Name: In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 8 s
Description: Leer klonale tracking van hematopoëtische stam- en progenitorcellen in vivo met behulp van confocale en multiphoton microscopie. Deze methode maakt 3D-visualisatie van celgedrag en regeneratie in het beenmerg mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van het National Heart, Lung, Blood Institute van de National Institutes of Health. We danken Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Duitsland) voor het verstrekken van de vijf LeGO vector plasmides; Christian A. Combs en Neal S. Young (NHLBI, NIH) voor discussies, ondersteuning en aanmoediging gedurende dit onderzoek, en Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) voor hulp bij staartvene-injecties.

Alle muizen werden gehuisvest en behandeld in overeenstemming met de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health, en ingeschreven in een NHLBI Animal Care en gebruik Comite-goedgekeurde protocol. Vrouwelijke B6.SJL-Ptprc (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) en C57BL / 6 muizen, 6-12 weken oud, werden gebruikt als donor en ontvanger respectievelijk. Een lijst van materialen, reagentia en apparatuur wordt gegeven in tabel 1. 1 lego transductie van Muis HSPCs en beenmergtransplantatie Voeren procedures hieronder in een gecertificeerde bioveiligheid niveau 2 (BSL-2) kast (weefselkweek kap) beschreven. <ol><li> Productie van LEGO vectoren die coderen voor 5 fps <ol><li> Gebruik de lentivirale &quot;Gene Ontology &#39;(lego) vector plasmiden, die elk coderen voor een ander FP van een sterke constitutieve SFFV promotor, waaronder Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venus), Lego-T2 (tdTomato), en de Lego-C2 (mCherry) welwillend ter beschikking gesteld door Dr Boris Fehse (Universitair Medisch Centrum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Duitsland); nu ook verkrijgbaar bij Addgene 5-7. </li><li> Lego vectoren, zaad 5 x 10 6 293T-cellen in 10 cm schalen (gebruik 12 schotels voor elke vector) 24 uur voor transfectie in 8 ml I10 medium (IMDM aangevuld met 10% FCS en glutamine / penicilline / streptomycine) produceren. </li><li> Transfecteren de cellen met calciumfosfaat met behulp van licht gewijzigde CAPHOS kit aanbevelingen: <ol><li> Voor elke plaat mix 15 ug LEGO vector, 12 pg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 ug Vorig-TAT, en 1 ug pMD2.G-VSV-G plasmiden in aanwezigheid van 50 pi 2,5 M CaCl2, en voeg water toe tot opbrengst 500 ul totaal volume. </li><li> Precipiteer DNA plasmiden met 500 ul 2x HeBS (HEPES-gebufferde zoutoplossing) en incubeer gedurende 20 min bij kamertemperatuur voorafgaand aan het toevoegen aan elke plaat van 293T cellen. </li><li> Incubeer cellen voor6 uur in een 37 ° C 5% CO2 incubator; verwijder media en voeg verse voedingsbodems 6 uur na transfectie. </li></ol></li><li> Verzamel kweeksupernatanten met lentivirale deeltjes van elke plaat, dagelijks gedurende 3 dagen. Elke collectie dag na bovenstaande toe te voegen verse I10 media om elke plaat. <ol><li> Filteren door 0,22 pm poriën, zwembad en concentreer supematanten door ultracentrifugatie op een SW28 rotor gedurende 2 uur bij 71.900 xg en 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de bovenstaande vloeistoffen in 1 ml StemSpan media. Aliquot de lentivirale voorraden in 200 ul en bewaar bij -80 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Titratie van Lentiviral Deeltjes Bepaal de titer van LEGO vector deeltjes verzameld bovenstaande vloeistoffen via kwantificering van transducerende eenheden / ml met behulp van NIH3T3 cellen. Titers mogelijk berekening van het volume van elke vector supernatant die volstaat om de gewenste relatieve multipliciteit van infectie (MOI) voor experimentele doelwitcellen. <ol><li> Plate 5 x 10 4 NIH3T3 cellen per putje (12-well plaat) in 2 ml I10 media een dag voor de titratie. </li><li> Bereid 5-voudige seriële verdunningen van supernatanten vector in I10 media gesupplementeerd met protamine sulfaat (4 mg / ml is 1000x). </li><li> Verwijder de media uit de cellen, en te vervangen door 500 ul van supernatant verdunningen die het equivalent van 2, 0,8, 0,32 en 0,128 pi geconcentreerd virus. </li><li> Bepaal het aantal (nr) aanwezige cellen per putje bij de transductie, tellen een controlewell. </li><li> 6 uur na transductie, voeg 2 ml I10 media en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Oogst de cellen van elk putje met trypsine-EDTA, en bepaalt het percentage fluorescerende cellen (% FP) via flowcytometrie. </li><li> Bereken de titer als volgt, de gemiddelde verkregen voor elk putje (verdunning) titers resulterend in een FP% tussen 1 en 50%: Titer (vector deeltjes / ml) = nrx% FP / Volume van vector supernatant (ml). Het gemiddelde van de verkregen voor elke verdunning als de% FP is tussen 1 en 50% titers. </li></ol></li><li> Mouse Cell Collection, zuivering, transductie en Transplantatie (schematisch getoond in Figuur 1A aangepast van Malide et al. 4). <ol><li> Sacrifice donormuizen door een erkende procedure. Oogst beenmerg van voorste en achterste ledematen: ontleden opperarmbeenderen, dijbenen en scheenbenen, grondig verwijderen van alle spieren, ligamenten en overtollige weefsel uit beenderen, dwars door het einde van elk bot zo dicht mogelijk bij het gewricht, en spoel het beenmerg van het bot met een 27-0 G naald op een spuit met I10 media. </li><li> Pellet de gehele beenmergcellen voor 10 min bij 500 xg, 4 ° C en lyseren rode cellen tweemaal met 50 ml ACK buffer. Resuspendeer cellen in 10 ml I10 media. </li><li> Zuiver lineage negatieve (Lin) progenitorcellen met de MACS lijn depletie kit volgens een gemodificeerde kit protocol: <ol><li> Gebruik 30 pl anti-biotine microbolletjes in plaats van 10 gl / 10 7 cellen; Voer de wasstappen met I2 medium (IMDM aangevuld met 2% FCS) in plaats van buffer. </li><li> Steek een wasstap tussen de incubatie met biotine-Antibody Cocktail en de incubatie met anti-biotine microbolletjes; en equilibreren van de kolom met I10 plaats van buffer. </li></ol></li><li> Culture Lin cellen gedurende 48 uur bij een begin dichtheid van 5 x 10 5 cellen / ml in StemSpan medium aangevuld met 10 ng / ml murine IL-3, 100 ng / ml murine IL-11, 100 ng / ml humaan Flt-3 ligand, en 50 ng / ml muis stamcelfactor. </li><li> Transfer 1 tot 4 x 10 5 cellen 12-putjesplaten bekleed met RetroNectin en transduceren LEGO supernatanten, elk bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 6-7 tot 50% expressie efficiëntie van elke FP bereiken, in aanwezigheid van StemSpan media en cytokines hierboven beschreven en 4 ug / ml protaminesulfaat. </li><li> Transduceren cellenwaarbij elke LEGO vector afzonderlijk beschreven in stap 1.3.5 en meng cellen na transductie (Mix genoemd) of co-transduceren cellen met 5 LEGO vector bovenstaande vloeistoffen gelijktijdig (genoemd Co). Verwijder cellen 24 uur later, eenmaal wassen met StemSpan media zonder cytokines, en mengen ze in StemSpan media zonder cytokines voor transplantatie, of overbrengen naar vers medium met cytokinen, en cultuur voor een extra 96 ​​uur voor confocale microscopie en flowcytometrie. <ol><li> Voer beenmergtransplantatie door het inbrengen getransduceerde Lin- HSPCs via staartader injectie in 11 Gy enkele dosis voorgevulde bestraalde ontvangers (6-18 uur vóór transplantatie) ontvangers, in een volume van 100 ui op een celdosis per muis overeenkomend met 1 -4 x 10 5 Lin- cellen oorspronkelijk plated voor transductie. In elk experiment transplantatie een cohort van dieren met dezelfde populatie van getransduceerde donor BM cellen. </li><li> Voor in vitro karakterisering van getransduceerde HSPC&#39;s, de cultuur van de cellen voor een extra 4-5 dagen in StemSpan aangevuld met cytokines en analyseren door flowcytometrie voor transductie efficiëntie, en met behulp van microscopie voor diversiteit kleur. <ol><li> Offer individuele muizen en weefsels en organen ophalen voor beeldvorming op verschillende tijdstippen tot 120 dagen na transplantatie. <ol><li> Spray met ethanol de vacht van de muis en incisie van de huid aan de buikzijde vermijden haar verspreiding. </li><li> Ontleden en accijns volgens standaard procedures de milt, popliteale lymfeknopen, long, hart, huid, vetweefsel, skeletspier, nier, lever, en de onderlinge toegang tot schedeldak. </li><li> U kunt ook gebruik maken van calvaria of het opzetten van een bot venster voor live-imaging herhaaldelijk in de tijd 2,8,9 of afbeelding oppervlakkige organen zoals de huid en de lymfeklieren in het levende dier. </li></ol></li><li> Plaats individuele organen in 35 mm aantal 0 afdekglas kweekschaaltjes in 50-10056, l PBS voor beeldvorming die intact zonder snijden, fixatie of verder verwerkt zoals beschreven in stap 2.5. </li><li> Voor volumetrische beeldvorming, houden de organen in in koud PBS tot gebruik. Voor time-lapse imaging gaat onmiddellijk beeldvorming organen in DMEM, 10% FBS bevattende 20 mM HEPES bij 37 ° C </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2 confocale en twee-foton microscopie en beeldanalyse <ol><li> Voeren microscopie beeldvorming met behulp van een Leica SP5 vijf kanalen confocale en multi-systeem uitgerust met een multi-line Argon, diode 561 nm, 594 nm HeNe en HeNe 633 nm zichtbaar lasers. Gebruik in 2-foton-modus, een gepulste femtoseconde Ti: saffier (Ti-Sa) laser, afstembare voor excitatie van 680 tot 1.080 nm met dispersie correctie. Gebruik in experimenten met rood-verschoven KP (tdTomato en mCherry), een optische parametrische oscillator (OPO) laser met de uitgang golflengte reiken tot 1,030-1,300 nm, achtereenvolgens of gelijktijdig met thij Ti-Sa laser. </li><li> Afbeelding verschillende weefsels met behulp van een HCX-IRAPO-L 25X / 0.95 NA water dompelen doelstelling (WD = 2,5 mm), een HC-PLAPO-CS 20X / 0,70 NA droge doelstelling (WD = 0,6 mm), of HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA water immersie objectief (WD = 0,6 mm). </li><li> Verkrijgen confocale fluorescentie spectra verzamelen lambda stacks (xyλ) uitgestraalde licht in 5 nm-bandbreedtes van het zichtbare spectrum van BM-cellen getransduceerd met een vector FP LEGO en controle, niet-getransplanteerde BM. <ol><li> Werkwijze beelden met de Leica LAS-AF v2.4.1 software referentie spectra van alle 5 KP en van autofluorescentie (figuur 2A) creëren. De individuele FP spectra en het verschil in helderheid fluorescentie (uitgedrukt als% van EGFP) van Cerulean (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) en mCherry (47%) op 5 opeenvolgende imaging kanalen als volgt: Cerulean (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venus (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm), en mCherry (594 / 618-670 nm) ( <strong&gt; Figuur 2B). </li><li> Valideren accurate KP scheiding, zoals cellen getransduceerd met elke individuele FP&#39;s zijn alleen zichtbaar in het overeenkomstige kanaal en afwezig zijn van de rest (figuur 2C). Daarnaast is deze gedefinieerd meerdere kanalen creëert een unieke 5-kanalen &quot;kleurendruk&quot; die na kleuranalyse en klonale volgen maakt en heeft het voordeel dat opnametijden opzichte spectrale beeldvorming. </li></ol></li><li> Afzonderlijke fluorescentie-emissie, in 2-foton modus met hoogefficiënte custom dichroitische spiegels en laat met vier kanalen niet descanned detector (NDD) als volgt: een dichroïsche spiegel 568 nm gevolgd door een dichroïsche spiegel bij 465 nm, gevolgd door een 452/45 nm emissie filter voor SHG of autofluorescentie en Cerulean, een 525/40 nm emissie filter voor EGFP of Venus, en een 648 nm dichroïde spiegel en 620/60 nm emissie-filter voor tdTomato of mCherry. <ol><li> Reveal structurele informatie door twee-foton microscopie iNtrinsic contrast beeldvorming (zoals hierboven beschreven) weefsel autofluorescentie van elastine, NADH, (geëxciteerd bij 780 nm) en tweede harmonische gegenereerde signaal (SHG) van bot en fibrillair collageen (geëxciteerd bij 920 nm of 860 nm in een back-verstrooide verzameld richting) 10,11. </li></ol></li><li> Voor 3D volume rendering, verzamel serie xyz afbeeldingen (typisch 1 x 1 x 4 micrometer 3 voxel) langs de z-as 5 urn intervallen over een bereik van diepten (150-300 urn) hele beenmerg en andere weefsels, over grote gebieden met de tegel functie van de software automatisch gestikte volumes omvattende een hele borstbeen fossae, ongeveer 2,5 x 1,2 mm2 (xy) en 300 urn (z) (figuren 2D-2E) en Film 1 genereren. <ol><li> Afbeelding calvarial direct merg door de schedel zonder snijden 2, 8. </li><li> Sectie borstbeen langs het sagittale vlak (tweedeling) en vervolgensdwars op de voeg tussen afbeelding 2 sternaal gracht en door het snijvlak 3,4,12 (overzicht in Figuur 1B aangepast van Takaku cs 3). </li></ol></li><li> Voor 4D time-lapse imaging plaatst vers uitgesneden popliteale lymfeknopen, milt, longen of calvarial botsamples uncut op 35 mm getal 0 dekglaasje kweekschalen in 50-100 pi DMEM, 10% FBS bevattende 20 mM HEPES bij 37 ° C en het gebruik van 2-photon Ti-Sa excitatie (860 nm) in combinatie met confocale excitatie (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) en Leica resonantie scanner (8000 Hz / sec), het nemen van z-stacks (~ 80 pm) bij 20 sec intervallen gedurende 1 uur. <ol><li> Voor gelijktijdige driekleurige 2P imaging gebruik Ti-Sa afgestemd op 860 nm gelijktijdig met het OPO laser (afgestemd op 1130 nm voor tdTomato, of 1.140 nm mCherry) (Film 2). </li></ol></li><li> Reconstructie en analyse van 3D-volumes en 4D tijd sequenties <ol><li> Gebruik Imaris x64 softwzijn versie 7.6, of alternatieve software pakketten om betegelde stapels ruwe beelden zetten in volume rendered (3D) data van fluorescerende cellen in beenmerg en andere weefsels en exporteren als 3D-rotatie-films, zoals eerder beschreven 3,4 (Film 1) stap voor stap voorbeeld: <ol><li> In Imaris, Open afbeelding van de z-stack; Selecteer &quot;overtreffen&quot; om het 3D volume visualisatie weergegeven. </li><li> Gebruik &quot;navigeert&quot; om het volume te draaien 360 °. </li><li> Selecteer &quot;Animation&quot; om een ​​animatie te maken; Gebruik keyframes aan geselecteerde uitzicht, zoom, rotaties van het volume toe te voegen; Bekijk een voorbeeld van de film, als nodig bewerken en sla het bestand op in een gewenste filmformaat (ex: avi, mov). </li></ol></li><li> Voor kwantitatieve bepaling van de 3D-cel kloon en frequentie posities, afmetingen en distributie verder bewerken z-stacks met de Imaris XT modules MATLAB toepassingen uitvoeren afstand meas integrerenurements (met een afstand transformatie algoritme) en clusters analyse, zoals eerder beschreven 3,4. Transformeer de sequenties van het beeld stacks na verloop van tijd in-volume gerenderde vier-dimensionale (4D) films met Imaris x64 software, en gebruik spot en oppervlakte-analyse voor semiautomated bijhouden van cel beweeglijkheid in drie dimensies met behulp autoregressieve beweging algoritmen. </li><li> Voeren multispectrale analyse van cellen als volgt: haal de multi-color label plekken door het toevoegen van alle 5 kanalen via kanaal rekenkunde van Imaris XT in een nieuw kanaal; bepalen alle spots (cellen) de gemiddelde fluorescentie-intensiteit in elk van de 5 component kanalen. De waarden in Excel software exporteren naar grafieken weergeven van de unieke &quot;kleurendruk&quot; dwz de relatieve% van elke FP in individuele cel (figuur 2E grafiek) plotten. Corrigeer de voor weefsel drift data, en bereken cel snelheid en verplaatsing in de tijd, spoor lengtes, paden en afstanden; export waarden in Excel software om grafieken te plotten. Assembleren samengestelde figuren met Adobe Photoshop CSS 5 software. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li>
<li>Takaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis+in+3+dimensions+human+and+murine+bone+marrow+architecture+visualized+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy.</a> Blood. 116, e41-e55 (2010).</li>
<li>Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clonal+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+marked+by+5+fluorescent+proteins+using+confocal+and+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy.</a> Blood. 120, e105-e116 (2012).</li>
<li>Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+ontology+%28LeGO%29+vectors+equipped+with+novel+drug-selectable+fluorescent+proteins+new+building+blocks+for+cell+marking+and+multi-gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis.</a> Gene Ther. 17, 511-520 (2010).</li>
<li>Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+panel+of+novel+lentiviral+%27gene+ontology%27+%28LeGO%29+vectors+for+functional+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis.</a> Mol Ther. 16, 698-706 (2008).</li>
<li>Weber, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGB+marking+facilitates+multicolor+clonal+cell+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking.</a> Nat Med. 17, 504-509 (2011).</li>
<li>Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transplanted+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+mouse+calvarium+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow.</a> Nature protocols. 6, 1-14 (2011).</li>
<li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cellular+dynamics+and+endosteal+location+of+aged+early+hematopoietic+progenitor+cells+revealed+by+time-lapse+intravital+imaging+in+long+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones.</a> Blood. 114, 290-298 (2009).</li>
<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys J. 82, 493-508 (2002).</li>
<li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119, 238-250 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

We beschrijven hier de details van een krachtige methodologie onlangs bedacht voor klonale cell tracking, het combineren van de grote diversiteit gegenereerd door combinatorische markering met-5FP coderen LEGO vectoren en beeldvorming met tandem confocale en 2-foton microscopie om volumetrische en dynamische beeldvorming te realiseren in levende weefsels. Dit breidde het gebruik van FP-gebaseerde kleur markering door het opnemen van confocale spectrale identiteit in 5 &quot;verschillende&quot; 8-bit kanalen. Dus de rela...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

De productie van bloedcellen, aangeduid hematopoiese wordt onderhouden door een kleine populatie van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs). Deze cellen verblijven in het beenmerg (BM) in een complex micro-omgeving niche bestaande uit osteoblasten, stromacellen, vetweefsel en vasculaire structuren, alle betrokken bij de controle van zelfvernieuwing en differentiatie 1,2. Al intact BM traditioneel ontoegankelijk voor directe waarneming is geweest, de interacties tussen HSPC en hun micro-omgeving grotendeels uncharacterized in vivo. Eerder hebben we een methodologie om de 3D-architectuur van intacte BM te visualiseren met behulp van confocale fluorescentie en reflectie microscopie 3. We kenmerk uitbreiding van EGFP gemarkeerde HSPCs in de BM, maar het gebruik van slechts een enkele FP uitgesloten analyse van regeneratie op klonale niveau. Zeer recent hebben we geprofiteerd van de Lentiviral Gene Ontology (lego) vectoren die constitutief flfluorescerende eiwitten (KP) om efficiënt cellen 4,5 markeren. Co-transductie van HSPC met 3 of 5 vectoren genereert een divers palet van combinatorische kleuren, waardoor het bijhouden van meerdere afzonderlijke HSPC klonen. Gemarkeerd HSPC combinatie met nieuwe imaging technologie toegestaan ​​om individuele HSPC homing en innesteling te traceren in de BM van bestraalde muizen. LEGO vectoren werden gebruikt om HSPC markeren met 3 of 5 verschillende KP&#39;s (van Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato en mCherry) en volg hun innesteling na verloop van tijd in de BM door confocale en 2-foton microscopie, waardoor duidelijke visualisatie van bot en andere matrix structuren, en de verhouding van HSPC klonen componenten van hun micromilieu. HSPC werden gezuiverd zoals het geslacht negatieve cellen van C57BL / 6 muizen BM, getransduceerd met vectoren LEGO en reinfused staartader injectie in myelo-geablateerd congenic muizen. Door het monitoren van grote hoeveelheden van het borstbeen BM weefsel gevisualiseerd we endosteale innesteling plaatsvindt in het begin vanBM regeneratie. Cell clusters met verschillende kleur spectra bleek aanvankelijk dicht bij het bot en vorderde gecentreerd over de tijd. Interessant, na meer dan 3 weken merg bestond macroscopische klonale clusters suggereert verspreiding van hematopoiese afgeleid van individuele HSPCs aansluitend in het merg, dan ruime verspreiding van HSPCs via de bloedbaan. Er was minder kleurendiversiteit op late tijdstippen, suggereert moeilijkheden transduceren langdurige herbevolking cellen met meerdere vectoren. Bovendien HSPCs gevormd clusters in de milt, een orgaan verantwoordelijk voor hematopoiesis in muizen. -HPSC afgeleide individuele cellen kunnen worden opgelost in de thymus, lymfeklieren, milt, lever, long, hart, huid, spier, vetweefsel en nieren van. De 3D-beelden kan kwalitatief en kwantitatief worden beoordeeld om de verdeling van cellen met minimale verstoringen van de weefsels waarderen. Tot slot, we illustrerend de haalbaarheid van live-dynamische studies in 4D door het combineren van resonante scannen multifoton en confocale time-lapse imaging. Deze methode maakt het niet-invasief hoge resolutie, multidimensionale cel-lot traceren van spectraal duidelijk celpopulaties in intacte 3D architectuur, die een krachtig hulpmiddel in de studie van weefselregeneratie en pathologie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Productie van virussen</td></tr><tr><td>LeGO-Cer2</td><td>Addgene</td><td>27338</td><td>Expressie van Cerulean</td></tr><tr><td>LeGO-G2</td><td>Addgene</td><td>25917</td><td>Expressie van eGFP</td></tr><tr><td>LeGO-V2</td><td>Addgene</td><td>27340</td><td>Expressie van Venus</td></tr><tr><td>LeGO-T2</td><td>Addgene</td><td>27342</td><td>Expressie van tdTomato</td></tr><tr><td>LeGO-C2</td><td>Addgene</td><td>27339</td><td>Expressie van mCherry</td></tr><tr><td>Calciumm Phosphate Transfectie Kit</td><td>Sigma</td><td>CAPHOS-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekschaal</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technology</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum inactief door verhitting</td><td>Sigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine</td><td>Gibco, Life Technology</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>L60</td><td></td></tr><tr><td>Millex Spuit aangedreven filter unit (0.22 &micro;m)</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Muiscelcollectie, zuivering, transductie en transplantatie</td></tr><tr><td>ACK lyse buffer</td><td>Quality Biologicals Inc.</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Lineage Cel Depletie Kit (muis)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>LS kolommen + buizen</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Separation Filters (30 &micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM serumvrij medium voor de kweek en expansie van hematopoëtische cellen (500 ml)</td><td>StemCell Technologies Inc&nbsp;</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-11 CF</td><td>R &amp; D Systems Inc</td><td>418-ML-025/CF</td><td>100 &micro;g/ml is 1.000x</td></tr><tr><td>Recombinant murine SCF</td><td>RDI Division of Fitzgerald Industries Intl&nbsp;</td><td>RDI-2503</td><td>100 &micro;g/ml is 2.000x</td></tr><tr><td>Recombinant murine IL-3</td><td>R &amp; D Systems Inc</td><td>403-ML-050</td><td>20 &micro;g/ml is 2.000x</td></tr><tr><td>FLT-3 Ligand</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-096-480</td><td>100 &micro;g/ml is 1.000x</td></tr><tr><td>12-well platen, Costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A/B</td><td>Resuspenderen bij 50 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>Protamine Sulfaat</td><td>Sigma</td><td>P-4020</td><td>4 &micro;g/ml is 1.000x</td></tr><tr><td colspan="4">Confocal en twee-foton microscopie</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro, Mediatech Inc.</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Glazen bodem kweekschaal P35G-0-20-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Glazen bodem kweekschaal P35G-0-14-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Kamerdeksel met vierkamerdeksel #1 Borosilicaat dekselglas; 4-kamer</td><td>Thermo Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes 22 mm No 2</td><td>Thomas Scientific</td><td>6662-Q55</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 AOBS vijf kanalen confocale en multi-foton microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision II -TiSaph laserbereik 680-1.080 nm</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Compact OPO laserbereik 1.030-1.350 nm</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water duikobjectief (WD=2,5 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA droge objectief (WD=0,6 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersie objectief (WD=0,6 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris software versie 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo klonale tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen gekenmerkt door five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en multiphoton

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We ontwikkeld en gevalideerd een fluorescerende markering methodologie voor klonale volgen van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPCs) met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te bestuderen in vivo hematopoiesis behulp van de muizen beenmergtransplantatie experimenteel model. Genetische combinatorische markering met behulp van lentivirale vectoren die coderen voor fluorescerende eiwitten (KP&#39;s) geactiveerd lot van de cel in kaart brengen door middel van geavanceerde microscopie beeldvorming. Vectoren die coderen voor vijf verschillende KP&#39;s: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato en mCherry werden gebruikt om gelijktijdig transduce HSPCs, het creëren van een divers palet van kleur gemarkeerd cellen. Beeldvorming met behulp van confocale / twee-foton hybride microscopie maakt gelijktijdig hoge resolutie beoordeling van unieke gemarkeerde cellen en hun nakomelingen in combinatie met structurele componenten van de weefsels. Volumetrische analyse over grote gebieden bekend dat spectraal gecodeerde HSPC-afgeleide cellen niet-invasieve wijze verschillende intacte weefsels, waaronder het beenmerg kan worden gedetecteerd (BM), Voor langere perioden na de transplantatie. Levende onderzoeken gecombineerd video-rate multiphoton enconfocale time-lapse imaging in 4D tonen de mogelijkheid van dynamische cellulaire en klonale volgen op een kwantitatieve wijze.

Whole-mount 3D confocale / 2-foton microscopie reconstructies van het borstbeen beenmerg tijdsverloop bleek de innesteling en uitbreiding van getransplanteerde co-opnamen van 5 bps in een patroon met opvallende kenmerken: klonen bleek duidelijk afgebakend, homogeen gemarkeerd met breed palet aan kleuren in eerste instantie en vooruitgang tijd preferentieel bevatten cellen van voornamelijk een kleur. Confocale microscopie opstart en representatieve voorbeelden van beeldvorming 5fps gemarkeerde HSPC in het borstbeen beenm...

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Het algemene doel van deze procedure is om fluorescent gelabelde hematopoëtische klonen in levende weefsels, waaronder het beenmerg, te volgen met behulp van een nieuwe confocale en tweefotonmicroscopiestrategie. Hiervoor worden murine hematopoëtische progenitorcellen en stamcellen geïsoleerd en co-getransduceerd met lentivirale gene ontology- of Lego-vectoren die coderen voor vijf fluorescerende eiwitten: Ian, EGFP, Venus, TD tomato en m cherry. De getransduceerde cellen worden vervolgens getransplanteerd in myelo-ablated ontvanger-muizen en na perioden tot 120 dagen worden het beenmerg en organen geoogst van de ontvanger-muizen en wordt er gecombineerde confocale en tweefotonmicroscopie uitgevoerd.De resulterende beelden worden in 3D gereconstrueerd om de locatie van fluorescentie-gemarkeerde getransplanteerde klonen en cellen in de loop van de tijd te volgen. Dit vergemakkelijkt de studie van clonale evolutie tijdens hematopoëse en het lot van uit het beenmerg afgeleide cellen in andere organen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van fysieke weefselcoupes is dat het de voordelen van hoge-resolutie beeldvorming met optische coupes via confocale microscopie combineert met de visualisatie van structurele componenten via tweefoldige microscopie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de hematologie, zoals speciale en temporele clonale analyse van de hematopoëse tijdens het herstel van het beenmerg na vroege transplantatie, met geografische bewaking van expanderende klonen over tijd. Zeer grote volumes intact dicht weefsel kunnen worden onderzocht. Zo werden bijvoorbeeld ongeveer 3000 beelden computationeel gereconstrueerd om kleurgecodeerde klonen in een sternale faux te visualiseren. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de clonale architectuur bij normale en verstoorde hematopoëse, kan deze ook worden toegepast op de studie van organregeneratie, immuunresponsen of tumormetastasepatronen.In deze procedure coderen lentivirale gen-ontologie- of Lego-vectoren voor vijf fluorescerende eiwitten: EGFP, Venus, tdTomato en mCherry. Elk fluorescerend eiwit wordt tot expressie gebracht vanuit een sterke constitutieve spleen focus forming virus- of SFFV-promotor. Na het produceren van Lego-vectoren die coderen voor de fluorescerende eiwitten en het titreren van de virale deeltjes, wordt het beenmerg geoogst uit de voor- en achterpoten van geofferde donormuizen door dissectie van de humeri, femura en tibiae.Gebruik een scalpel om alle spierligamenten en overtollig weefsel grondig van de botten te verwijderen. Snijd vervolgens over het uiteinde van elk bot, zo dicht mogelijk bij het gewricht. Gebruik een naald van 27 gauge op een spuit met I 10 medium om het beenmerg uit te spoelen in een conische centrifugebuis van 50 milliliter; centrifugeer bij 500 G en vier graden Celsius om de cellen te pelletteren.Nadat het supernatant is weggegooid om de rode bloedcellen te lyseren, voegt u 50 milliliters CK-buffer toe en centrifugeert u opnieuw zoals voorheen. Gooi vervolgens het supernatant weg en herhaal dit na het verwijderen van het tweede supernatant. Resuspendeer de cellen in 10 milliliters I 10-medium. Gebruik vervolgens een max lineage depletion kit om lineage-negatieve progenitorcellen te zuiveren volgens het gewijzigde kitprotocol dat wordt beschreven in het bijbehorende document.Zodra de lineage-negatieve cellen zijn gezuiverd, worden deze uitgeplaat in een T 75-fles bij een dichtheid van vijf keer 10⁵ cellen per milliliter in StemSpan-medium aangevuld met muis IL-3, muis IL-11, humaan Flt3-ligand en muis stamcelfactor; incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C en 5% CO2. Gebruik na twee dagen een celscraper om de cellen opnieuw te suspenderen en breng één tot vier keer 10⁵ cellen per well over naar een 12-wellplaat. Voeg vectoren toe aan de cellen in StemSpan-medium met cytokines en 4 µg/ml protaminesulfaat, bij een MOI van zes tot zeven per vector.Om het totale volume in elke put op één milliliter te brengen, dient u een enkele kleurcontrole voor elk fluorescent eiwit voor te bereiden. Resuspendeer de cellen na 24 uur met een scraper en breng ze over naar een centrifugebuis van vijf milliliter. Centrifugeer vervolgens en resuspendeer ze in StemSpan-medium zonder cytokinen; centrifugeer opnieuw en resuspendeer de cellen in 100 µL StemSpan-medium zonder cytokinen per injectie, of voor confocale microscopie of flowcytometrie.Breng ze over naar 12-wells platen met vers medium met cytokines en kweek ze nog eens 96 uur. Ter voorbereiding op de beenmergtransplantatie worden de bestraalde recipientenmuizen in een kooi onder een warmtelamp geplaatst om op te warmen. Bereid injectiespuiten voor met één tot vier keer 10⁵ lineage-negatieve cellen in 100 µL StemSpan per muis.Bereid voor elke muis één spuit voor. Wanneer de staartvenen gedilateerd zijn, zijn de muizen klaar voor injectie. Plaats de muis die geïnjecteerd moet worden in een muisfixateur en desinfecteer de staart met een watje gedrenkt in 70% ethanol.Deze stap maakt ook een betere visualisatie van de staartvene mogelijk. Injecteer vervolgens de cellen in de staartvene. Transplanteer een volledige cohort dieren met dezelfde populatie getransduceerde donorbeenmergcellen op verschillende tijdstippen tot 120 dagen na transplantatie.Neem de weefsels en organen uit voor intacte beeldvorming zonder secties te maken. Plaats individuele organen in 35 millimeter nummer nul dekglas-kweekschalen in 50 tot 100 µL koude PBS voor time-lapse beeldvorming.Plaats de organen in DMEM met 10% FBS bevattende 20 millimolar heaps bij 37 °C en beeldvorm onmiddellijk. Hierbij wordt de microscopie uitgevoerd met een omgekeerd Leica SP55 vijfkanaals confocaal en multiphotonsysteem, uitgerust met multilijn argon-diode 561 nm, heliumneon 594 nm en heliumneon 633 nm zichtbare lasers. Plaats een van de enkelvoudige Lego-getransduceerde monsters op de microscopietafel en stel scherp.Verzamel lambda-beeldstacks met bandbreedte-intervallen van vijf nanometer over het gehele lichtspectrum. Gebruik vervolgens de software om een region of interest in het beeld te selecteren en bekijk het histogram van het referentiespectrum. Sla deze gegevens op.Herhaal dit proces vervolgens voor elk fluorescent eiwit in het experiment. Gebruik daarna de verzamelde spectra van de individuele fluorescente eiwitten om de bandbreedtes in de kanaalmodus in te stellen. Om dit voor elk kanaal te doen, klikt u op de zwarte schuifregelaar en voert u de te gebruiken bandbreedte in.De gekozen bandbreedte moet het piekgebied van het excitatiespectrum van elk fluorescent eiwit omvatten, terwijl moet worden gewaarborgd dat er geen overlap is tussen de fluorescentiekanalen. Stel de gain en offset voor elke detector zo in dat het dynamische bereik van de monsteruitvoer op een detecteerbaar niveau ligt, vergelijkbaar is tussen de fluorescente eiwitten en zonder verzadiging optreedt. Bijvoorbeeld, het M cherry-eiwit is ongeveer half zo helder als EGFP, dus de gain en offset moeten worden aangepast om voor beide een vergelijkbaar dynamisch bereik te verkrijgen.Leg tot slot, in kanaalmodus, van elk controlemonster met één kleur een afbeelding vast met alle vijf de kanalen en controleer of elk fluorescent eiwit alleen zichtbaar is in het overeenkomstige kanaal en afwezig is in de overige kanalen. Zodra de spectra voor alle kanalen zijn gevalideerd, kunnen de instellingen worden opgeslagen. Deze kunnen worden geïmporteerd en gebruikt in toekomstige experimenten waarin dezelfde fluorescente eiwitten en monsterweefsels worden gebruikt.Hier wordt een combinatie van confocale en tweefotonenmicroscopie gedemonstreerd met gebruik van beenmerg uit het borstbeen, waarbij het borstbeen met een scalpel en pincet langs het sagittale vlak wordt doorsneden. Maak vervolgens een transversale snede bij het gewricht tussen twee sternale fossae. Plaats de botten met de snijkant naar beneden in een kweekschaaltje van 35 millimeter met een nummer nul dekglas, bevattend 50 tot 100 µL koud PBS; de beeldvorming vindt plaats via de snijkant.Controleer de positie van de botten in een dissectiemicroscoop. Plaats het monster op de objecttafel van de microscoop. Stel vervolgens de beeldvormingssoftware zo in dat er sequentieel twee-fotonenbeelden en signalen van de tweede harmonische generatie worden vastgelegd.Voer vervolgens een vijfkleurige confocale excitatie uit. Stel de grenzen van het Z-stack verzamelgebied in met een stapgrootte van 5 µm over een bereik van 150 tot 300 µm. Gebruik de tile-functie om de software aan te sturen om automatisch gestikte volumes te genereren die de gehele sternumfosse beslaan, ongeveer 2,5 bij 1,2 mm² in de XY-richting.Start de acquisitie om sequentieel X, Y, Z-beelden te verzamelen in alle vijf de kanalen, aangevuld met tweefotonmicroscopie met een tweede-harmonische generatiesignaal van bot en fibrillair collageen voor 4D time-lapse imaging. Plaats vers uitgenomen, ongesneden monsters van de popliteale lymfeknoop, milt, long of schedelbot op 35 millimeter nummer nul dekglas-cultuurschaaltjes in 50 tot 100 µL DMEM met 10% FBS en 20 mM HEPES bij 37 °C.Plaats het monster op de verwarmde microscopietafel. Schakel vervolgens in de software de acquisitieparameters om naar tweefoton titanium-sapphire-excitatie bij 860 nanometers in combinatie met confocale excitatie en de Leica-resonantiescanner op 8.000 hertz per seconde. Voor het maken van 80 micron Z-stacks met intervallen van 22 seconden gedurende maximaal één uur voor simultane driekleurige tweefoton-beeldvorming, moet de software worden ingesteld om de titanium-sapphire-laser afgesteld op 860 nanometers simultaan te gebruiken met de OPO-laser afgesteld op 1.130 nanometers voor TD-tomaat of 1.140 nanometers voor M-cherry.Start ten slotte de acquisitie om vier D-beelden te verzamelen. Zoals eerder beschreven, voert u na het verzamelen van alle beelden de 3D- en 4D-reconstructie en -analyse uit met de 64-bits versie van Amer of vergelijkbare software. Open het Z-stack-beeld en selecteer 'surpass' om de 3D-volumevisualisator weer te geven.Gebruik vervolgens Navigate om het volume 360 graden te draaien. Selecteer daarna animatie. Gebruik keyframes om geselecteerde weergaven, zoom en rotaties van het volume toe te voegen.Bekijk de film en bewerk deze indien nodig. Sla het bestand tot slot op in het gewenste filmformaat om de clonale geschiedenis van fluorescentie-gemarkeerde hematopoëtische stam- en progenitorcellen te volgen. Donorcellen die cotransduceerd waren met vijf verschillende Lego-vectoren werden getransplanteerd in een recipiënte muis, waarna het sternale beenmerg werd afgebeeld en geanalyseerd zoals beschreven in deze video.Vier dagen na transplantatie waren clusters cellen, gemarkeerd in een grote verscheidenheid aan kleuren, zichtbaar in nauwe nabijheid van de botrand, die in het wit wordt weergegeven. Tegen dag 31 was een grote kloon met een unieke groengele kleur uitgebreid om de gehele fossa te bezetten, zoals geïllustreerd in zowel de samengevoegde als de enkelkanaalsbeelden. Analyse van de FPS-inhoud toonde homogene markering aan door twee FPS-varianten, EGFP en Venus.Deze 3D-reconstructievideo demonstreert de ruimtelijke architectuur van de gemarkeerde klonen ingebed in het borstbeen. Deze afbeelding toont een voorbeeld van uit het beenmerg afgeleide cellen in de popliteale lymfeknoop 120 dagen na transplantatie. Verspreide cellen zijn grotendeels geel en rood gemarkeerd en worden perifeer omringd door collageenvezels, weergegeven in het wit in het hart bekeken vanaf de epicardiale zijde.Talrijke individuele cellen zijn zichtbaar tussen de in het wit weergegeven cardiomyocyten, gevisualiseerd door hun twee-foton autofluorescentie bij 780 nanometer. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in enkele dagen worden uitgevoerd als deze correct wordt toegepast. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van organregeneratie en -ontwikkeling en stelde het biologen in staat om ruimtelijk-temporele arrangementen van clonaal complexe cellulaire en structurele elementen te onderzoeken via multicolor labeling en confocale en twee-foton imaging.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een fluorescentiemerkingsmethodiek ontwikkelt voor het traceren van de clonale markering van hematopoëtische stam- en progenitorcellen in levende organen.

in-vivo-clonal-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells-marked

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Voor de evaluatie van nieuwe stamcellen therapieën is het belangrijk om niet-invasief spoor de geïnjecteerde cellen in vivo. Deze video toont u hoe de menselijke mesenchymale en embryonale stamcellen met ijzeroxide gebaseerde contrastmiddelen label in vivo voor latere MR imaging in vivo.

Etikettering hESC &#39;s en hMSCs met ijzeroxide nanodeeltjes voor niet-invasieve in vivo Tracking met MR Imaging

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Source: Gómez-Villafuertes, R., et. al., Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations. J. Vis. Exp. (2017) The video demonstrates the process of preparing, imaging, and tracking adult neural stem cells in real time to study cellular behaviors, including division and differentiation.

 Live Imaging and Single-Cell Tracking to Monitor Neural Lineage in Adult Neural Stem Cells

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling, groei en in vivo beeldvorming van NK cellen uit hESCs en iPSCs.

Ontwikkeling, uitbreiding en<em&gt; In vivo</em&gt; Controle van Human NK cellen uit menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) en en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)

Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Kwantitatieve meting van botvoorlopercellen functie de genezing van breuken vereist hoge resolutie seriële imaging technologie. Hier zijn protocollen voorzien met intravitale microscopie en osteo-lijn volgen sequentieel beeld en kwantificeren van de migratie, proliferatie en differentiatie van endogene osteogene stam / voorlopercellen in het proces van het herstellen botbreuken.

Sequentiële<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van Osteogeen Stam / progenitorcellen Tijdens Fracture Repair

De aard van de interactie tussen hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) en beenmerg nissen wordt slecht begrepen. Aangepaste hardware wijzigingen en een meerstaps overname protocol maken het gebruik van twee-foton en confocale microscopie beeld ex vivo gemerkte HSPCs geadopteerd in beenmerg gebieden volgen interacties en beweging.

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Monocyten zijn belangrijke regulatoren van aangeboren immuniteit en spelen een cruciale rol bij de vernieuwing van het perifere mononucleaire fagocytische systeem en in geval van ontsteking. Dit manuscript beschrijft de procedure van realtime beeldvorming van het muiscalvaria beenmerg om het mechanisme van monocytmobilisatie te bestuderen.

Tracking muisbeenmerg Monocyten<em&gt; In Vivo</em

In dit artikel beschrijven we de principes voor het ontwerpen en uitvoeren van een multi-kleurig lijn-traceringsexperiment met behulp van R26R-Confetti muizen. We bieden een specifiek protocol voor het volgen van hoornvliesepitheelcellen die kunnen worden aangepast voor andere weefsels van belang.

Een methode voor Lineage Tracing van hoornvliescellen De Multi-kleur Fluorescent Reporter Muizen

Intravital fluorescentie microscopie (IVFM) van de calvarium wordt toegepast in combinatie met genetische diermodellen om de homing en engraftment van hematopoietische cellen in het beenmerg (BM) niches te studeren.

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Leer klonale tracking van hematopoëtische stam- en progenitorcellen in vivo met behulp van confocale en multiphoton microscopie. Deze methode maakt 3D-visualisatie van celgedrag en regeneratie in het beenmerg mogelijk.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton (Video) | JoVE Journal

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

Meer video's verkennen