Generatie en zuivering van Human INO80 chromatine remodeling Complexen en subes

Het doel van deze procedure is het genereren en zuiveren van wild-type en mutante versies van de multi-subeenheid in het NO80-chromatineremodelleringscomplex. Dit wordt bereikt door eerst de kernen te isoleren uit cellen die Flag-epitope-getagde NO80-eiwitten tot expressie brengen. In de tweede stap worden kernextracten voorbereid, waarna de wild-type of mutante humane NO80-chromatineremodelleringscomplexen worden gezuiverd via Anti-Flag affiniteitschromatografie. Uiteindelijk kan de subeenheidssamenstelling van de gezuiverde NO80-complexen worden geanalyseerd via western blot of zilverkleuring.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over hoe de subeenheden van MultiPro-chromatineremodelleringscomplexen bijdragen aan hun algehele activiteit. Deze methode is specifiek ontworpen voor het bestuderen van wild-type en gemuteerde versies van het NO 80-chromatineremodelleringscomplex, maar kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van andere nucleaire complexen met meerdere subeenheden, zoals het mediatorcomplex.

De meest kritische stap van de procedure is de kernextractie. Problemen ontstaan meestal doordat het zout tijdens de zoutextractiestap te snel of te krachtig wordt toegevoegd. Transfer de HEC 2 9 3-cellen na kweek in roller bottles naar een maatkegelvormige buis van geschikte grootte en centrifugeer deze 10 minuten bij 1000 ×g en 4 °C. Meet na het verwijderen van het supernatant het volume van de gepakte celpellet, resuspendeer de pellet vervolgens in vijf keer het celvolume van buffer A door voorzichtig te pipetteren en incubeer de cellen exact 10 minuten op ijs.

Nadat de cellen opnieuw zijn gecentrifugeerd, meet u het celpellet voor een tweede keer; de omvang zou tot twee keer zo groot moeten zijn geworden. Resuspendeer de cellen nu in twee celvolumes buffer A en breng de celsuspensie over naar een weefselhomogenisator van een passende grootte. Homogeniseer de celsuspensie met de losse glazen stamper totdat 90% van de cellen positief kleurt met tryaanblauw. Centrifugeer de gehomogeniseerde cellen in een centrifugebuis van 45 ml voor 20 minuten bij 25 000 ×g en 4 °C in een rotor met vaste hoek. Verwijder vervolgens het supernatant dat de cytosolische eiwitten bevat van het nucleair pellet om de kernen met zout te extraheren.

Voeg nu 2,5 milliliter buffer C toe aan het pellet voor elke drie milliliter van het oorspronkelijke gepakte celvolume. Los vervolgens met een serologische pipette het pellet los van de wand van de buis en breng het gehele mengsel over naar een homogenisator van passende grootte. Homogeniseer het mengsel met twee slagen van een losse stamper om de kernen opnieuw te suspenderen en breng de resuspendeerde kernfractie vervolgens over naar een gekoeld bekerglas van een zodanige grootte dat de suspensie het bekerglas tot een diepte van ten minste 0,5 centimeter vult.

Bereken vervolgens het volume van vijf molar natriumchloride dat nodig is om de oplossing naar een eindconcentratie van 0,42 molar natriumchloride te brengen volgens de volgende formule. Voeg nu het berekende volume zoutoplossing druppel voor druppel toe, terwijl de suspensie op ijs voorzichtig met een glazen staafje wordt geroerd, om de zoutconcentratie van de suspensie te verhogen totdat al het natriumchloride is toegevoegd en de oplossing zeer viskeus wordt. Breng de viskeuze suspensie vervolgens voorzichtig over in polycarbonaatbuizen van 70 milliliter in een Type 45 TI rotor met dopset en gebruik een mutator om de afgesloten buizen langzaam te schudden bij vier graden Celsius. Ultracentrifugeer de monsters na 30 minuten in een TI 45 rotor gedurende 30 minuten bij 40.000 ×g en vier graden Celsius, en breng de kernextracten die de supernatanten bevatten over in één plastic container.

Verdeel vervolgens de nucleaire extractoplossing in handige aliquots, vries deze snel in met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C. Om Anti-Flag aros voor immunopurificatie voor te bereiden, begint u met een 200 µL pipet waarbij de punt is afgesneden om 200 µL van een 50% Anti-Flag aros bead slurry over te brengen naar een 1,5 mL microcentrifugebuisje. Breng de vooraf gewassen beads over naar een conische buis met 10 mL vers ontdooid nucleair extract en laat dit incuberen bij 4 °C met langzame rotatie op een laboratoriumrotator, waarna de flag aros worden verzameld door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 1000 ×g en 4 °C.

Was daarna het kraalelektraat P in 10 milliliters Lysis 450-buffer gedurende vijf minuten bij 4 °C met zachte schudbewegingen op een rotator. Centrifugeer vervolgens het mengsel van kraalelektraat om de korrels neer te slaan. Resuspendeer het pellet in 100 tot 150 microliters verse Lysis 450 en breng de kralen over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Spoel de conische buis van 15 milliliter door met 100 tot 150 microliter Lysol 50 totdat alle beads zijn overgebracht naar de microcentrifugebuis. Nadat de beads in een microcentrifuge zijn gecentrifugeerd, worden ze drie keer gewassen met één milliliter Lysol 50 en één keer met één milliliter EB 100-buffer. Voeg vervolgens 200 microliter EB 100-buffer met flag-peptide toe om de gebonden eiwitten te elueren en incubeer het monster bij vier graden Celsius op een rotator.

Na een half uur worden de beads gepellet in de microcentrifuge en wordt het supernatant dat het geëlueerde OAC C-complex bevat overgebracht naar een nieuwe microcentrifugebuis. Na het viermaal herhalen van de elutie wordt het verzamelde eluaat door een lege spincolumn geleid om eventuele resterende flag aero beads uit de proteïnefractie te verwijderen. Gebruik tot slot een centrifugaal ultrafiltratieapparaat met een molecular weight cutoff van 50.000 om de geëlueerde proteïnefractie ongeveer 10-voudig te concentreren.

Zoals in deze figuur wordt geïllustreerd, kan de zuiverheid van de NO 80-complexen die zijn geprepareerd met de aangegeven flag-tag-subunits, zoals zojuist gedemonstreerd, worden beoordeeld met behulp van zilvergekleurde SDS-polyacrylamidegels. Eventuele eiwitten die in deze controlebaan verschijnen, zijn contaminanten die aspecifiek binden aan flag aeros. Deze labels geven de banden aan die overeenkomen met de geteste NO 80-subunits, en deze geven de mobiliteit van de molecuulgewichtmarkers aan.

De positie van het wildtype NO 80 wordt aangegeven door het zwarte vierkant, en de posities van de NO 80-mutanten worden aangegeven door de open cirkels. De banen die door de zwarte lijn worden gescheiden, zijn afkomstig van afzonderlijke gels. De samenstelling van de complexen kan worden beoordeeld via Western blotting met antilichamen tegen verschillende NO 80-subunits.

Bijvoorbeeld. Hier werden de subunits van het endterminale domeinmodule, de met het helicasecentrum geassocieerde module en de SNF2-module beoordeeld. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek binnen één dag worden voltooid, beginnend met het oogsten van de cellen en eindigend met de zuivering van de complexen.

Deze techniek stelt onderzoekers in staat om multi-subunit complexen en subcomplexen uit zoogdiercellen te zuiveren om hun functies te bestuderen. Na het bekijken van deze video heeft u een beter inzicht in het zuiveren van chromatine-remodelleringscomplexen en andere multi-subunit proteïnecomplexen uit menselijke cellen of andere zoogdiercellijnen.