Niet-chromatografische zuivering van recombinant elastine-achtige polypeptiden en hun Fusies met peptiden en eiwitten van Escherichia coli
9 juni 2014
Elastine-achtige polypeptiden zijn stimulus-responsieve biopolymeren met toepassingen variërend van recombinant eiwit zuivering naar drug delivery. Dit protocol beschrijft de zuivering en karakterisering van elastine-polypeptiden en hun peptide of eiwit fusies uit Escherichia coli met hun lagere kritische oplostemperatuur faseovergang gedrag als eenvoudig alternatief voor chromatografie.
Het algemene doel van deze procedure is om recombinante elastine-achtige polypeptiden uit e coli te zuiveren door inverse transitiecycli. Dit wordt bereikt door eerst het lysaat te verzamelen van e coli-cellen die recombinante elastine-achtige polypeptiden hebben geëxpresseerd en onoplosbare cellulaire resten te verwijderen door centrifugatie. De tweede stap is het verwijderen van oplosbare verontreinigingen door de elastine-achtige polypeptide-transitie te induceren met de toevoeging van zout of warmte.
Vervolgens wordt het elastine-achtige polypeptide-coate verzameld door centrifugatie en wordt de supernatant weggegooid. Deze stap wordt een hete spin genoemd. Vervolgens wordt de gesuspendeerde elastine-achtige polypeptide-oplossing gecentrifugeerd om de onoplosbare verontreinigingen te verwijderen.
De oplosbare elastine-achtige polypeptide in de supernatant wordt behouden en de pellet wordt weggegooid. Deze stap wordt een koude spin genoemd, herhaal cycli van hete en koude spins tot een bevredigende zuiverheid van het elastine-achtige polypeptide is bereikt. Uiteindelijk levert inverse transitiecycli pure elastine-achtige polypeptideproducten op die kunnen worden gekenmerkt voor gebruik in een verscheidenheid aan biomedische toepassingen.
Elastine-achtige polypeptiden gezuiverd door deze techniek hebben een aantal nuttige toepassingen, waaronder biosensing, weefselengineering en geneesmiddelafgifte, waarbij de overgangstemperatuur en biopolymeerarchitectuur van het elastine-achtige polypeptide specifiek kan worden afgestemd voor elke toepassing. Om te beginnen, druk het gewenste ELP-coderende plasmide uit in e coli onder de in het bijbehorende tekstprotocol beschreven omstandigheden. Na het schudden van een 1-liter cultuur in een incubator gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius, brengt u de cultuur over naar een 1-liter centrifugefles en centrifugeert u de fles vervolgens 15 minuten bij 2000 Gs bij vier graden Celsius.
Vervolgens gooit u de supernatant weg en resuspendeert u. Breng de pellet in PBS-water of andere gewenste buffer op een totaal volume van 45 milliliter. Breng vervolgens de celsuspensie over in een 50 milliliter conische buis.
Plaats de celsuspensie op ijs en eenmaal afgekoeld, soniqueer gedurende in totaal negen minuten in cycli van 10 seconden aan en 20 seconden uit. Met een uitgangsvermogen van 85 watt. Laat het monster ongeveer 10 minuten op ijs afkoelen na de eerste ronde sonicatie en herhaal vervolgens de negen minuten durende sonicatiecyclus.
Breng het lysaat over naar een 50 milliliter centrifugeerbuis met ronde bodem. Voeg vervolgens twee milliliter 10%gewicht per volume polyethyleen toe voor elke liter cultuur en schud de buis om te mengen. Centrifugeer de buis vervolgens 10 minuten bij 16.000 GS bij vier graden Celsius. Breng vervolgens de supernatant over naar een schone 50 milliliter centrifugeerbuis met ronde bodem en gooi de pellet weg.
Voeg kristallijn natriumchloride toe aan het monster om de ELP-transitie te induceren. Zodra het zout is opgelost, wordt de oplossing troebel, wat wijst op de fasescheiding van de ELP uit de oplossing. Pel de ELP vervolgens door het monster gedurende 10 minuten bij 16.000 GS te centrifugeren.
Bij kamertemperatuur kan de ELP-pellet in eerste instantie ondoorzichtig lijken, gooi de supernatant weg en voeg vervolgens één tot vijf milliliter van de gewenste buffer toe na afkoeling. De ELP-pellet kan doorschijnend en bruin van kleur zijn. Breng de pellet opnieuw in suspensie door te pipetten of de buis te roteren bij vier graden Celsius.
Pipet vervolgens één milliliter aliquoten van de gesuspendeerde ELP-oplossing in schone 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Centrifugeer de buisjes gedurende 10 minuten bij 16.000 GS bij vier graden Celsius. Breng vervolgens de supernatant over naar een schone buis en gooi de pellets weg.
Induceer de ELP-transitie met de toevoeging van natriumchloride. Als de ELP een hoge overgangstemperatuur heeft die niet kan worden geïnduceerd met alleen zout, incubeer het monster gedurende 15 minuten op een temperatuur boven de ELP-overgangstemperatuur op een hitteblok. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 10 minuten bij 16.000 GS bij een temperatuur boven de temperatuur die voor de ELP-transitiestap werd gebruikt.
Gooi de supernatant weg en resuspendeer de ELP-pellet in 500 tot 750 microliters van de gewenste buffer door te pipetten of de buis te roteren bij vier graden Celsius totdat de pellet opnieuw is opgelost. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 10 minuten bij 16.000 GS bij vier graden Celsius om eventuele onoplosbare verontreinigingen te pelletten. Breng vervolgens de snat over naar een schone buis en gooi de pellet weg. Herhaal inverse transitiecycli totdat er geen verontreinigingspellet wordt waargenomen.
Dit vereist doorgaans twee tot vijf cycli. Bereid een verdunningsreeks van ELP-oplossingen in PBS of andere gewenste buffer. Gebruik vervolgens een temperatuurgestuurde UV-v-spectrofotometer om de optische dichtheid bij 350 nanometer te meten over een temperatuurbereik terwijl het monster wordt verwarmd met een snelheid van één graad Celsius per minuut.
Als er geen toename van de optische dichtheid wordt waargenomen, kan de overgangstemperatuur hoger zijn dan de bovenste temperatuurgrens. Meet vervolgens de afname van de optische dichtheid over hetzelfde temperatuurbereik met een afkoelsnelheid van één graad Celsius per minuut. Om de omkeerbaarheid van de ELP-transitieplot te verifiëren, plot de optische dichtheid tegen de temperatuur en bepaal vervolgens de overgangstemperatuur van de homopolymeer ELP.
Door het inflexiepunt op dit troebelheidsprofiel te identificeren, wordt de succesvolle zuivering van LP's bevestigd door SDS-pagina, zoals hier te zien is. Het aantal verontreinigingen is veel groter in het initiële e coli-lysaat in vergelijking met het monster na één ronde van inverse transitiecycli. De ELP-transitietemperatuur wordt gekenmerkt door temperatuurgeprogrammeerde troebelheid voor een ELP-homopolymeer.
Het troebelheidsprofiel vertoont een enkele scherpe toename van de optische dichtheid, die de transitietemperatuur bij een bepaalde concentratie definieert. De omkeerbare aard van
Overzicht
Dit protocol beschrijft de zuivering en karakterisering van elastine-achtige polypeptiden (ELP's) uit Escherichia coli met behulp van inverse transitiecycli. ELP's zijn biopolymeren met diverse toepassingen, waaronder geneesmiddelentoediening en tissue engineering.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Biopolymeren
- Eiwitzuivering
- Bomedische toepassingen
Achtergrond
- Elastine-achtige polypeptiden zijn stimulus-responsieve biopolymeren.
- Ze kunnen worden gebruikt in diverse biomedische toepassingen.
- Zuiveringstechnieken zijn essentieel voor hun effectieve gebruik.
- Inverse transitie-cycli vormen een nieuwe methode voor zuivering.
Doel van de studie
- Om recombinante ELP's uit E. coli te zuiveren.
- Om de gezuiverde ELP's te karakteriseren voor biomedische toepassingen.
- Om de efficiëntie van inverse transitiecycli aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Het verzamelen van E. coli-lysaat en het verwijderen van onoplosbare debris.
- Het induceren van de ELP-faseovergang met zout of warmte.
- Het uitvoeren van herhaalde warme en koude centrifugaties voor zuivering.
- Het karakteriseren van ELPs met behulp van optische dichtheidsmetingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle zuivering van ELP's via inverse transitiecycli.
- Karakterisering van de transitietemperaturen van ELP's.
- Demonstratie van de reversibiliteit van ELP-transities.
- Bevestiging van potentiële toepassingen in biosensing en drug delivery.
Conclusies
- Inverse transitionscycling is een effectieve methode voor het zuiveren van ELP's.
- Gezuiverde ELP's kunnen worden aangepast voor specifieke biomedische toepassingen.
- Het protocol verbetert het begrip van het gedrag van ELP's in oplossing.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Omgekeerde transitiecyclus maakt chromatografie-vrije zuivering van recombinante elastine-achtige polypeptiden (ELPs) en hun fusies mogelijk, waardoor de complexiteit en kosten van downstream-verwerking worden verminderd. Deze methode ondersteunt de snelle productie van ELP-gebaseerde therapeutica en biomaterialen door gebruik te maken van de intrinsieke thermische responsiviteit voor het verwijderen van contaminanten. Het vergroot de betrouwbaarheid van targets in de vroege ontdekkingsfase door gezuiverde, functioneel relevante biopolymeren te leveren voor assay-ontwikkeling en screening.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om ELP-fusieconstructen te onderzoeken door zuiver materiaal te leveren voor functionele validatie van peptide- of eiwitactiviteit.
- Operationele waarde: Verwijdert oplosbare en onoplosbare contaminanten uit E. coli-lysaten zonder chromatografie, waardoor de doorlooptijd van de eiwitproductie in de beginfase wordt verkort.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert ELP-producten met gedefinieerde overgangstemperaturen, wat een betrouwbaar biosensorontwerp mogelijk maakt waarbij de faseovergang dient als een detecteerbaar signaal.
- Operationele waarde: Genereert reproduceerbare, schaalbare ELP-batches die geschikt zijn voor standaardisatie in high-throughput screeningplatforms die een consistent biopolymeergedrag vereisen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de preklinische evaluatie van ELP-drugdeliverysystemen door gezuiverde dragers te leveren met een aanpasbare architectuur en releasekinetiek.
- Operationele waarde: Faciliteert de continuïteit van ontdekking naar preklinisch werk door ELP-fusies te leveren die geschikt zijn voor in vivo efficaciteits- en biodistributiestudies.
Integratie van Pipeline & Workflow
Inverse transitiecycli passen binnen het ontdekkingscontinuüm van recombinante expressie in E. coli tot lead-identificatie, waarbij gezuiverde ELP-fusies worden geleverd voor verdere evaluatie zonder chromatografische knelpunten.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing van ELP-peptide- of ELP-proteinefusies mogelijk door contaminatievrij materiaal te leveren voor bindings- en activiteitsassays.
- Screening: Levert assay-ready ELP-producten met kwantitatieve, op troebelheid gebaseerde read-outs voor het monitoren van de purificatie-efficiëntie en batchconsistentie.
- Analytics: Biedt temperatuurgeprogrammeerde metingen van de optische dichtheid die de transitietemperatuur definiëren, een kritiek kwaliteitskenmerk voor ELP-gebaseerde producten.
- Translationeel onderzoek: Legt de verbinding met preklinische toepassingen via gezuiverde ELP's die geschikt zijn voor formulering in drug delivery of scaffolds voor tissue engineering.
- Hergebruik in de onderneming: Vestigt een herbruikbare, platformcompatibele purificatiemethode die toepasbaar is op diverse ELP-sequenties en fusiepartners.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de functionaliteit van ELP-fusies door chromatografische variabiliteit te elimineren en het natuurlijk gedrag van biopolymeren te behouden.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door zout- of hitte-geïnduceerde faseovergangen die geschikt zijn voor standaard laboratoriumcentrifuges.
- Strategische waarde: Vermindert verliezen gerelateerd aan zuivering en kapitaaluitgaven door het elimineren van chromatografieharsen en de daarmee gepaard gaande validatielast.
- Impact op portfolio: Maakt een risico-gecorrigeerde prioritering van ELP-gebaseerde kandidaten mogelijk door consistente, hoogzuivere materialen te garanderen voor go/no-go-beslissingen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in recombinante eiwitexpressie en faseovergangsbiofysica.
- Afhankelijk van toegang tot centrifuges die 16,000 × g kunnen bereiken en temperatuurgecontroleerde modules voor warme/koude centrifugatie.
- Maakt standaardisatie van zoutconcentraties en temperatuurprofielen tussen teams noodzakelijk voor reproduceerbaar ELP-overgangsgedrag.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen van ELP's met hoge overgangstemperaturen die hitte-inductie vereisen voorbij de zoutoplosbaarheidslimieten.
- Houdt rekening met praktische beperkingen, waaronder de verwerkingstijd voor meerdere cycli en potentieel rendementsverlies tijdens herhaalde centrifugatiestappen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Expression of Elastin-like Polypeptides (ELPs)
2:22
Purification of ELPs by Inverse Transition Cycling
4:17
Removal of Contaminants from ELP through Subsequent Rounds of ITC
5:22
Characterization of ELP Tt by Temperature-programmed Turbidimetry
7:13
Conclusion
6:16
Results: Characterization of ELPs Purified from E. coli through ITC
