Schaalbare High Throughput Selectie Van faagweergegeven Synthetische Antibody Bibliotheken
17 januari 2015
Een werkwijze wordt beschreven visuele begeleiding voor het uitvoeren schaalbare, high throughput selecties van faagweergegeven combinatoriële synthetische antilichaam bibliotheken tegen honderden antigenen tegelijkertijd. Met behulp van deze parallelle aanpak, hebben we geïsoleerd antilichaam fragmenten die een hoge affiniteit en specificiteit vertonen voor diverse antigenen die functioneel in standaard immunoassays zijn.
Het algemene doel van deze schaalbare procedure is om specifieke en hoogaffine fab-faagklonen te isoleren uit een faag-weergegeven bibliotheek met behulp van een hoogdoorvoerbenadering die parallelle selectie mogelijk maakt tegen honderden antigeen-doeldomeinen. Dit wordt bereikt door eerst gezuiverde antigeendomeinen in microputjes te immobiliseren. De volgende stappen zijn het blootstellen, vastleggen, vrijgeven en amplificeren van fab-faagklonen die specifiek binden aan geïmmobiliseerd antigeen in microputjes in opeenvolgende selectierondes.
Tijdens dit proces wordt de effectiviteit van de selectie bijgehouden met behulp van gepoolde methoden bij elke stap. De laatste stap is het evalueren van de specificiteit, affiniteit en/of activiteit van de geïsoleerde fab-klonen. Uiteindelijk worden specifieke hoogaffine fab-fragmenten tegen grote aantallen antigenen geïsoleerd in parallel, waardoor de generatie van antilichamen mogelijk wordt die nuttig zijn voor de analyse van hele klassen structureel of functioneel verwante eiwitten.
De belangrijkheid van deze methode ligt in dat deze een alternatief biedt dat kan helpen om de beperkingen te overwinnen en het tempo van conventionele antilichaamontwikkelingstechnologieën in zowel een academisch als een industrieel laboratorium te versnellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele antilichaamontwikkelingstechnieken zoals hybridoma is dat het geen gebruik van dieren vereist. Het kan worden gebruikt voor vrijwel elk eiwit, inclusief toxische en niet-immuungenetische eiwitten.
Zoals we zullen zien, kan het gemakkelijk worden geparalleliseerd en levert het uiteindelijk hernieuwbare recombinante DNA op dat codeert voor een hoogaffine antilichaam dat specifiek is voor een bepaald antigeen en functionele en standaard immunoassays in slechts zes tot acht weken. Gezien het belang van antilichamen in onderzoek in de biogeneeskunde, zagen we een kans om antigeengeneratie en antilichaamselectie en -identificatie aan te passen en te schalen naar een hoogdoorvoerbenadering, met behoud van toegankelijkheid voor laboratoria die variëren in grootte en beschikbare middelen. Op de ochtend van de dag van faagselectie, kies een enkele kolonie van T één faag resistente e coli-cellen.
Voeg het toe aan een milliliter van twee yt-media met tetracycline bij 50 microgram per milliliter. Laat de kolonie incuberen met schudden bij 200 RPM in een 2,5 centimeter orbitale shaker. Zodra de groei van de cultuur visueel zichtbaar is, breng de cellen over naar het vereiste volume media gesupplementeerd met tetracycline.
Er moet genoeg zijn voor 100 microliter per selectieputje, of ongeveer 10 milliliter per 96. Welp plate. Breid aliquots van de cultuur uit naar zowel carbon penicilline als canin gesupplementeerde media. Deze culturen zorgen voor bescherming tegen pre-infectie in de cellen die worden gebruikt voor amplificatie.
Wanneer de optische absorptie van de cultuur 0,4 tot 0,8 is bij 595 nanometer. Na vijf tot zeven uur zijn de cellen klaar om toe te passen op de antigeenplaten. Om de gewenste dekking van de bibliotheek voor dit protocol te garanderen, bereid voldoende replica antigeenplaten en niet-specifieke controle-eiwitplaten voor.
Met behulp van de weergegeven berekeningsdetails worden de details in de tekstprotocol gegeven. Na overnachtelijke immobilisatie van doel- en niet-specifieke controle-eiwitten, verwijder de eiwit-oplossing van de plaat. Voeg 200 microliter blokkeringsbuffer toe en blokkeer gedurende één uur met schudden en was de plaat vier keer voordat u de faagbibliotheek toevoegt terwijl de cellen groeien.
Op de dag van faagselectie, verwijderen we niet-specifiek of de tag specifiek bindende faag-weergegeven FAB-klonen uit de bibliotheek door 100 microliter faagbibliotheek over te brengen naar de negatieve selectieplaten voor extra negatieve selectie. Verwijder tag-bindende faag door een overmaat aan oplosbaar affiniteitslabel toe te voegen. Om dit te doen, voegt u een 10 micromolar eindconcentratie van oplosbaar GST toe aan elk.
Incubeer de platen vervolgens een tot twee uur op een shaker bij kamertemperatuur. Om de doel-eiwitplaat voor te bereiden, zuigt u de eiwit-oplossing van de plaat af, voegt u 200 microliter blokkeringsbuffer toe en blokkeert u gedurende één uur met schudden en wast u vier keer voordat u de faagbibliotheek toevoegt. Na de incubatie, verzamelt u de faag snat van de platen.
Met behulp van een 96-kanaals vloeistofvaardigheid, brengt u de faagsupinaat over naar antigeen-gecoate platen. Bewaar de platen vervolgens een tot twee uur op een shaker bij kamertemperatuur. Na de incubatie, verwijdert u de ongebonden faag door de putjes acht tot vijftien keer te wassen met behulp van PT-buffer.
Dit kan handmatig worden gedaan of met een automatische plaatwasser. Verwijder dan net voordat u de cellen toevoegt, alle overtollige wasbuffer wanneer de cellen en antigeenplaten klaar zijn. Eluteer de faag door 100 microliter groeiende cellen toe te voegen aan elke put en laat de platen gedurende een half uur bij 37 graden Celsius incuberen.
De eerste paar rondes van selectie zullen naar verwachting geen significante verrijking produceren, maar kwantificering van output faag-titer kan de illusie van de minimale faagconcentraties verzekeren die nodig zijn voor succesvolle selecties. Om dit te doen, kan een aliquot van cellen worden verwijderd voor de toevoeging van helper faag om de faagopbrengst te verkleinen door seriële verdunningen van de cellen op antibioticum-gesupplementeerde agarplaten te bereiden en te plateren. Na een half uur incubatie, voegt u M 13 K oh zeven helper faag toe aan elke put voor een concentratie van 10 miljard kolonievormende eenheden per milliliter.
Laat de platen nog 45 minuten incuberen, deze keer met schudden bij 200 RPM. Breng de cellen vervolgens over naar een 96-welp diepe welp-blok met een V-bodem met 1,2 milliliter gesupplementeerd twee YT-media per put. Laat de diepe welp-platen overnacht incuberen bij 37 graden Celsius met schudden bij 200 RPM de volgende dag.
Pellet de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een schaalbare methode voor het isoleren van antibody-fragmenten met een hoge affiniteit uit phage-display bibliotheken tegen meerdere antigenen tegelijkertijd. De aanpak maakt parallelle selecties mogelijk, waardoor de efficiëntie van de antibody-generatie voor diverse toepassingen wordt verhoogd.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Antilichaamtechnologie
- Fagedisplaytechnologie
Achtergrond
- Fage-display is een krachtige techniek voor de ontdekking van antilichamen.
- High-throughput-methoden maken de selectie van antilichamen tegen talrijke targets mogelijk.
- Specificiteit en affiniteit zijn cruciaal voor effectieve toepassingen van antilichamen.
- Deze methode beantwoordt aan de behoefte aan een efficiënte generatie van antilichamen.
Doel van de studie
- Om specifieke fab-fageclonen met een hoge affiniteit te isoleren.
- Om selecties tegen honderden antigene doelwitten parallel uit te voeren.
- Om antilichamen te genereren voor het analyseren van klassen van verwante eiwitten.
Gebruikte methoden
- Immobilisatie van gezuiverde antigenen in microwelplaten.
- Blootstelling van fagenbibliotheken aan geïmmobiliseerde antigenen.
- Opeenvolgende selectierondes om specifieke binders te verrijken.
- Monitoren van de selectie-effectiviteit met behulp van gepoolde methoden.
Belangrijkste resultaten
- Fab-fragmenten met een hoge affiniteit zijn succesvol geïsoleerd.
- De methode bleek efficiënt te zijn bij parallelle selecties.
- Geïsoleerde antilichamen vertoonden specificiteit voor diverse antigenen.
- Functionele antilichamen zijn gegenereerd voor standaard immunoassays.
Conclusies
- Deze schaalbare methode verbetert processen voor de ontdekking van antilichamen.
- Het maakt de gelijktijdige analyse van grote aantallen antigenen mogelijk.
- De benadering is waardevol voor onderzoek in de immunologie en aanverwante vakgebieden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Schaalbare high-throughput selectie uit synthetische antilichaambibliotheken via phage display maakt de parallelle isolatie van high-affinity Fab-klonen tegen honderden antigenen mogelijk, wat de ontdekking van antilichamen voor diverse doelwitklassen versnelt. Deze aanpak ondersteunt de snelle generatie van hernieuwbare affiniteitsreagentia voor fundamenteel en klinisch onderzoek, waardoor de afhankelijkheid van traditionele monoclonale technologieën wordt verminderd. Door de integratie van handmatige of geautomatiseerde vloeistofbehandelingssystemen verhoogt deze methode de doorvoer en toegankelijkheid voor laboratoria van verschillende grootte en middelen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door middel van parallelle selectie tegen diverse antigeenpanels, waaronder membraanreceptoren en intracellulaire eiwitten.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door het isoleren van Fab-fragmenten met een hoge affiniteit en specificiteit, die kunnen worden omgezet in volledige antilichamen.
- Voorspellend vertrouwen: Faciliteert portfolio-triage door het genereren van gevalideerde antilichamen die functioneel zijn in standaard immunoassays zoals Western blot, ELISA en immunoprecipitatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de Assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door de selectie-effectiviteit te monitoren via gepoolde fagentitratie en ELISA-gebaseerde bindingsratio's.
- Reproduceerbaarheid: Garandeert standaardisatie via blokkerings-, was- en elutiestappen die aspecifieke binding minimaliseren en een consistente fage-terugwinning mogelijk maken.
- Schaalbaarheid: Compatibel met automatisering via aangepaste robotica, waardoor de selectiecapaciteit wordt uitgebreid terwijl de toegankelijkheid in verschillende laboratoriumomgevingen behouden blijft.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Genereert reproduceerbare antilichaamfragmenten die zijn gevalideerd in standaard immunoassays, ter ondersteuning van de overgang van ontdekking naar preklinische toepassingen.
- Mechanische risicoreductie: Maakt analyse van volledige klassen structureel of functioneel verwante eiwitten mogelijk door antilichamen tegen honderden antigene domeinen parallel te isoleren.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt vroege karakterisering van de bindingsspecificiteit en affiniteit van klonen mogelijk, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in pipelines voor antilichaamontwikkeling.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, waardoor parallelle antigeenscreening en antilichaamselectie mogelijk zijn om preklinische workflows te versnellen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door selectie tegen diverse doelwitklassen mogelijk te maken, waaronder gesecreteerde hormonen en multi-domein eiwitten.
- Screening: Levert assay-klare resultaten via kwantitatieve monitoring van fageverrijking met behulp van ELISA en titratie, wat een reproduceerbare isolatie van binders garandeert.
- Analytics: Biedt meetbare readouts, zoals bindingsratio's groter dan twee in ELISA, wat wijst op specifieke kloonverrijking tijdens de selectierondes.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit door het produceren van Fab-fragmenten die functioneel zijn in cellulaire immunofluorescentie en gerelateerde assays, ter ondersteuning van targetvalidatie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor high-throughput antilichaamgeneratie, aanpasbaar aan automatisering en schaalbaar binnen industriële en academische omgevingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door specifieke antilichaamfragmenten met een hoge affiniteit, waardoor mechanistische ambiguïteit bij doelwitvalidatie wordt verminderd.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gecontroleerde immobilisatie-, blokkerings- en wasstappen, wat schaalbare parallelle verwerking mogelijk maakt.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door de generatie van antilichamen te versnellen naar zes tot acht weken, wat het biologische risico in een laat stadium verlaagt.
- Impact op portfolio: Risicogecorrigeerde prioritering door parallelle validatie van antilichamen tegen grote antigenensets, wat strategieën voor proteoombrede dekking mogelijk maakt.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in phage display, moleculaire biologie en vloeistofbehandeling voor antigeenpreparatie en fagemanipulatie.
- Is afhankelijk van instrumentatie zoals 96-kanaals vloeistofbehandelaars, plaatwashers, incubatoren en microplaatlezers voor absorptiemeting.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van antigeenpreparatie, blokkeringsbuffers en wasprotocollen om reproduceerbaarheid over de selectierondes heen te garanderen.
- Houdt rekening met aanpassingen voor diverse antigeenformaten, waaronder oplosbare eiwitten en geïmmobiliseerde domeinen, om de bindings-efficiëntie te behouden.
- Omvat praktische beperkingen zoals de noodzaak van voldoende bibliotheekdiversiteit en optimalisatie van de wasstringentie om achtergrondruis te minimaliseren terwijl specifieke binding behouden blijft.
