Name: Meting van Metabolic Rate in Drosophila Gebruik respirometrietest (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 31 s
Description: Leer de relatieve metabole snelheid meten in Drosophila melanogaster door CO2-productie te bepalen met respirometrie. Deze methode vergelijkt experimentele en controlegroepen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij willen Max-Planck Society bedanken voor de financiering van ons onderzoek.

1. Bereiding van respirometers <ol><li> Snijd de 1000 ul pipet tip met een scheermesje om het inbrengen van de 50 pl capillaire micropipet toelaten, proberen om de pipet tip zo recht mogelijk te krijgen. </li><li> Leg een stuk schuim in de pipet en duw hem in de pipet tip. </li><li> Voeg een kleine hoeveelheid CO 2 absorberend en indammen door een tweede stuk schuim. </li><li> Breng lijm op de plaats waar de micropipet in de pipet tip is geplaatst. </li><li> Laat de respirometer s nachts zodat de lijm drogen. Een schema van een respirometer is weergegeven in figuur 1A. </li></ol> 2. Voorbereiding van de meetkamer <ol><li> Bereid de kamer oplossing door het mengen van water met eosine in een verhouding die zal resulteren in zichtbare inkleuring. </li><li> Giet het eosine / water-oplossing in de kamer. </li><li> Label een van de zijwanden van de kamer met een centimeter schaal. </li></ol><ol><li> Label de individuele respirometers met een marker. </li><li> Verdoven vliegen een alternatieve methode tot CO2 en plaats 3-5 vliegen van het gewenste genotype in elke respirometer. </li><li> Dicht de respirometers stevig aan de top met behulp van plasticine stopverf. </li><li> Laat vliegen om te herstellen van verdoving voor ongeveer 15 minuten. </li><li> Bereid een respirometer zonder vliegen, die zal worden gebruikt als de atmosferische controle. </li></ol> 4. Uitvoeren van het Experiment <ol><li> Hang het respirometers in de kamer door het aanbrengen van een 1,5 ml Eppendorf buisje houder die openen op de bovenkant en de bodem op de bovenzijde van de kamer is. </li><li> Plaats respirometers met de micropipet tip naar beneden in de kamer waardoor de tip om onderdompelen in de gekleurde oplossing. </li><li> Voeg Vaseline tussen de deksel deksel en de kamer om sterker isolatie voorzien van temperatuur en druk fluctaties. </li><li> Sluit het deksel en laat het systeem in evenwicht gedurende 15 minuten. </li><li> Neem een foto van de kamer om ervoor te zorgen dat het niveau van de vloeistof in elk micropipet zichtbaar is en dus is de schaal (zie voorbeeld in figuur 1B). </li><li> Na 1-2 uur, neem een ​​ander beeld. </li><li> Als experiment is voltooid, verwijdert de vliegen uit respirometers en wegen indien gewenst of breng ze terug naar de flacon of verdere nodig. </li></ol> 5. Analyse van de resultaten <ol><li> Open verkregen beelden met behulp van ImageJ software 11. </li><li> Met behulp van de schaal voor elke afbeelding, stel de pixel scaling in de software. </li><li> Meet de afstand (waarde van te meten) dat de vloeistof reisde van een bepaalde verwijzing plek in beelden die aan het begin (d1) en het einde van het experiment (d2). Een schematisch voorbeeld wordt getoond in figuur 1C. </li><li> Bereken de hoeveelheid geproduceerde CO2 (pl / uur / fly) met de formule: </li></ol><img alt="Figuur 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51681/51681eq1.jpg" /> R = straal van micropipet buis in centimeters Waarde van te meten = afstand van de vloeistof is opgeschoven in de micropipet van de monsters gemeten in centimeters Δc = afstand van de vloeistof is opgeschoven in de micropipet van de negatieve controle monster (zonder vliegen) n = aantal vliegen gebruikt h = uur

<ol><li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+%26%2334%3Brate+of+living%26%2334%3B+model%3A+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Testing the &#34;rate of living&#34; model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).</li>
<li>Ross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-specific+decrease+in+aerobic+efficiency+associated+with+increase+in+oxygen+free+radical+production+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).</li>
<li>van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+contribution%3A+long-lived+Drosophila+melanogaster.+lines+exhibit+normal+metabolic+rates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates.</a> J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).</li>
<li>Hulbert, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin%2FIGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).</li>
<li>Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+modulates+metabolic+rate+and+temperature+sensitivity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+temperature+preferences+and+energy+homeostasis+in+dystroglycan+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants.</a> Science. 323, 1740-1743 (2009).</li>
<li>Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+muscular+dystrophy%3A+a+genetic+screen+for+dystroglycan+and+dystrophin+interactors+in+Drosophila.+identifies+cellular+stress+response+components%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components.</a> Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).</li>
<li>Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperthermic+seizures+and+aberrant+cellular+homeostasis+in+Drosophila+dystrophic.+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles.</a> Scientific Reports. 1, 47 (2011).</li>
<li>Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+and+metabolism+in+Drosophila+melanogaster%3A+genetic+correlations+between+life+span+and+age-specific+metabolic+rate+in+populations+artificially+selected+for+long+life%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life.</a> Genetics. 169, 231-242 (2005).</li>
<li>Elia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+equivalents+of+CO2+and+their+importance+in+assessing+energy+expenditure+when+using+tracer+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques.</a> The American Journal of Physiology. 260, (1991).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Bharucha, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicurean+fly%3A+using+Drosophila+melanogaster.+to+study+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism.</a> Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).</li>
<li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+flies+and+men%3A+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biology. 11, 38 (2013).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

In dit protocol beschrijven we een goedkope en betrouwbare methode voor het meten van CO 2 in vliegen. We vonden dat dit experiment is eenvoudig, snel uit te voeren en genereert reproduceerbare gegevens die in overeenstemming is met andere studies 1, 6, 9. Het protocol hier beschreven kan eenvoudig worden aangepast aan elk laboratorium het budget en de beschikbare materialen passen. De constructie van elk respirometer kan zolang de ruimte blijft luchtdicht aangepast. Echter, de langere, dunnere mic...

De biochemische cyclus Krebs genereert ATP door oxidatie van acetaat verkregen uit koolhydraten, vetten en eiwitten produceren CO2. In Drosophila, O 2-ingang is direct gecorreleerd met de CO 2-uitstoot en weerspiegelt het niveau van het metabolisme 1. Zo, de meting van de CO 2-uitstoot is met succes gebruikt in studies met betrekking tot veroudering en metabolisme 2-5. Hier ons laboratorium heeft gewijzigd ontwierp eerder experimentele opstellingen, waardoor de meting van de CO 2-productie in maximaal achttien monsters zonder dat een gespecialiseerde apparatuur. Anderen en we eerder hebben gebruikt deze methode om verschillen in de stofwisseling in vliegen die deficiënt zijn in de spierdystrofie geassocieerd eiwit, Dystroglycan (DG) 6-8 zijn te tonen. O 2 voor oxidatief metabolisme wordt omgezet in CO2, die wordt uitgestoten als respiratoire afval. De bouwtie van handgemaakte respirometers beschreven waarmee voor de bepaling van het percentage O2 verbruikt. Vliegen worden in een afgesloten container met een stof die absorbeert uitgestoten CO 2, efficiënt elimineren uit de gasfase. De verandering in volume gas (verminderde druk) wordt gemeten door de verplaatsing van vloeistof in een glazen capillair bevestigd aan het gesloten respirometer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de andere kosten. Eerdere studies hebben de CO 2-productie door Drosophila met gas analysers en technisch geavanceerde systemen respirometry 1,9 gemeten. Ondanks de meer complexe apparatuur, de gevoeligheid van de hier beschreven werkwijze is vergelijkbaar met gerapporteerde waarden (tabel 1). Daarnaast zijn verscheidene andere groepen variaties van deze techniek gebruikt om de relatieve stofwisseling in Drosophila 4-6 bepalen. Daarom kan deze test worden gebruikt reliab genererenle, reproduceerbare gegevens Drosophila metabolisme relevant zonder aankoop van speciale apparatuur die geïnstalleerd kan worden in elk laboratorium en kan worden gebruikt voor educatieve doeleinden. In het algemeen aanvaarde het metabolisme van een organisme te bepalen is het meten van de CO 2, O 2 verbruikt, of beide 3,4,9. Hoewel, kan worden aangenomen dat een equivalent O 2 genereert een equivalent CO2, de precieze verhouding CO 2 gegenereerd is afhankelijk van de metabole substraat 10 gebruikt. Zo nauwkeurig bepalen van de stofwisseling in energie-eenheden moet meten zowel O2 verbruikt en CO2 geproduceerd. Hierdoor de hier beschreven werkwijze is bijzonder relevant vergelijken verschillen CO 2 productie tussen dieren en niet de absolute waarde. Onze techniek integreert meerdere dierlijke productie van CO 2 over een periode van time (1-2 uur) en derhalve geeft een gemiddelde activiteit van de dieren. Als er reden is om aan te nemen dat de proefdieren zijn minder actief dan de controle dieren de meting kan verschillende niveaus van activiteit en niet noodzakelijk overeen met de stofwisseling.

<table><tbody><tr><td>BlauBrand IntraMark 50 &micro;l micropipettes</td><td>VWR</td><td>612-1413</td><td></td></tr><tr><td>Soda Lime</td><td>Wako</td><td>CDN6847</td><td></td></tr><tr><td>Eosine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>031M4359</td><td>Elke kleurstof die zichtbare kleuring van vloeistoffen kan veroorzaken kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber</td><td>VWR</td><td>21432-761</td><td>Elke transparante glazen kamer die kan worden gesloten met het deksel</td></tr><tr><td>Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit</td><td>Flinn</td><td>FB1438</td><td></td></tr><tr><td>Power Gel Glue</td><td>Pritt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipett tips</td><td>Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schuim</td><td>Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaesticine Putty</td><td>Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Elk</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

meting van metabolic rate in<em&gt; drosophila</em&gt; gebruik respirometrietest

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabole stoornissen zijn een frequent probleem dat de menselijke gezondheid. Daarom is het begrijpen van de mechanismen die metabolisme regelen is een belangrijke wetenschappelijke opdracht. Vele ziekteveroorzakende genen bij de mens een vlieg homoloog, Drosophila waardoor een goed model om signalerende wegen betrokken bij de ontwikkeling van verschillende aandoeningen te bestuderen. Daarnaast is de traceerbaarheid van Drosophila vereenvoudigt genetische screens om te helpen bij het ​​identificeren van nieuwe therapeutische targets die de stofwisseling kunnen reguleren. Om dergelijk scherm uitvoeren van een eenvoudige en snelle methode om veranderingen in de metabole toestand van vliegen identificeren noodzakelijk. In het algemeen, carbon dioxide is een goede indicator substraat oxidatie en energieverbruik met informatie over metabole toestand. In dit protocol introduceren we een eenvoudige methode om de CO 2-uitstoot van vliegen te meten. Deze techniek kan mogelijk helpen bij de identificatie van genetische storingen die stofwisseling.

Om aan te tonen dat de methode is gevoelig we gemeten CO 2-productie van wild-type (Oregon R) mannelijke vliegt op 18, 25 en 29 ° C en vliegt mutant voor Dg. Vliegen zijn gerezen bij 25 ° C en vervolgens verschoven naar de experimentele temperatuur gedurende 5 dagen voorafgaand aan de meting. Zoals verwacht voor deze ectothermic soort, de hoeveelheid CO 2 verhoogd met de temperatuur (fig. 2). We hebben in het verleden aangetoond dat een suikervrij dieet vermindert...

Metabole stoornissen behoren tot een van de meest voorkomende ziekten bij mensen. De genetisch handelbaar modelorganisme D. melanogaster kan worden gebruikt om nieuwe genen te identificeren die metabolisme regelen. Dit artikel beschrijft een relatief eenvoudige methode die het mogelijk maakt het bestuderen van de stofwisseling in vliegen door het meten van hun CO 2-productie.

Meting van Metabolic Rate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gebruik respirometrietest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Het doel van deze procedure is om de relatieve metabolische snelheden van vliegen te bepalen door hun koolstofdioxideproductie te meten. Dit wordt bereikt door de vliegen eerst in speciaal geprepareerde respiratiebarometers te plaatsen. Vervolgens worden de respiratiebarometers met de vliegen in een chromatografiekamer geplaatst, waarbij ze in contact komen met een gekleurde waterige oplossing.Na verloop van tijd migreert de vloeistof naar de respirometer door de afnemende druk die wordt veroorzaakt door de verwijdering van uitgestoten koolstofdioxide uit de gasomgeving ervoor en erna. Afbeeldingen van het experiment worden gebruikt om de hoeveelheid geproduceerde koolstofdioxide te berekenen op basis van de afmetingen van de capillaire respirometer. Uiteindelijk maken de in deze assay verkregen gegevens een vergelijking mogelijk van de relatieve metabole snelheden tussen de experimentele vliegen en de controlevliegen.Begin met het zo recht mogelijk afsnijden van een 1000 µL pipetpunt met een scheermesje en plaats de micropipet in de 1000 µL pipetpunt. Plaats vervolgens een stukje schuim in de pipet en duw dit naar beneden. Voeg daarna een kleine hoeveelheid sodakalk toe en zet dez

measurement-of-metabolic-rate-in-drosophila-using-respirometry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een methode voor de meting van brandstofoxidatie in Drosophila melanogaster waarbij sporenhoeveelheden van specifieke radioactief gelabelde metabole substraten aan vliegen worden gevoerd. Het uitgeademde radioactief gelabelde CO2 dat wordt geproduceerd uit brandstofoxidatie wordt verzameld en gemeten.

Meting van de productie van koolstofdioxide uit Radioactief gemerkt Substrates in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.

Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen

Coulometrische respirometrie is ideaal voor het meten van de stofwisseling van kleine organismen. Bij correctie voor Drosophila melanogaster in de huidige studie lag de gemeten O2-consumptie binnen het bereik dat in eerdere studies werd gerapporteerd voor wildtype D. melanogaster.  Het verbruik van O2 per vlieg door vatmutanten , die kleiner en minder actief zijn, was significant lager dan bij het wildtype.

Meting van O2-verbruik in Drosophila melanogaster met behulp van coulometrische microrespirometrie

Hier presenteren we een respirometrieprotocol met hoge resolutie om bio-energetica in PINK1B9-null mutante fruitvliegjes te analyseren. De methode maakt gebruik van het SUIT-protocol (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Analyse van de mitochondriale functie in een Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-mutant met behulp van respirometrie met hoge resolutie

In deze video artikel beschrijven we een nieuwe methode waardoor de bouw van odorant hellingen met een stabiele en controleerbaar geometrieën. We in het kort laten zien hoe deze gradiënten gebruikt kunnen worden om te screenen op olfactorische defecten (volledige en gedeeltelijke anosmie) en meer subtiele kenmerken van chemotaxis gedrag te bestuderen.

Hoge-resolutie Meting van Geur-Driven gedrag in Drosophila Larven

Drosophila melanogaster is een krachtige modelorganisme voor het verkennen van de moleculaire basis van de levensduur regelgeving. Dit protocol gaat in op de stappen die betrokken zijn bij het genereren van een reproduceerbare, populatie-gebaseerde meting van de levensduur en mogelijke valkuilen en hoe ze te vermijden.

Meting van de levensduur in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Meting van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) is de gouden standaard voor de nierfunctie beoordeling. Hier beschrijven we een high-throughput methode die de bepaling van GFR in bewuste muizen met een enkele bolusinjectie, bepaling van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-inuline in plasma en berekening van GFR door een bifasisch exponentieel model laat.

Een High-throughput-methode voor meting van de glomerulaire filtratiesnelheid in Conscious Muizen

Hier beschrijven we een methode voor een snelle en nauwkeurige meting van vliegprestaties in Drosophila, waardoor high-throughput screening.

Een verbeterde methode voor nauwkeurige en snelle meting van Vliegprestaties in<em&gt; Drosophila</em

Dit rapport beschrijft een methode voor het meten van Drosophila larvenactiviteit met behulp van de TriKinetics Drosophila Activiteitsmonitor. Het apparaat gebruikt infraroodstralen om bewegingen van maximaal 16 individuele dieren te detecteren. Gegevens kunnen worden geanalyseerd om bewegingsparameters weer te geven, inclusief snelheden en de posities van de dieren binnen de testkamers.

Meting van larvale activiteit in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Leer de relatieve metabole snelheid meten in Drosophila melanogaster door CO2-productie te bepalen met respirometrie. Deze methode vergelijkt experimentele en controlegroepen.

Meting van Metabolic Rate in

Meer video's verkennen