Generatie en zuivering van Human INO80 chromatine remodeling Complexen en subes
23 oktober 2014
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het genereren en het zuiveren van wild type en mutante versies van de menselijke INO80 chromatin remodelling complex. Epitoop-gemerkte versies van INO80 subeenheden zijn stabiel tot expressie gebracht in HEK293-cellen en volledige complexen en complexen ontbreekt specifieke sets van subeenheden gezuiverd door immuno-affiniteitschromatografie.
Het doel van deze procedure is om wild type en mutante versies van het multi-subeenheid in oh 80 chromatine-hermodelleringscomplex te genereren en zuiveren. Dit wordt bereikt door eerst de kernen te isoleren van cellen die flag-epitoop getagde in O 80-eiwitten tot expressie brengen. In de tweede stap worden nucleaire extracten bereid en vervolgens worden de wild type of mutante humane in O 80 chromatine-hermodelleringscomplexen gezuiverd door Anti-Flag aros chromatografie. Uiteindelijk kunnen de subeenheidsamenstellingen van de gezuiverde NO 80-complexen worden geanalyseerd door middel van western blot of zilverkleuring.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen over hoe de subeenheden van MultiPro chromatine-hermodelleringscomplexen bijdragen aan hun algehele activiteit. Deze methode is specifiek ontworpen voor het bestuderen van wild type en mutante versies van het NO 80 Chromatine Remodeling complex, maar kan ook worden gebruikt om andere multi-subeenheid nucleaire complexen te bestuderen. Zoals de mediator.
De meest kritische stap van de procedure is de nucleaire extractiestap. Mensen komen meestal problemen tegen omdat tijdens de zoutextractiestap mensen de neiging hebben om te snel of te krachtig zout toe te voegen Na cultuur in rollerflessen, breng de HEC 2 9 3 cellen over naar een geschikt bemaat gesneden conische buis en draai ze 10 minuten bij 1000 keer G en vier graden Celsius. Verwijder na het verwijderen van het supernatant het volume van de gepakte cellenpellet, en suspendeer vervolgens de pellet in vijf keer het celvolume buffer A met zacht pipetteren en incubeer de cellen gedurende exact 10 minuten op ijs.
Nadat de cellen opnieuw zijn afgecentrifugeerd, meet u de cellenpellet een tweede keer, deze zou tot tweemaal zo groot moeten zijn. Dit keer suspendeert u de cellen in twee keer het celvolume buffer A en brengt u de celsuspensie over naar een geschikt bemaat neerwaartse weefselhomogenisator en homogeniseert u de celsuspensie met de losse glazen stamper tot 90% van de cellen positief kleurt met trian blauw centrifuge, de gehomogeniseerde cellen in een 45 milliliter hoge snelheid centrifugebuis gedurende 20 minuten bij 25.000 keer G en vier graden Celsius in een vaste hoek rotor. Verwijder vervolgens het SUP nataat dat de cytosolische eiwitten bevat van de nucleaire pellet om de kernen met zout te extraheren.
Voeg nu 2,5 milliliter buffer C toe, maar elke drie milliliter van het beginvolume van de gepakte cellen, aan de pellet. Gebruik vervolgens een serologische pipet om de pellet los te maken van de wand van de buis en breng het hele mengsel over naar een neerwaartse homogenisator van geschikte grootte. Homogeniseer het mengsel met twee slagen van een losse stamper om de kernen opnieuw te suspenderen en breng vervolgens de gesuspendeerde nucleaire fractie over in een gekoelde beker van zo'n formaat dat de suspensie de beker ten minste 0,5 centimeter diep zal vullen.
Bereken vervolgens het volume vijf molaar natriumchloride dat nodig is om de oplossing tot een eindconcentratie van 0,42 molaar natriumchloride te brengen volgens de volgende formule. Voeg vervolgens geleidelijk het berekende volume zoutoplossing druppelsgewijs toe terwijl u de suspensie voorzichtig roert met een glazen staaf op ijs om de zoutconcentratie van de suspensie te verhogen totdat al het natriumchloride is toegevoegd en de oplossing zeer viskeus wordt. Breng vervolgens de viskeuze suspensie voorzichtig over in 70 milliliter polycarbonaatbuizen in een Type 45 TI rotor met kapsamenstelling en gebruik een mutator om de verzegelde buizen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius langzaam heen en weer te schudden. Ultracentrifugeer de monsters vervolgens in een TI 45 rotor gedurende 30 minuten bij 40.000 keer G en vier graden Celsius, en trek de nucleaire extract bevattende supernatanten in een enkele plastic container.
Verdeel vervolgens de nucleaire extractoplossing in handige maat porties, snap ze ingeslagen in vloeibaar stikstof en bewaar ze bij min 80 graden Celsius. Om Anti-Flag aros voor immunozuivering voor te bereiden, begint u met het gebruik van een 200 microliter pipet met de punt afgesneden om 200 microliter over een 50% Anti-Flag aros kralen suspensie over te brengen in een 1,5 milliliter micro centrifugeerbuis. Breng de voorgewassen kralen over in een conische buis met 10 milliliter vers ontdooid nucleair extract gedurende uren bij vier graden Celsius met langzame rotatie op een laboratoriumrotator, en verzamel vervolgens de flag aros door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 1000 keer G en vier graden Celsius.
Was vervolgens de bead extract P in 10 milliliter lice vier 50 buffer gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius met voorzichtig schudden op een mutator. Breng na het afcentrifugeren van het bead extract mengsel de pellet opnieuw in suspensie in 100 tot 150 microliter vers lice vier 50, breng de kralen over naar een 1,5 milliliter micro centrifugeerbuis.
Ga door met het spoelen van de 15 milliliter conische buis met 100 tot 150 microliter vatjes Lysol 50 totdat alle kralen zijn overgebracht naar de micro centrifugeerbuis. Na het afcentrifugeren van de kralen in een microcentrifuge, was ze drie keer met één milliliter lys vier 50 en één keer met één milliliter EB 100.Buffer. Voeg vervolgens 200 microliter EB 100 buffer met flag peptide toe om de gebonden eiwitten te elueren en incubeer het monster gedurende vier graden Celsius op een nutt.
Na een half uur pellet de kralen in de microcentrifuge die u hebt gewonnen en breng vervolgens het SUP nataat dat het elueerde in OAC C complex bevat over naar een nieuwe micro centrifugeerbuis. Nadat u de elucatie vier keer herhaalt, laat u het getrokken eluaat door een lege spinkolom lopen om eventuele resterende flag aeros kralen uit de eiwitfractie te verwijderen. Gebruik ten slotte een centrifugaal ultrafiltratieapparaat met een moleculair gewicht van 50.000 om de geelueerde eiwitfractie ongeveer 10 keer te concentreren.
Zoals geïllustreerd in deze figuur, kan de zuiverheid van de NO 80 complexen die zijn bereid met behulp van de aangegeven flag-tag subeenheden, zoals zojuist aangetoond, worden beoordeeld
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het genereren en zuiveren van zowel wild-type als gemuteerde versies van het menselijke INO80-chromatineremodelleringscomplex. Het proces omvat de expressie van epitope-getagde INO80-subeenheden in HEK293-cellen en het zuiveren van de complexen via immunoaffiniteitschromatografie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Chromatinremodellering
- Celbiologie
- Moleculaire biologische technieken
Achtergrond
- INO80 is een multi-subunit chromatineremodelleringscomplex.
- Het begrijpen van de subunit-samenstelling is cruciaal voor het verduidelijken van de functie ervan.
- Chromatineremodelleringscomplexen spelen een belangrijke rol bij genregulatie.
- Dit protocol kan ook worden aangepast voor andere multi-subunitcomplexen.
Doel van de studie
- Om wild-type en mutante INO80-complexen te genereren en te zuiveren.
- Om de subunit-samenstellingen van deze complexen te analyseren.
- Om de bijdrage van subunits aan de algemene activiteit van het complex te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Isolatie van kernen uit HEK293-cellen die getagde INO80-eiwitten tot expressie brengen.
- Bereiding van kernextracten.
- Zuivering van INO80-complexen met behulp van Anti-Flag affiniteitschromatografie.
- Analyse van de subeenheidssamenstelling via western blot of zilverkleuring.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van zowel wild-type als mutante INO80-complexen.
- Zuivering van de complexen toonde een effectieve isolatie van subeenheden aan.
- Analyse verschaftte inzichten in de rol van specifieke subeenheden.
- Deze methode is toepasbaar op andere nucleaire multi-subeenheidcomplexen.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van INO80-complexen.
- De verkregen inzichten kunnen het begrip van chromatineremodelleringsmechanismen verbeteren.
- De aanpasbaarheid van de methode maakt bredere toepassingen mogelijk in studies naar nucleaire complexen.
Veelgestelde Vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Zuivering van humane INO80 chromatine-remodelleringscomplexen en subcomplexen maakt een nauwkeurige dissectie van de assemblage en functie van multi-subunits mogelijk, wat direct bijdraagt aan targetvalidatie en mechanische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Deze capaciteit is cruciaal voor het begrijpen van hoe individuele subunits bijdragen aan de chromatine-remodelleringsactiviteit, wat de voorspellende betrouwbaarheid van epigenetische targetportfolio's vergroot. De aanpak biedt een herbruikbaar platform voor het onderzoeken van mammaliaanse chromatine-remodelleringscomplexen die relevant zijn voor genregulatie en ziektebiologie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt systematische verwijdering of mutatie van subunits mogelijk om hun functionele rollen bij chromatineremodellering te verduidelijken.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de impact van specifieke proteïnecomponenten op de activiteit van het complex te isoleren.
- Faciliteert hypothese-gestuurd onderzoek naar epigenetische regulatieroutes.
- Biedt een basis voor targetvalidatie in programma's voor chromatine-modificerende enzymen.
Screening & Assayontwikkeling
- Genereert gevalideerde multi-subunitcomplexen voor downstream biochemische en functionele assays.
- Waarborgt reproduceerbaarheid en standaardisatie van de complexsamenstelling voor kwantitatieve screening.
- Maakt de preparatie van wild-type en mutante complexen mogelijk voor vergelijkende activiteitsassays.
- Ondersteunt de ontwikkeling van assays voor compound screening tegen doelen voor chromatineremodellering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Maakt de studie van ziekterelevante mutaties of subunit-deleties in menselijke chromatine-remodelleringscomplexen mogelijk.
- Biedt continuïteit van moleculaire mechanismen naar onderzoek in preklinische modelsystemen.
- Maakt het mogelijk om biochemische bevindingen af te stemmen op translationele biomarkerstrategieën wanneer deze worden ondersteund door downstream-assays.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van epigenetische targets naar preklinische validatie.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Deze methode bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie, wat mechanistische studies mogelijk maakt die zowel de target-validatie als de assay-ontwikkeling voor chromatine-remodelleringscomplexen ondersteunen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door de isolatie en analyse van specifieke bijdragen van subeenheden aan complexe functies mogelijk te maken.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare complexen voor kwantitatieve biochemische assays en screening-workflows.
- Analytics: Biedt kwantitatieve read-outs via immunoblotting, zilverkleuring en massaspectrometrie om wild-type en mutante complexen te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Faciliteert de studie van ziekterelateerde wijzigingen in subeenheden binnen een gecontroleerde biochemische context.
- Enterprise Hergebruik: Aanpasbaar protocol voor de zuivering van andere mammale multi-subeenheid chromatine-remodellerende en modificerende complexen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische dissectie van chromatine-remodelleringscomplexen mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Standaardiseert zuiverings- en analyseworkflows voor multi-subunitcomplexen, waardoor de reproduceerbaarheid wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Ondersteunt geïnformeerde go/no-go-beslissingen door de subunit-specifieke bijdragen aan de complexactiviteit te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van epigenetische targets mogelijk op basis van mechanistische inzichten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in zuigerscelcultuur van zoogdieren, nucleaire extractie en immunoaffiniteitszuivering.
- Toegang tot HEK293-cellijnen, epitope-getagde constructen en analytische instrumentatie voor eiwitanalyse is noodzakelijk.
- Strenge standaardisatie van extractie- en zuiveringsstappen tussen teams is vereist om reproduceerbaarheid te garanderen.
- Aanpasbaar voor andere multi-subunitcomplexen met geschikte tagging- en expressiesystemen.
- Kritieke afhankelijkheid van zorgvuldige zoutextractie en handling om de integriteit van het complex te behouden, zoals benadrukt in het protocol.
