Het gebruik van gaschromatografie tot veranderingen in de samenstelling van vetzuren Analyseer in Rat leverweefsel tijdens de zwangerschap

Het algemene doel van deze procedure is om de vetzuursamenstelling van de lever te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst een monster van de lever af te wegen en het te homogeniseren. De tweede stap is om alle lipiden uit het gehomogeniseerde levermonster te extraheren.

Vervolgens worden de individuele lipideklassen zoals cholesterolesters gescheiden met behulp van vaste fase-extractie. De laatste stap is ificatie en derivatisering van de lipideklassen in vetzuurmethylesters. Uiteindelijk wordt gaschromatografie gebruikt om te laten zien hoe de vetzuursamenstelling van weefsels kan veranderen na nutritionele interventie of kan worden beïnvloed door veranderingen in fysiologische toestand zoals zwangerschap.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de vetzuursamenstelling van weefsels, kan deze ook worden toegepast op andere monstersoorten zoals olie, zaden en voedingsmiddelen. Over het algemeen kunnen gebruikers die nieuw zijn met deze techniek worstelen, omdat sommige delen van het protocol handmatige vaardigheid vereisen en oefening nodig hebben, zoals de herhaalde verzameling van bovenste en onderste fasen. Het demonstreren van de procedure zullen Hena, Fisk en Annette West zijn, een technicus en promovendus uit ons laboratorium.

Snijd eerst ongeveer 100 milligram bevroren lever en weeg het weefsel. Plaats het weefsel in een plastic buis in een ijsemmer en voeg 0,5 milliliter ijskoud 0,9% natriumchloride toe. Homogeniseer vervolgens het weefsel en breng het over in een glazen schroefdopbuis.

Gebruik nog eens 0,3 milliliter 0,9% natriumchloride om eventueel overgebleven weefsel over te brengen naar de glazen schroefdopbuis. Voeg vervolgens 100 microgram cholesterol heta dechen-standaard opgelost in twee tot één, droog chloroform naar methanol toe aan de buis, gevolgd door een extra vijf milliliter van dezelfde oplosmiddeloplossing bevattend 50 milligram per liter butyleerde hydroxytolueen. Na het toevoegen van één milliliter een molaire natriumchloride, sluit de buis af en meng het monster grondig door te vortexen tot het er uniform uitziet.

Centrifugeer vervolgens het monster bij 1000 keer G gedurende 10 minuten met lage breking bij kamertemperatuur. Wanneer u klaar bent, verzamelt u de onderste fase met een glazen past her-pipet en brengt u deze over naar een nieuwe glazen schroefdopbuis. Droog vervolgens het monster onder stikstof bij 40 graden Celsius.

Op dit punt sluit u de SPE-tank aan op een vacuümpomp en plaatst u een amino propyl silica SPE-cartridge op de tank. Plaats een nieuwe glazen schroefdopbuis met de label TAG en CCE in de tankrek onder de kolom om de eerste fractie te verzamelen. Los het totale lipide-extract op in één milliliter droog chloroform en meng het monster door te vortexen.

Breng vervolgens het monster over naar de kolom met behulp van een glazen pastpijp en laat het vloeistof onder invloed van de zwaartekracht in de glazen schroefdopbuis druppelen. Wanneer het vloeistof niet langer van de kolom druppelt, verwijdert u de resterende vloeistof door vacuüm. Eluteer vervolgens de TAG- en CE-fractie door de kolom twee keer te wassen met één milliliter droog chloroform onder vacuüm.

Wanneer alle vloeistof uit de kolom is gelopen, droogt u de TAG- en CE-fractie onder stikstof bij 40 graden Celsius. Plaats een nieuwe amino propyl silica SPE-cartridge op de SPE-tank en plaats een glazen schroefdopbuis in de tanklade onder de cartridge om het afval te verzamelen. Was de kolom drie keer onder vacuüm met één milliliter droog hexaan.

Nadat u het vacuüm uitschakelt, was de kolom met een laatste milliliter H hexaan onder invloed van de zwaartekracht. Nadat u het afvalbuisje hebt vervangen door een nieuwe glazen schroefdopbuis met het label ce, lost u de gedroogde TAG- en CE-fractie op in één milliliter droog hexaan en meng het monster door te vortexen. Breng vervolgens het monster over naar de kolom met behulp van een glazen pass or-pijp en laat het vloeistof onder invloed van de zwaartekracht door de kolom druppelen.

Wanneer het vloeistof niet langer van de kolom druppelt, verwijdert u de resterende vloeistof door vacuüm onder vacuüm. Was de kolom twee keer met één milliliter droog hexaan om de CE te elueren en droog de verzamelde fractie onder stikstof bij 40 graden Celsius. Voeg vervolgens 0,5 milliliter droog tolueen toe aan de gescheiden CE-fractie en meng het monster door te vortexen.

Voeg één milliliter van een eerder bereid methyleringsreagens toe aan het monster opgelost in droog tolueen. Sluit vervolgens de buis stevig af en verwarm het monster voorzichtig gedurende twee uur op 50 graden Celsius. Zodra de monsters zijn afgekoeld tot kamertemperatuur, voegt u één milliliter neutralisatieoplossing toe.

Voeg vervolgens één milliliter droog hexaan toe aan het monster. Na het vortexen centrifugeert u de monsters bij 250 keer G gedurende twee minuten met lage breking bij kamertemperatuur. Wanneer u klaar bent, verzamelt u de bovenste fame-fase en brengt u deze over in een nieuwe niet-schroefdopglasbuis. Droog het verzamelde fame-monster onder stikstof bij 40 graden Celsius.

Nadat u een afvalbuis in de SPE-tank en een silicagel-SPE-cartridge op de tank hebt geplaatst, wast u de kolom drie keer met één milliliter droog hexaan onder vacuüm en één milliliter droog hexaan onder invloed van de zwaartekracht. Na verwijdering van de afwas. Plaats een nieuw afvalbuis in de tank en los het CE-fame-monster op in één milliliter droog hexaan.

Nadat u het monster door vortexen hebt gemengd, brengt u het over naar de kolom met behulp van een glazen pass or-pijp. Zodra het vloeistof onder invloed van de zwaartekracht door de kolom is gedreven, wast u de kolom drie keer met één milliliter hexaan onder vacuüm. Verwijder vervolgens de afwas en plaats een nieuwe niet-schroefdopbuis met het label CE-fame in de tank.

Elueer de CE-fame-fractie met twee milliliters van 95 tot