van het brandpunt bevindt. Visualiseer het monster en stel de focus nauwkeurig af.Laat de lichtarm zakken en sluit de toegangspanelen volledig. Klik vervolgens in het tabblad 'locate' op het symbool voor oculair uitbreiding. Om een schema van het lichtpad weer te geven, selecteert u 'trans on' en controleert u of het schema aangeeft dat het doorgelaten licht van de lamp op het monster valt. Kijk door de oculairs en stel de cellen scherp met behulp van de bedieningstablet als gids.Kies vervolgens voor gereflecteerd licht en het filter dat geschikt is voor het waarnemen van de groene emissie van den twee, om de cellen te identificeren die DRA twee tot expressie brengen. Scan het dekglas met gereflecteerd licht van lage intensiteit tot er een gezonde, heldere cel is gevonden, en stel vervolgens de software in voor het verkrijgen van de palm-gegevens. Schakel over naar het acquisitietabblad en gebruik de experimentmanager om de juiste experimentele configuratie voor palm-acquisitie te laden.Wanneer het pop-upmenu verschijnt met een vraag over het inschakelen van de lasers, klik dan op 'yes' en stel vervolgens de afbeelding van de cel scherp op het cameravlak. Selecteer alleen het 488-kanaal. Pas de acquisitieparameters aan, zoals de E-M-C-C-D gain, en kies vervolgens voor continue acquisitie.Pas vervolgens het display aan naar de gewenste helderheid en beweeg het objectief totdat het beeld op het scherm scherp is. Klik vervolgens op de snap-knop en sla het beeld op om een conventionele wide-field afbeelding vast te leggen. Om de turf-gebaseerde verlichting op het 488-kanaal in te stellen, selecteert u turf via de epi-turf knop.Om de turf-gebaseerde verlichting te optimaliseren, kiest u voor continue acquisitie en stelt u de hoek van de turf-lamp aan tot de achtergrond plotseling donkerder wordt en het specimen in slechts één vlak kan worden gefocust. Schakel over naar het 561-kanaal met de 405 nanometer laser uit. Stel de E-M-C-C-D gain in op ongeveer 200 en de belichtingstijd op ongeveer 50 milliseconden.Kies het emissiefilter dat in het rood doorlaat en stel de laserintensiteit in op ongeveer 40%. Controleer de turf-hoek voor het 561-kanaal. Om de achtergrond te verminderen, belicht het monster totdat de achtergrond vervaagt. Gebruik het 561-kanaal waarbij alleen de 561-laser is geactiveerd.Om de PALM-gegevens te verzamelen, schakelt u de 405 nanometer laser voor het 561-kanaal in en stelt u de intensiteit van de 405 laser in op ongeveer 0,01%. Om het berekende PALM-beeld tijdens de acquisitie te monitoren, klapt u het menu met online verwerkingsopties uit en vinkt u online processing palm aan om met de standaardparameters te verwerken. Klik op start experiment om de acquisitie te beginnen; monitor tijdens de gegevensverzameling visueel de fotoconversie en verhoog de intensiteit van de 405 nanometer fotoconverteringslaser. Wanneer de fotoconversie begint af te nemen.Wanneer de fotoconversie niet langer toeneemt na een verhoging van de laserintensiteit, klik dan op finish current step. Om het experiment te beëindigen, slaat u het bestand op. Om de opgeslagen beelden te verwerken, klikt u op het tabblad processing, vouwt u het menu method uit en vouwt u het submenu palm uit.Kies opnieuw 'palm' uit de vier subopties. Selecteer de juiste afbeelding zodat deze in het weergavevenster verschijnt. Vouw de methodeparameters uit en klik op selecteren om de afbeelding in te voeren, vouw het instellingsveld uit en kies 'default' om piekdetectie en lokalisatie uit te voeren met de standaardopties.Klik op 'apply' (toepassen) in het tabblad 'processing' om de palm-afbeelding te berekenen; deze verschijnt in een apart tabblad in het weergavevenster om slecht bemonsterde componenten in de data weg te filteren. Gebruik de Nyquist-bemonsteringstheorie en de tool 'remove palm outliers' om pieken te verwijderen in regio's waar de gemiddelde afstand tussen pieken, kleine letter d, te groot is om een blaasje met diameter, hoofdletter D, op te lossen. Klik, terwijl de palm-afbeelding in het weergavevenster staat, op 'select' om de afbeelding in te voeren en klik op 'apply'. De nieuwe afbeelding verschijnt in een apart tabblad in het weergavevenster om slecht gelokaliseerde flora.Fours weg te filteren.Ga naar het tabblad PAL-filter en beperk de geaccepteerde flora. Vier lokalisatieprecisies tot een sigma van minder dan 35 nanometers. Om een weergavemodus voor het PAL-beeld te kiezen, gaat u naar het tabblad PAL-rendering en selecteert u een pixelresolutie en de gewenste weergavemodus.In deze afbeelding wordt een representatief PaLM-eindproduct van de beeldvorming en verwerking van een neuronale dense core-vesikel (DCV) in rood getoond. De laterale coördinaten van de gelokaliseerde clusters in wit worden weergegeven met de Centro-weergavemodus en de superresolutie-afbeelding van de bijbehorende vesikel wordt weergegeven met de Gaussian-weergavemodus. In deze tweede figuur worden analoge widefield-beelden in groen en PaLM-beelden in rood getoond van het soma en de proximale uitlopers van een hippocampaal neuron (acht dagen in vitro) dat tpa-danger 2 tot expressie brengt.Belangrijke kenmerken van de beelden zijn de uitgebreide één-op-één correspondentie en overlap in geel tussen de puncta en de conventionele beelden en de palm-beelden. De aanzienlijk kleinere grootte van de palm-puncta en de incidentele resolutie van een enkel widefield-punctum in meerdere palm-puncta. Hier is een palm-beeld van D cvs langs een deel van een uitloper van een tweede hippocampaal neuron dat tpa tot expressie brengt.DENDRA twee wordt getoond. Let op de kleine diameter en het homogene uiterlijk van de puncta en de zeldzame waarneming van dicht bij elkaar gelegen puncta, die putatieve DCV-clusters vertegenwoordigen. In deze laatste figuur wordt een eenvoudige kwantitatieve methode beschreven om te bepalen of twee of meer cv's dicht genoeg bij elkaar liggen om een cluster te vormen.Lijnprofielen van de puncta-intensiteiten worden gegenereerd zoals weergegeven in de grafieken, die vervolgens kunnen worden gebruikt om de DCV-scheiding en de DCV-breedte te kwantificeren. Als de scheiding de breedte aanzienlijk overschrijdt, maken de DCV's geen contact met elkaar. Wanneer de scheiding daarentegen ongeveer gelijk is aan de breedte, kunnen de CV's op basis van deze criteria in contact zijn; de CV's in deze afbeelding werden geclassificeerd als niet in contact, terwijl de CV's in deze afbeelding werden geclassificeerd als in contact na het volgen van deze procedure.Andere methoden, zoals twee-kleuren-PALM, kunnen worden gebruikt om de relatieve lokalisatie van verschillende structuren te bestuderen.

super-resolution-imaging-of-neuronal-dense-core-vesicles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Live-cell imaging is met name van nut bij het bestuderen van de dynamiek van organel mensenhandel. Hier beschrijven we een protocol voor live beeldvorming van dense-core blaasjes in gekweekte neuronen met behulp van wide-field fluorescentie microscopie. Dit protocol is flexibel en kan worden aangepast aan image andere organellen, zoals mitochondriën, endosomen, en peroxisomen.

Live-Imaging van dicht-core Blaasjes in het jeugdwerk Gekweekte hippocampale neuronen

Multifoton microscopie van hele muis organen is mogelijk door de clearing optisch orgaan voor beeldvorming, maar niet alle protocollen behouden het fluorescerende signaal van fluorescerende eiwitten. Met behulp van een optische clearing methode met ethanol op basis van uitdroging en benzylalcohol: benzylbenzoaat clearing, tonen we een hoge resolutie multifoton beelden van de hele hersenen van muizen uiten YFP.

Multiphoton Microscopie van Gewist Mouse Brain uiten YFP

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

We presenteren een protocol voor het gebruik van Cox Golgi-kleuring werkwijze dikke hersenpreparaten, teneinde neuronen met lange dendritische bomen opgenomen in één weefselmonsters zichtbaar. Twee varianten van dit protocol worden ook getoond dat cresyl violet tegenkleuring, en het bevriezen van onbewerkte hersenen voor langdurige opslag omvatten.

Imaging Neuronen binnen Dik Brain af met de Golgi-Cox Method

Hier presenteren we een microscopie gebaseerde protocol voor hoge resolutie beeldvorming en een drie-dimensionale reconstructie van de muis neurovasculaire eenheid en bloed - hersen barrière met behulp van vrij zwevende secties van de hersenen. Deze methode zorgt voor de visualisatie, analyse en kwantificering van intracellulaire organellen op de BBB.

Hoge resolutie Confocal beeldvorming van de bloed - hersen barrière: Imaging, 3D reconstructie en kwantificering van Transcytosis

Volume is een belangrijke parameter over fysiologische en pathologische eigenschappen van cellen. Beschrijven we een fluorescerende uitsluiting methode waardoor volledige-veld meting van in vitro neuronale volume met sub Micrometrische axiale resolutie die nodig zijn voor de analyse van neurites en dynamische structuren geïmpliceerd in neuronale groei.

Hoge resolutie Volume Imaging van neuronen met de uitsluiting van het gebruik van fluorescentie methode en gewijd Microfluidic apparaten

Dit protocol laat zien hoe je microscopie met superresolutie gebruiken om eiwitcolokalisatie te bestuderen in primaire neuronale culturen.

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Neuronale dendritische morfologie ligt vaak ten grondslag aan functie. Inderdaad, veel ziekteprocessen die de ontwikkeling van neuronen beïnvloeden, manifesteren zich met een morfologisch fenotype. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en krachtige methode voor het analyseren van intacte dendritische priëlen en hun bijbehorende stekels.

Beeldvorming en kwantificering van intacte neuronale dendrieten via CLARITY Tissue Clearing

Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) wordt gebruikt om de typische diffractielimiet van lichtmicroscopie te omzeilen en exosomen op nanometerschaal te bekijken. Het kan worden gebruikt in zowel twee als drie dimensies om exosomen te karakteriseren.

Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie van extracellulaire blaasjes in drie dimensies

Het protocol biedt een gedetailleerde methode van neuronale beeldvorming in hersensegmenten met behulp van een weefselzuiveringsmethode, ScaleSF. Het protocol omvat hersenweefselvoorbereiding, weefselverheldering, behandeling van gewiste plakjes en confocale laserscanmicroscopie beeldvorming van neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus.

Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen

Leer superresolutiebeeldvorming van dichte-kernblaasjes in neuronen met PALM-microscopie. Deze methode onthult vesikelorganisatie en clustering op nanometerschaal voor inzicht in synaptische functie.

Super-resolution Imaging van Neuronal Dense-core Blaasjes

Meer video's verkennen