Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

Het algemene doel van deze procedure is om individuele RNA-transcripten in levende cellen in real-time in beeld te brengen. Dit wordt bereikt door eerst twee oligonucleotiden te hybridiseren die zijn ontworpen om een hairpin-vormende probe te vormen, bekend als een ratio-metrische moleculaire beacon. De tweede stap is het zuiveren van de ratio-metrische moleculaire beacons via grootte-uitsluitingschromatografie.

Vervolgens wordt de ratio-metriek met moleculaire beacons via microporatie in cellen geïntroduceerd die het gemanipuleerde RNA-doelwit tot expressie brengen. De laatste stap is om de cellen over te brengen naar een microwellplaat die geschikt is voor live-cell microscopie. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de bewegingen van individuele RNA-transcripten te monitoren, die worden gevisualiseerd als heldere fluorescerende stippen binnen individuele cellen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er gebruik wordt gemaakt van synthetische probes die helder en fotostabiel zijn en een hoge signaal-ruisverhouding vertonen, wat de mogelijkheid biedt om elk endogeen RNA te imagen. Begin de bereiding van de ratiometrische molecular beacons of RBM BS door de volgende reagentia in een buisje te mengen: 20 µL Rbm B one, 30 µL Rbm B two, 6 µL 10x fosfaatbuffer en 4 µL DNA- en RNA-vrij water. Dit is doorgaans voldoende voor ongeveer 50 studies.

Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen een vloeistofchromatografiekolom voor om alle niet-gehybridiseerde RBM B twee-oligonucleotiden te verwijderen. Gebruik 75 prep grade super decks in een vloeistofchromatografiekolom van acht milliliter met een bedvolume van ongeveer vier milliliter, gebruikmakend van een spuitenpomp met een stroomsnelheid van 0,6 milliliter per minuut.

Was en equilibreer de SUEx met ongeveer 50 milliliter eenvoudig fosfaatbuffer voordat alle vloeistof het bedvolume binnenkomt. Stop de spuitpomp, koppel deze los en laat de resterende vloeistof door zwaartekracht door de kolom stromen. Laad vervolgens het RBMB-mengsel op de chromatografiekolom.

Nadat het RBMB-monster volledig in het bed is ingevoerd, voegt u langzaam nog eens 250 µL 1x fosfaatbuffer toe aan de bovenkant van het bed om ervoor te zorgen dat het volledige monster de kolom is binnengegaan. Vul de kolom tot aan de rand met 1x fosfaatbuffer. Sluit de bovenkant en start de spuitenpomp.

De spuit wordt gevuld met ongeveer 50 milliliters 1x PBS en draait op een stroomsnelheid van 0,6 milliliters per minuut. Normaal gesproken kan het RBMB-monster gemakkelijk worden gevisualiseerd dankzij de kleur van de kleurstof die in de probe is verwerkt. Zodra het RBMB de bodem van de kolom nadert, wordt de doorstroom opgevangen in een tempo van twee druppels per microcentrifugebuisje.

Stop met het verzamelen van de sample. Zodra de kleur van de sample in de microcentrifugebuisjes helder wordt, combineert u de buisjes die de gekleurde RBMB-sample bevatten, doorgaans vijf tot zes buisjes, en plaatst u deze in een centrifugaal filterapparaat. Centrifugeer de sample bij 10.000 RCF gedurende 20 minuten of tot het gewenste volume is bereikt.

Deze snelheid en tijd zullen doorgaans een eindvolume van ongeveer 30 microliters opleveren. In dit protocol werd een menselijke fibrosarcoom-cellijn ontwikkeld om Q-F-P-R-N-A tot expressie te brengen met 96 tandemherhalingen van de RBMB-doelsequentie in de 3'-UTR; de controlecellijn werd ontwikkeld om wildtype Q-F-P-R-N-A tot expressie te brengen. Eén dag voor de toediening van de probes werden cellen in een T25-fles geplaatst bij een confluentie van 40 tot 50%. De cellen werden gekweekt in DMEM-medium aangevuld met 1% pen strep en 10% foetaal runderserum en geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO2 tot de volgende dag.

Zet de microporeur aan en stel de microporeur-parameters in die zijn geoptimaliseerd voor HT 10 80 cellen. Vul de microporeurbuis met vier milliliters elektrolytische buffer en plaats deze op het micropreparatiestation. Ontdooi een voorraadmonster van gezuiverd RBMB en verdun enkele microliters tot een uiteindelijke concentratie van 12 micromolair met een 1x fosfaatbuffer.

Voor elk micro-porion is één microliter nodig. Pipetteer voor elke micro-porionreactie één milliliter kweekmedium met FBS, maar zonder antibiotica, in een microcentrifugebuisje. Zet dit klaar naast het micro-porionapparaat.

Dit zal later worden gebruikt om de cellen onmiddellijk na de micropreparatie te suspenderen. Antibiotica worden niet gebruikt, omdat deze de celviabiliteit na de micropreparatie zouden verminderen. De gemanipuleerde HT 10 80-cellen die de vorige dag zijn uitgeplaat, zouden nu 60 tot 80% confluent moeten zijn.

Verwijder het celkweekmedium en was de cellen één keer met één milliliter calcium- en magnesiumvrije DPBS; incubeer vervolgens met één milliliter trypsine gedurende één tot twee minuten. Stop de trypsinering door één milliliter DMEM-medium toe te voegen, gesupplemeerd met 10% foetaal runderserum zonder antibiotica en fenolrood, en breng de cellen over in twee microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter. Centrifugeer de cellen in de microcentrifugebuisjes bij 200 ×g gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant, resuspendeer en combineer de celpellets in een eindvolume van 1 mL DPBS. Neem 10 µL van de goed gemengde celsuspensie om de cellen te tellen, pipetteer de cellen meerdere keren op en neer om er zeker van te zijn dat ze goed zijn gedispergeerd en breng 300.000 cellen met DPBS over naar een nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis. Centrifugeer 5 minuten bij 200 ×g.

Verwijder het supernatant en let erop dat de celpellet niet wordt verstoord. Resuspendeer de pellet in 11 µL Resus suspensiebuffer en pipetteer dit meerdere keren op en neer om ervoor te zorgen dat de cellen goed zijn verspreid. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.

Voeg één microliter van het verdunde RBMB toe en meng goed door meerdere keren op en neer te pipetteren. Wees opnieuw voorzichtig om geen luchtbellen te vormen. Het is cruciaal om te voorkomen dat er luchtbellen in de RBMB-bead-suspensie terechtkomen, omdat luchtbellen tijdens de micro-operatie een vonk kunnen veroorzaken, wat leidt tot een gebrekkige RBMB-afgifte en celdood.

Zuig met de micropreparatiepipet 10 µL van het RBMB-celmengsel op en plaats de pipet in de micropreparatiebuis. Druk op de startknop om de microporatie te starten. Er mogen geen zichtbare luchtbellen in de tip aanwezig zijn wanneer het scherm van de microporatie voltooiing aangeeft.

Verwijder de pipet uit het station en breng het mengsel van 10 µL over in de eerder voorbereide microcentrifugebuis die één milliliter kweekmedium met FBS bevat, maar zonder antibiotica, en meng dit voorzichtig door de buis meerdere keren zijwaarts heen en weer te bewegen. Centrifugeer de cellen 5 minuten bij 200 ×g. Was de cellen tweemaal in één milliliter phenolroodvrij kweekmedium met FBS, maar zonder antibiotica, om eventuele rbm BS te verwijderen die niet in de cellen zijn afgeleverd.

Na de tweede wasbeurt worden de cellen geresuspendeerd in 400 µL fenolroodvrij kweekmedium met FBS, maar zonder antibiotica. Plaats de geresuspendeerde cellen in een vooraf geprepareerd, met poly-D-lysine gecoat coverglas met acht kamerwells tegen een volume van 200 µL per well of tegen de gewenste confluentie.

Plaats het dekglas met kamer in een celkweekincubator. Beeldvorming kan al vanaf 30 minuten na de micropreparatie worden uitgevoerd. Om deze procedure te starten, zet u het incubatiesysteem bovenop de live-celpodia aan en laat u het equilibreren tot het een temperatuur van 37 °C, 5% koolstofdioxide en een luchtvochtigheid van 75% heeft bereikt.

Zet de microscoop en de fluorescentielichtbron aan en open de Metamorph-software voor beeldacquisitie. Breng immersie-olie aan op het objectief. Plaats het dekglas met kamer en microporeuze cellen op de live-celplatine.

Bovenste incubatiesysteem. Incubeer het bovenste systeem van de tafel totdat de temperatuur en de kooldioxidegehaltes zijn gestabiliseerd. Open het tabblad 'acquire' in de Metamorph-software.

Klik op de knop 'show live' om het veld te vinden. Stel de focus in onder wit licht en klik op de knop 'stop live'. Ga naar het tabblad 'acquire'.

Klik op de pop-upknop voor streamacquisitie en open deze, en stel de gewenste parameters voor de movie-acquisitie in. Neem 150 frames op met het SCI five CF six 40 R-filter. Sla de beelden op de harde schijf op.

Hier worden representatieve afbeeldingen getoond van HT 10 80-cellen die stabiel RNA tot expressie brengen met 96 tandemherhalingen, of vier tandemherhalingen van de RBMB-bindingsplaats in de 3'-UTR, na intracellulaire aflevering van mbs. De aanwezigheid van 96 tandemherhalingen zorgt ervoor dat individuele RNA-transcripten verschijnen als heldere fluorescente stippen.

In tegenstelling hiermee verschijnen RNA-moleculen die slechts vier tandemherhalingen bevatten als zeer zwakke fluorescerende stipjes en zijn deze vaak alleen detecteerbaar in gebieden met een uitzonderlijk lage achtergrond. De acquisitie van streaming-beelden maakt het mogelijk om individuele RNA-transcripten in real-time in beeld te brengen. Individuele RNA-transcripten kunnen gemakkelijk worden waargenomen in het cytoplasma en de kern van de cellen, waarbij ze brownse of sub-diffusieve bewegingen vertonen.

In zeldzame gevallen zal een RNA dat ondergaat aan gericht transport worden waargenomen zoals hier wordt getoond. RNA-transcripten die ondergaan aan gericht transport bewegen doorgaans snel langs een recht pad. In deze montage wordt het traject van het RNA-transcript getoond als overlay over één frame van de tijdreeks.

De gerichte RNA-bewegingen zijn consistent met het transport van RNA langs microtubuli en microfilamenten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u RNA-metriek voorbereidt en zuivert met behulp van moleculaire beacons. Lever RNA-metriek via moleculaire beacons in cellen af middels micro-injectie en beeldvorm single RNA-transcripten met een fluorescentiemicroscoop.