Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons
6 augustus 2014
Ratiometrische bimoleculaire bakens (RBMBs) kan worden gebruikt om het interne gemanipuleerde RNA-transcripten in levende cellen. Hier beschrijven we de bereiding en zuivering van RBMBs, levering van RBMBs in cellen van microporatie en fluorescentie beeldvorming van afzonderlijke RNA transcripten in real-time.
Het algemene doel van deze procedure is om enkelvoudige RNA-transcripten in levende cellen in real time af te beelden. Dit wordt bereikt door eerst twee oligonucleotiden te hybridiseren die zijn ontworpen om een haakvormige sonde te vormen, bekend als een ratio metrische sonde door moleculaire baken. De tweede stap is om de ratio metrische sonde door moleculaire bakens te zuiveren door middel van grootte-exclusiechromatografie.
Vervolgens worden de ratio metrische sondes door moleculaire bakens geïntroduceerd in cellen die het gemodificeerde RNA-doelwit tot expressie brengen via micro porion. De laatste stap is om de cellen in een microwell plate te plaatsen die geschikt is voor levende celmicroscopie. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de bewegingen van individuele RNA-transcripten te monitoren, die zichtbaar zijn als heldere fluorescente vlekken binnen enkele cellen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het synthetische sondes gebruikt die helder en fotostabile zijn en een hoog signaal-tot-achtergrondverhouding vertonen, wat de mogelijkheid biedt om elke endogene RNA af te beelden. Begin met de voorbereiding van de ratio metrische sonde door moleculaire bakens of RBM BS door de volgende reagentia in een buis te mengen. 20 microliter Rbm B een 30 microliter Rbm B twee zes microliter 10 x fosfaatbuffer en vier microliter DNA's en RNA's vrij water. Dit is doorgaans voldoende voor ongeveer 50 studies.
Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Bereid ondertussen een vloeistofchromatografiekolom voor om eventuele niet-gehybridiseerde RBM B twee oligonucleotiden te verwijderen. Gebruik 75 prep-grade superdecks in een acht milliliter vloeistofchromatografiekolom met een bedvolume van ongeveer vier milliliter met behulp van een spuitpomp die loopt op een stroomsnelheid van 0,6 milliliter per minuut.
Was en breng de SUEx in evenwicht met ongeveer 50 milliliter een x fosfaatbuffer voordat al het vocht het bedvolume binnenkomt. Stop de spuitpomp, koppel deze los en laat het resterende vocht door de kolom lopen door middel van zwaartekracht. Laad vervolgens het RBMB-mengsel op de chromatografiekolom.
Nadat het RBMB-monster volledig het bed is binnengekomen, voeg langzaam nog eens 250 microliter een x fosfaatbuffer toe aan de bovenkant van het bed om ervoor te zorgen dat het hele monster volledig in de kolom is gekomen. Vul de kolom tot aan de rand met een x fosfaatbuffer. Sluit de bovenkant en start de spuitpomp.
De spuit is gevuld met ongeveer 50 milliliter een XPBS en loopt met een stroomsnelheid van 0,6 milliliter per minuut. Meestal kan het RBMB-monster gemakkelijk worden gevisualiseerd vanwege de kleur van de kleurstof die in de sonde is opgenomen. Zodra het RBMB de bodem van de kolom nadert, verzamel het doorstromende vocht bij twee druppels per microcentrifugebuisje.
Stop met het verzamelen van het monster. Zodra de kleur van het monster in de microcentrifugebuisjes helder wordt, combineer de buisjes met de gekleurde RBMB-monster, doorgaans vijf tot zes buisjes, en laad deze in een centrifugaalfilterapparaat. Centrifugeer het monster gedurende 20 minuten bij 10.000 RCF of tot het gewenste volume is bereikt.
Deze snelheid en tijd zullen doorgaans een eindvolume van ongeveer 30 microliter opleveren. In dit protocol werd een menselijke fibrosarcoomcellijn gemodificeerd om Q-F-P-R-N-A met 96 tandemherhalingen van de RBMB-doelsequentie in de drie prime UTR tot expressie te brengen, de controlecellijn werd gemodificeerd om wildtype Q-F-P-R-N-A te expresseren een dag vóór levering van de sonde. Plaats de cellen in een T 25-kolf bij 40 tot 50% co-fluency. Cultiveer de cellen met DMEM-medium aangevuld met 1% pen strep en 10% foetaal bovien serum en incubeer de volgende dag bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.
Schakel de micro por in en stel de micro portration-parameters in die zijn geoptimaliseerd voor HT 10 80-cellen. Vul de micro porion-buis met vier milliliter elektrolytisch buffer en plaats deze op de microvoorbereidingsstation. Ontdooi een voorraadmonster van gezuiverde RBMB en verdun enkele microliters tot een eindconcentratie van 12 micromolar met een x fosfaatbuffer.
Er is één microliter nodig voor elke micro porion. Voor elke micro porion-reactie pipetteer een milliliter kweekmedium met FBS, maar zonder antibiotica in een microcentrifugebuisje. Leg het bij de micro porion-apparatuur neer.
Het zal later worden gebruikt om de cellen onmiddellijk na microvoorbereiding te suspenderen. Antibiotica worden niet gebruikt omdat ze de celviabiliteit na microvoorbereiding zouden verlagen. De gemodificeerde HT 10 80-cellen die de vorige dag zijn geplaat, zouden nu 60 tot 80% confluent moeten zijn.
Verwijder het celkweekmedium en was de cellen eenmaal met een milliliter calcium- en magnesiumvrij DPBS. Incubeer met een milliliter trypsine gedurende één tot twee minuten. Stop de trypsine door een milliliter DMEM-medium aan te brengen dat is aangevuld met 10% foetaal bovien serum zonder antibiotica en fenolrood en breng de cellen over in twee 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Centrifugeer de cellen in het microcentrifugebuisje gedurende vijf minuten bij 200 keer G.
Verwijder het supernatant, suspendeer en combineer de cellenpellets in een eindvolume van een milliliter DPBS. Neem 10 microliter uit de goed gemengde celsuspensie om de cellen te tellen, pipetteer de cellen omhoog en omlaag om ervoor te zorgen dat ze goed gedispergeerd zijn en breng 300.000 cellen met DPBS over in een nieuw 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 keer G.
Verwijder het supernatant en zorg ervoor dat de cellenpellet niet wordt verstoord. Suspendeer de pellet in 11 microliter Resus suspensiebuffer en pipetteer omhoog en omlaag om ervoor te zorgen dat de cellen goed gedispergeerd zijn. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden gevormd.
Voeg een microliter van de verdunde RBMB toe en meng goed door meerdere malen omhoog en omlaag
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft het gebruik van ratiometrische bimoleculaire beacons (RBMB's) om enkele gemanipuleerde RNA-transcripten in levende cellen te beeldvormen. De procedure omvat het hybridiseren van oligonucleotiden om een haakvormige sonde te vormen, het zuiveren van de RBMB's en het leveren ervan in cellen voor real-time fluorescente beeldvorming.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- RBMB's zijn ontworpen om RNA-transcripten te visualiseren.
- Real-time beeldvorming maakt het mogelijk om RNA-dynamica te observeren.
- De methode verbetert het begrip van RNA-gedrag in levende cellen.
- Fluorescentiemicroscopie biedt hoogwaardige beeldvormingsmogelijkheden.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het beeldvormen van enkele RNA-transcripten in levende cellen.
- Om de levering en visualisatie van gemanipuleerde RNA-doelen te verbeteren.
- Om real-time monitoring van RNA-bewegingen mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Hybridisatie van oligonucleotiden om RBMB's te vormen.
- Zuivering van RBMB's met behulp van grootte-exclusiechromatografie.
- Introductie van RBMB's in cellen via microporation.
- Fluorescentiemicroscopie voor het beeldvormen van RNA-transcripten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van enkele RNA-transcripten in levende cellen.
- Real-time visualisatie van RNA-bewegingen als heldere fluorescente vlekken.
- Demonstratie van de effectiviteit van RBMB's in cellulaire omgevingen.
- Inzichten in de dynamica van gemanipuleerd RNA in levende systemen.
Conclusies
- RBMB's zijn een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van RNA-dynamica in levende cellen.
- De methode biedt een nieuwe aanpak voor het visualiseren van RNA-gedrag.
- Toekomstige toepassingen kunnen het bestuderen van RNA-interacties en -functies omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Real-time imaging of single RNA transcripts enables direct observation of gene expression dynamics, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The ratiometric bimolecular beacon approach provides quantitative, spatially resolved data on RNA behavior, enhancing predictive confidence in preclinical models. This capability aids in prioritizing therapeutic hypotheses by clarifying RNA localization, transport, and stability in living systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing RNA transcript localization and movement in live cells.
- Operational Value: Provides functional validation of engineered RNA targets through direct fluorescence readout.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing RNA stability and subcellular distribution under physiological conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates discrete fluorescent spots that serve as quantifiable readouts for RNA expression and localization.
- Reproducibility: Utilizes purified, photostable probes to ensure consistent signal across experiments and time.
- Scalability: Compatible with microporation delivery and standard wide-field fluorescence microscopy for broader application.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling real-time monitoring of RNA dynamics in disease-relevant cellular models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies RNA transport mechanisms (e.g., microtubule-associated movement) to inform target mechanism of action.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing empirical data on RNA behavior in living systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, offering a direct readout of RNA behavior that informs lead identification and mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of RNA transcript dynamics in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative fluorescence outputs that allow comparison of RNA expression levels and localization patterns.
- Analytics: Generates time-series imaging data that facilitate quantitative analysis of RNA movement, diffusion, and transport kinetics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing observation of RNA behavior in living cells under near-physiological conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple RNA targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in RNA localization, stability, and function.
- Operational Value: Ensures standardization through probe purification and standardized delivery via microporation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of RNA-targeted therapeutic approaches.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization through direct visualization of RNA dynamics in relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in oligonucleotide probe design, purification, and fluorescence microscopy.
- Dependent on access to microporation equipment and compatible cell culture systems.
- Necessitates standardization of probe concentration and delivery parameters across teams.
- Requires adaptation for different RNA targets and cellular backgrounds to avoid overexpression artifacts.
- Limited by the need to engineer RNA transcripts with tandem repeat sequences for effective beacon binding.
