Name: Generatie en zuivering van Human INO80 chromatine remodeling Complexen en subes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Leer het genereren en zuiveren van wild-type en mutant INO80 chromatine-remodelleringscomplexen uit HEK293-cellen met Anti-Flag-affiniteitschromatografie. Deze methode analyseert subunit-samenstelling via western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in het laboratorium van de auteurs &#39;wordt ondersteund door een subsidie ​​van de National Institute of General Medical Sciences (GM41628) en door een subsidie ​​aan de Stowers Instituut voor Medisch Onderzoek van het Helen Nelson Fonds Medisch Onderzoek aan de Greater Kansas City Community Foundation.

1 Generatie en Cultuur van HEK293 Stabiel cellijnen die Full Length of Mutant Versies van FLAG epitoopgemerkte INO80 of andere INO80 Complex Subeenheden <ol><li> Clone cDNA dat de volledige lengte of mutant humaan INO80 ATPase of een andere INO80 subeenheid in de zoogdierlijke expressievector pcDNA5 / FRT met een in-frame, N terminale FLAG epitoop tag. </li><li> Bevestig de sequentie van het ingevoegde cDNA met DNA sequencing voordat. </li><li> Om de transfectie uit te voeren, groeien Flp-In HEK293 cellen in 10 cm weefselkweekschalen in een medium met DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium), 5% glutamine en 10% FBS (foetaal runderserum). </li><li> Wanneer cellen bereiken ~ 70% confluentie aan elke weefselcultuurschaal een mengsel van 40 pl FuGENE6 transfectie reagens, 0,5 ug van de geschikte pcDNA5 / FRT expressieplasmide, en 9,5 ug pOG44, waarvan Flp recombinase codeert, in een totaal volume 800 pl. </li><li> 48 uur later, trypsinize en split cellen bij een verhouding van 1:30 in 10 cm schalen en ze groeien in DMEM met 5% glutamine, 10% FBS, en 100 ug / ml hygromycine B voor 3 - 4 weken. Verander het kweekmedium wanneer het begint te geel (meestal om de 3-5 dagen). </li><li> Om positieve klonen die het hoogste-FLAG gelabeld eiwit expressie te identificeren, selecteert individuele hygromycine B-resistente kolonies en overbrengen naar een enkel putje van een 24-well plaat. <ol><li> Wanneer de cellen 80% confluentie bereikt, oogst cellen uit elk putje in ~ 1 ml PBS en pellet door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Na verwijdering van het supernatant, resuspendeer de celpellet in 60 pl SDS-PAGE monsterbuffer. </li><li> Betreft helft van de geresuspendeerde cel pellet aan SDS PAGE en Western blotting om expressie van de FLAG controle hebben lokaas eiwitten; sparen de andere helft voor toekomstige analyses. </li></ol></li><li> Als no-FLAG tag menselijk INO80 eiwitten worden aangetroffen in cellysaten, vouwt u de eerste klonen cel populatiesning verder door uitplating cellen uit enkele putjes van een 24-wells plaat in 15 cm weefselkweekschalen. <ol><li> Om cellen te oogsten vanaf 15 cm schalen, resuspendeer buurt samenvloeiende cellen in ijskoude PBS en overbrengen in een 50 ml conische buis. </li><li> Breng een eindvolume van 50 ml door toevoeging van extra PBS. </li><li> Pellet cellen bij 1000 g gedurende 5 minuten en verwijder zoveel mogelijk van het supernatant. </li><li> Resuspendeer de cel pellet in 1 ml van Lys450 buffer (20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 450 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 10 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM DTT, 200 uM PMSF, en 1: 1.000 proteaseremmercocktail). OPMERKING: hier en elders, altijd DTT, PMSF, en proteaseremmercocktail toevoegen aan buffers onmiddellijk voor het begin van een experiment. </li><li> Immuno-precipitaat FLAG-gemerkte eiwitten van het resulterende totaal cellysaat met 20 pl anti-FLAG agarose gel, en het FLAG eluaten met Western blotting geanalyseerd. [Voor meer details van immunityoprecipitation procedure, zie stap 5] </li></ol></li><li> Bereid bevroren voorraden gewenste klonale cellijnen 12 en bewaar ze in vloeibare stikstof tot gebruik. </li></ol> 2 Groeiende HEK293- cellijnen in Roller Flessen Bij bereiding op grote schaal van INO80 complexen, cellen in kweek 10 - 20 rolflessen; Een typische opbrengst uit elke rolfles is ~ 1 ml gepakte cellen. <ol><li> Aan elke rolfles, voeg 200 ml DMEM, 5% glutamine en 10% kalfserum, zonder hygromycine B. </li><li> Breng alle cellen van een bijna samenvloeiende 15 cm schaal in elke rolfles </li><li> Plaats rolflessen in een 37 ° C incubator rolfles en roteren bij 0,2 rpm. </li><li> Zodra cellen te bereiken ~ 70% samenvloeiing, giet af en het medium te verwijderen. </li><li> Voeg ~ 50 ml ijskoude PBS aan elke fles. Houdt flessen horizontaal, draai voorzichtig aan de cel monolaag los. </li><li> Breng de cellen geresuspendeerd tot 250 ml plastic conische flessen en plaats op ijs. </li><li> Spoel rolkolven met extra PBS, de overdracht van het sequentieel van fles tot fles. Als spoeling oplossing is niet meer duidelijk is (meestal na gebruik af te spoelen ongeveer 5 flessen), voeg het toe aan de celsuspensie. </li><li> Pellet cellen door centrifugatie bij 400 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Voorzichtig resuspendeer de cellen in PBS, te combineren tot een enkele 250 ml conische fles, en bewaar op ijs tot verdere verwerking. </li></ol> 3-siRNA gemedieerde Knockdown van INO80 Subeenheden in cellen die ander-FLAG tag INO80 Subunit Om INO80 subes ontbreekt een enkele subunit verkrijgen, gebruiken FLAG-immuunzuivering naar INO80 complexen van siRNA behandelde cellen of cellen stabiel tot expressie shRNA zuiveren. De &quot;reverse&quot; siRNA (kleine interfererende RNA) transfectieprotocol hier beschreven is geoptimaliseerd voor HEK293 cellen groeien in 15 cm schalen. Het protocol is voor een enkele 15 cm schotel van cellen en shoULD worden opgeschaald derhalve afhankelijk van het aantal cellen nodig. Om biochemisch nuttige hoeveelheden INO80 complexe uit-siRNA behandelde cellen te bereiden, dient men op te schalen naar culturen gegroeid in 40 15 cm schalen; 4 ml gepakte celpellet - dit neemt ongeveer 2 opleveren. <ol><li> Groeien HEK293 cellen die stabiel tot expressie het gewenste subeenheid van de INO80 complex bijna confluentie in 15 cm schalen. </li><li> Voeg een hoeveelheid van siRNA resuspensie buffer (20 mM KCl, 6 mM HEPES pH 7,5 en 0,2 mM MgCl2) volstaan ​​om een 50 uM stockoplossing van siRNA een buis met gelyofiliseerd siRNA bereiden. Pipet de oplossing op en neer een paar keer en broeden op een nutator gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om ervoor te zorgen de siRNA volledig is opgelost. </li><li> Bereid een transfectie cocktail met siRNA&#39;s en transfectiereagens. Meng 10 ul van de 50 uM siRNA stockoplossing met 32 ​​pi Lipofectamine RNAiMAX toevoegen aan 4 ml Opti-MEM Verminderde Serum Medium met zeer voorzichtig mengen; allaag alle reagentia in evenwicht te RT voor gebruik. </li><li> Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Bereid Flp-in HEK293 cellen die stabiel tot expressie het gewenste INO80 subeenheid voor transfectie. <ol><li> Tijdens de incubatie van stap 3.4, wassen cellen in de 15 cm schalen eenmaal met PBS RT. </li><li> Na het verwijderen PBS behandelen cellen met 1 ml trypsine enkel tot ze beginnen te tillen van de plaat. </li><li> Voeg onmiddellijk 10 ml compleet medium (DMEM + 5% glutamine + 10% FBS) cellen getrypsiniseerd en meng voorzichtig. Verzamel cellen door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de celpellet in ~ 4 ml compleet medium en tel de cel resuspensie behulp van een hemocytometer. </li><li> Verdun cellen met compleet medium tot een concentratie van ~ 5,4 x 10 6 / ml. </li></ol></li><li> Aan elk 15 cm schotel, voeg 15 ml compleet kweekmedium, gevolgd door 4 ml transfectie cocktail. Roer voorzichtig tot het medium en transfectie cocktail waarborgen thoroughly gemengd. Tenslotte, voeg een ml celsuspensie en weer schud zachtjes om cellen gelijkmatig te dispergeren. </li><li> Na 60 uur van de cultuur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator, verwijder voorzichtig medium, resuspendeer cellen in ijskoude PBS, en meteen overgaan tot de nucleaire extracten te bereiden. </li></ol> 4 Voorbereiding van kernextracten Deze procedure is een modificatie van het protocol van Dignam 13 en kunnen worden vergroot of verkleind afhankelijk van de grootte van het starten celpellets. Typisch, 1 ml gepakte celpellet opbrengst 1 ml uiteindelijke nucleair extract. Alle buffers moeten ijskoud en alle stappen worden uitgevoerd in een koude kamer of op ijs indien een geschikte koude kamer is niet beschikbaar. <ol><li> Isolatie van kernen: <ol><li> Zacht overdracht cellen om een ​​geschikte grootte (15 of 50 ml) studeerde conische buis en centrifugeren bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de supernatant en het volume van het gepakte cel pel metenlaten. 1 ml gepakte cellen overeenkomt met ~ 3 x 10 8 HEK293 cellen. </li><li> Voeg 5 verpakt celvolumes buffer A (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl en vers toegevoegde 1 mM DTT, 200 uM PMSF, en 1: 1.000 proteaseremmercocktail). Resuspendeer de cel pellet door voorzichtig pipetteren. </li><li> Incubeer op ijs gedurende precies 10 minuten. </li><li> Pellet de cellen bij 1000 g gedurende 10 min bij 4 ° C en verwijder het supernatant. </li><li> De afmeting van de cel pellet moet tijdens incubatie in buffer A. verhoogd tot 2-voudig </li><li> Resuspendeer de cellen in twee hematocriet volumina van buffer A, en breng de celsuspensie tot een geschikte afmeting Dounce weefselhomogenisator. Als u met minder dan 2 ml packed cells, gebruik dan een 7 ml homogenisator; voor 2 - 4 ml packed cells, gebruik maken van een 15 ml homogenisator; en voor 10 of meer ml packed cells, gebruik maken van een 40 ml homogenisator. </li><li> Homogeniseren van de celsuspensie met de losse glazen stamper van de Dounce homogenisator until 90% van de cellen positief te kleuren met 1% trypan blauw. </li><li> De suspensie in een 45 ml high-speed centrifuge buis en draaien bij 25.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C in een JA-17 rotor of dergelijke (zie tabel of Materials / Apparatuur). </li><li> Van de nucleaire pellet, de bovenstaande vloeistof, die cytosolische eiwitten of eiwitten die tijdens de fractionering lekken van de kern bevat. </li></ol></li><li> Extraheren kernen met zout: <ol><li> Voeg Buffer C (20 mM HEPES, pH 7,9, 25% glycerol, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, en vers toegevoegde 1 mM DTT, 200 uM PMSF, en 1: 1000 Protease Inhibitor Cocktail) aan de nucleaire pellet; Gebruik 2,5 ml buffer C per 3 ml conferentie hematocriet (~ 1 x 10 9 cellen). </li><li> Met behulp van een glasstaaf of een pipet, los nucleaire pellet van de wand van de buis en breng het gehele mengsel een Dounce homogenisator van geschikte grootte. </li><li> Resuspendeer de kernen door homogeniseren the mengsel met twee slagen van een losse stamper. </li><li> Breng de geresuspendeerd nucleaire fractie in een gekoeld beker. Kies een bekerglas zodat de suspensie de beker vult ten minste 0,5 cm diep. </li><li> Nucleaire eiwitten van chromatine of andere onoplosbare structuren extraheren, geleidelijk verhogen van de zoutconcentratie van de suspensie tot 0,42 M NaCl door druppelsgewijze toevoeging van 5 M NaCl onder zacht roeren van de suspensie met een pipet of glazen staafje op ijs; Zodra alle 5 M NaCl werd toegevoegd, dient de oplossing zeer viskeus of gelachtig worden. Bereken het volume van 5 M NaCl nodig oplossing tot een eindconcentratie van 0,42 M NaCl met de volgende formule te brengen: <img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51720/51720equation1.jpg" width="500" /></li><li> Breng zorgvuldig de viskeuze suspensie over in 10 ml polycarbonaat buizen voor een Type 70.1 Ti rotor (of gelijkwaardig) of 70 ml polycarbonaat flessen voor een Type 45 Ti or soortgelijke rotor (zie tabel van materialen / apparatuur). Goed af met parafilm bij gebruik van 10 ml buizen of met dop montage bij gebruik van 70 ml flesjes. </li><li> Langzaam rock de afgesloten buizen bij 4 ° C gedurende 30 min met een nutator. </li><li> Spin de monsters in een type 45 Ti of 70.1 Ti rotor gedurende 30 min bij 120.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Breng de bovenstaande om een ​​plastic buis of fles. Dit bovenstaande is de nucleaire extract, en de pellet bevat chromatine en andere nucleaire afval. </li><li> Verdeel de kernextract in handig formaat porties, invriezen in vloeibare stikstof, en op te slaan bij -80 ° C. </li></ol></li></ol> 5 immunoaffiniteitszuivering van de Human INO80 of INO80 subes <ol><li> Op bevroren kernextract ontdooien, plaats buisjes met het extract van de stationaire of rol buizen tussen de handen totdat het bevroren materiaal wordt een slurry. Plaats dan de buizen op ijs of in de koude kamer tot het extract is volledig thawed. </li><li> Breng de ontdooide nucleair extract tot 10 ml polycarbonaat ultracentrifuge buizen en rotatie bij 100.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C in een Type 70.1 Ti rotor of gelijk aan een neerslag dat tijdens de vorst-dooi cyclus kunnen gevormd hebben. </li><li> Breng de supernatant een 15 ml conische buis. Voeg verse DTT, PMSF, en proteaseremmercocktail tot de uiteindelijke concentratie van 1 mM DTT, 200 uM PMSF, en 1: 1.000 proteaseremmercocktail. </li><li> Om anti-FLAG agarose bereiden voor immunozuivering overdragen 200 ul van 50% suspensie van anti-FLAG agarose kralen om een ​​1,5 ml microcentrifugebuis met een P200 of dergelijke met een pipet tip waarvan de punt afgesneden met een schone scalpel of scheermesje. </li><li> Pellet de korrels door centrifugeren in een microcentrifuge benchtop bij 8000 xg gedurende 30 sec. Verwijder de supernatant en was de kralen door resuspenderen van de korrels in 1 ml buffer Lys450 en pellet de korrels bij 8000 xg gedurende 30 sec. Was de beads nog twee keer. </li><li> Resuspendeer de gewassen anti-FLAG agarose in 100 pl van nucleair extract met een P200 of dergelijke regelbaar volume pipet met een punt waarvan de punt afgesneden met een schone scalpel of scheermesje en met dezelfde tip, overdracht de geresuspendeerde kralen om de 15 ml conische buis met het extract. Herhaal dit een paar keer totdat alle kralen zijn overgedragen aan de buis van 15 ml. </li><li> Incubeer het extract / kraal mengsel gedurende 4 uur bij 4 ° C onder langzame rotatie op laboratoriumschaal rotator. OPTIONEEL: Inclusief Benzonase bij een concentratie van 25 eenheden / ml te verwijderen verontreinigend DNA. </li><li> Verzamel de FLAG agarose door centrifugatie bij 1000 g gedurende 5 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer in 10 ml Lys450 te wassen, incubeer 5 min bij 4 ° C onder zacht schommelen op een nutator. Pellet de kralen aan 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer in 100 - 150 ul Lys450 en overdracht kralen aan een 1,5 ml microcentrifugebuis. Continue aan de 15 ml conische buis met spoelen 100 - 150 gl Lys450 totdat alle korrels zijn overgedragen aan de microcentrifugebuis. </li><li> Spin down de kralen bij 8000 xg gedurende 30 seconden bij 4 ° C in een microcentrifuge. Was drie keer met 1 ml Lys450 en eenmaal met 1 ml EB100 buffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10% glycerol, 100 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,05% Triton X-100, en vers toegevoegde 1 mM DTT, 200 uM PMSF , en 1: 1.000 proteaseremmercocktail). </li><li> Om gebonden eiwitten elueren, voeg 200 ul EB100 buffer die 0,25 mg / ml 1x FLAG-peptide. Incubeer 30 min bij elke 4 ° C op een nutator. </li><li> Pellet de beads bij 8000 xg gedurende 30 seconden bij 4 ° C in een microcentrifuge. Breng de bovenstaande, die de geëlueerd INO80 complex bevat, om een ​​frisse microcentrifugebuisje. </li><li> Herhaal de elutie nog vier keer, en bundelen alle bovenstaande vloeistoffen in een enkele buis. </li><li> Om het resterende FLAG-agaroseparels van de geëlueerde eiwit fractie te verwijderen,langs het eluaat door een leeg spinkolom. </li><li> Concentreer de geëlueerde eiwitfractie ~ 10-voudig met een dun centrifugale filterinrichting (50.000 molecuulgewicht cutoff). </li><li> Om de FLAG-peptide te verwijderen, passeren de geconcentreerde eiwit fractie achtereenvolgens door twee ontzouten kolommen. </li><li> Verdeel het gezuiverde ontzoute eiwitfractie in 20 ul aliquots ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C. </li><li> Analyseer de subunit samenstelling van INO80 of INO80 subes op-zilver gekleurde gels of door western blotting, en schatten de concentraties door semi-kwantitatieve western blotting het gebruik van preparaten van recombinant INO80 subeenheden van bekende concentratie als standaarden. </li></ol>

<ol><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes%2C+Annual+Review+of+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry.</a> 78, 273-304 (2009).</li>
<li>Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HSA+domain+binds+nuclear+actin-related+proteins+to+regulate+chromatin-remodeling+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases.</a> Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).</li>
<li>Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+remodelling+complex+involved+in+transcription+and+DNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing.</a> Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).</li>
<li>Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+actin-related+proteins+in+ATP-dependent+chromatin+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling.</a> Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex%3A+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li>
<li>Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination%3A+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination: developments and applications.</a> 5 (5), 521-527 (1994).</li>
<li>Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase-mediated+gene+activation+and+site-specific+integration+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells.</a> Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).</li>
<li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).</li>
<li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YY1+functions+with+INO80+to+activate+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">YY1 functions with INO80 to activate transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).</li>
<li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Modes+of+Regulation+of+the+Uch37+Deubiquitinating+Enzyme+in+the+Proteasome+and+in+the+Ino80+Chromatin-Remodeling+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex.</a> Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).</li>
<li>Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+FLAG+epitope-tagged+bacterial+alkaline+phosphatase+using+a+novel+monoclonal+antibody+and+peptide+elution%2C+Biotechniques%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques.</a> 16 (4), 730-735 (1994).</li>
<li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarker%2C+K+%22At+the+Bench%3A+A+Laboratory+Navigator%22">At the Bench: A Laboratory Navigator</a>. 10, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 207-245 (2005).</li>
<li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei.</a> Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Structurele en functionele studies van multi-subunit van zoogdieren chromatine remodeling complexen van hogere eukaryoten werden gehinderd door de moeilijkheid van de voorbereiding van biochemisch nuttige hoeveelheden van dergelijke complexen met mutant subeenheden of ontbreken bepaalde subeenheden helemaal. Er zijn een aantal technische hindernissen Enerzijds, is genetische manipulatie in zoogdiercellen technisch ingewikkeld en tijdrovend geweest. Unlike gistcellen, waarvan het genoom kan gemakkelijk worden bewerkt en ...

Evolutionair geconserveerd SNF2 familie chromatine remodeling complexen zijn belangrijke regulatoren van chromatine organisatie en toegankelijkheid van DNA 1. Deze remodeling complexen altijd een centrale SNF2-achtige ATPase subeenheid, die in sommige gevallen, assembleert diverse toe eiwitten en vormt meerdere subeenheden macro-moleculaire assemblages. De moleculaire details van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling te bestuderen, is het belangrijk om de bijdrage van bepaalde subsets van subeenheden en / of domein structuren begrijpen activiteiten van de complexen. Dergelijke analyses vereisen de mogelijkheid om zeer gezuiverde mutant complexen die bepaald eiwit subeenheden of domein structuren missen genereren. Vorige structuur-functie studies van ATP-afhankelijke chromatine hermodellering complexen sterk gericht op de gist modelsysteem vanwege de superieure maakbaarheid van de gist genoom (zie bijvoorbeeld refs 1-4). Gezien het behoud van desubunit samenstelling en functionaliteit tussen orthologe remodeling complexen, hebben studies van de structuur en functie van gist remodeling complexen belangrijke inzichten in hun tegenhangers in hogere eukaryoten. Toch merkbare soortspecifieke verschillen tussen remodeling complexen bestaan, als gevolg van winst of verlies van soortspecifieke subeenheden, winst of verlies van de soort-specifieke domeinen van geconserveerde subeenheden en sequentievariabiliteit binnen geconserveerde domeinen van geconserveerde subeenheden. Dergelijke verschillen kunnen in principe gedreven door de behoefte aan hogere eukaryote cellen aan te passen aan nieuwe moleculaire en cellulaire omgevingen. Zo begrijpen hoe subeenheden van hogere eukaryote remodeling complexen bijdragen aan het nucleosoom remodeling proces is waardevol, want het werpt niet alleen licht op de basismechanismen van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling proces, maar ook kan waardevolle inzichten verschaffen in de mechanismen die chromatine structuur en genexpressie in highaar eukaryoten worden gereguleerd. Tot nu toe zijn er slechts beperkte structurele en functionele studies van multi-subunit van zoogdieren chromatine remodeling complexen, mede als gevolg van de moeilijkheden bij het verkrijgen van biochemisch gedefinieerd chromatine remodeling complexen en subes. We hebben gedeeltelijk omzeild deze moeilijkheden met de hieronder beschreven procedures, waarbij immunoaffiniteitszuivering wordt gebruikt om intact INO80 of INO80 subcomplexen van humane cellen die stabiel tot expressie N-eindstandig FLAG epitoop-gemerkte wild type of mutante versies van INO80 5-7 bereiden (figuur 1) . Om intact INO80 complexen van menselijke cellen te verkrijgen, is Flp-bemiddelde recombinatie wordt gebruikt om transgene HEK293 cellijnen die stabiel FLAG epitoop-gemerkte cDNA&#39;s die coderen voor subeenheden van het INO80 complex 8-10 genereren. Omdat overexpressie van INO80 subeenheden enigszins giftig zijn, is het noodzakelijk te isoleren en klonale cellijnen onder selectieve co handhavennditions stabiele transgene expressie waarborgen tijdens de vele passages nodig zijn voor uitbreiding van grootschalige celkweken. Voor kleinere INO80 subcomplexen dat slechts een subset van subeenheden bevatten verkrijgen, hebben we succes twee methoden (figuur 2A, B). In de eerste genereren we HEK293 Flp-In cellijnen die stabiel mutant versies van INO80 die domeinen voor de interactie met specifieke subeenheden 5 ontbreken. Alternatief wordt siRNA-gemedieerde knockdown gebruikt om de gewenste subeenheid van cellen die een geschikt FLAG gelabeld INO80 subeenheid (ongepubliceerde gegevens) afbreken. Tot slot, om het menselijk INO80 complexen te zuiveren, is FLAG agarose gebaseerd chromatografie 11 gebruikt om een-INO80 bevattende fractie een verrijking van nucleaire extracten, waardoor de effectieve vermindering van de aanwezigheid van verontreinigende cytosole eiwitten in de laatste fractie die gezuiverd INO80 of INO80 subes.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I (stablized glutamine)</td><td>Life Technologies</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>SAFC</td><td>12176C</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE6 transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B, steriel in PBS</td><td>AG Scientific</td><td>H-1012-PBS</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA5/FRT vector</td><td>Life Technologies</td><td>V6010-20</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In HEK293 cells</td><td>Life Technologies</td><td>R780-07</td><td></td></tr><tr><td>pOG44 Flp-Recombinase Expressie Vector</td><td>Life Technologies</td><td>V600520</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>kalfserum</td><td>SAFC</td><td>12138C</td><td></td></tr><tr><td>TARGETplus SMARTsiRNA pool</td><td>Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>5x siRNA resuspensiebuffer</td><td>Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>#B-002000-UB-100</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Life Technologies</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>51985-091</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>45000</td><td>VWR</td></tr><tr><td>TrypLE (trypsine)</td><td>Life Technologies</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>1x FLAG Peptide</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Chromatografiekolom</td><td>Bio-Rad</td><td>737-5021</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td><td>Amicon</td><td>UFC805024</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Zeba Desalting Columns</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 antilichaam, muis</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 antilichaam, konijn</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>benzonase</td><td>Novagen</td><td>70664</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>JS-4.2 rotor in een J6 centrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>339080</td><td></td></tr><tr><td>JA-17 rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>10 ml polycarbonaat buizen</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>70 ml polycarbonaat flessen</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355655</td><td></td></tr><tr><td>Type 45 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Type 70.1 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>BD Clay Adams Nutator Mixer</td><td>BD Diagnostics</td><td>15172-203</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Glas-Col Tube/Vial Rotator</td><td>Glas-Col</td><td>099A RD4512</td><td></td></tr><tr><td>PCR thermische cycler PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>roller bottle incubator</td><td>Bellco biotechnology</td><td>353348</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Transfer Membraan 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>gesmeerde 1,5 ml microcentrifugebuizen</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie en zuivering van human ino80 chromatine remodeling complexen en subes

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatine remodeling complexen reguleren nucleosomen en DNA bereikbaarheid door het katalyseren van ATP-afhankelijke nucleosoom remodeling. Menselijke INO80 complexen uit 14 eiwitsubeenheden waaronder INO80 een SNF2-achtige ATPase, dat dient als de katalytische subeenheid en de matrix voor montage van de complexen. Functies van de andere subeenheden en de mechanismen waarmee zij een bijdrage leveren aan chromatine remodeling activiteit de INO80 complex blijft slecht begrepen, voor een deel te wijten aan de uitdaging van het genereren van INO80 bouwgroepen in menselijke cellen of heterologe expressie systemen. Deze JOVE protocol beschrijft een procedure die zuivering van menselijke INO80 chromatine hermodellering subcomplexen die ontbreken een subeenheid of een subset van subeenheden mogelijk maakt. N-eindstandig FLAG epitoop-gemerkte cDNA INO80 worden stabiel ingebracht in humane embryonale nier (HEK) 293-cellijnen met Flp-bemiddelde recombinatie. Indien een subset van subeenheden van de INO80 complex is be verwijderd, een expressie plaats INO80 mutante eiwitten die het platform te monteren onderdelen van deze subeenheden missen. In het geval een individu subunit is uitgeput te raken, een transfects siRNA gericht op deze subeenheid in een HEK 293 cellijn stabiel tot expressie FLAG tag INO80 ATPase. Kernextracten worden bereid, en FLAG immunoprecipitaties wordt uitgevoerd om proteïne fracties die INO80 derivaten verrijken. De samenstellingen van gezuiverde INO80 subcomplexen kan vervolgens worden geanalyseerd met methoden zoals immunoblotting, zilverkleuring en massaspectrometrie. De INO80 en INO80 subes gegenereerd volgens dit protocol kan verder worden geanalyseerd middels diverse biochemische assays die worden beschreven in de bijgevoegde JOVE protocol. De hier beschreven werkwijzen kunnen worden aangepast voor onderzoek van de structurele en functionele eigenschappen van elke zoogdierlijke meerdere subeenheden chromatine remodeling en modificerende complexen.

Figuur 1 toont een stroomdiagram overzicht van de procedures die voor productie, zuiveren en karakteriseren menselijke INO80 ATP-afhankelijke chromatine hermodellering complexen. Zoals weergegeven in figuren 2 en 3, deze procedures kan de generatie van zowel wildtype INO80 en INO80 subes dat verschillende eiwitten missen, waardoor het mogelijk verdere biochemische analyse van de bijdrage van deze ontbrekende subeenheden enzymatische activite...

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het genereren en het zuiveren van wild type en mutante versies van de menselijke INO80 chromatin remodelling complex. Epitoop-gemerkte versies van INO80 subeenheden zijn stabiel tot expressie gebracht in HEK293-cellen en volledige complexen en complexen ontbreekt specifieke sets van subeenheden gezuiverd door immuno-affiniteitschromatografie.

Generatie en zuivering van Human INO80 chromatine remodeling Complexen en subes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Het doel van deze procedure is het genereren en zuiveren van wild-type en mutante versies van de multi-subeenheid in het NO80-chromatineremodelleringscomplex. Dit wordt bereikt door eerst de kernen te isoleren uit cellen die Flag-epitope-getagde NO80-eiwitten tot expressie brengen. In de tweede stap worden kernextracten voorbereid, waarna de wild-type of mutante humane NO80-chromatineremodelleringscomplexen worden gezuiverd via Anti-Flag affiniteitschromatografie. Uiteindelijk kan de subeenheidssamenstelling van de gezuiverde NO80-complexen worden geanalyseerd via western blot of zilverkleuring.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over hoe de subeenheden van MultiPro-chromatineremodelleringscomplexen bijdragen aan hun algehele activiteit. Deze methode is specifiek ontworpen voor het bestuderen van wild-type en gemuteerde versies van het NO 80-chromatineremodelleringscomplex, maar kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van andere nucleaire complexen met meerdere subeenheden, zoals het mediatorcomplex.De meest kritische stap van de procedure is de kernextractie. Problemen ontstaan meestal doordat het zout tijdens de zoutextractiestap te snel of te krachtig

generation-purification-human-ino80-chromatin-remodeling-complexes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft hoe chromatine immunoprecipitatie (ChIP) wordt gebruikt om de dynamische wijzigingen studie naar de chromatine sjabloon die transcriptie veroorzaakt door een signaal transductie route te reguleren.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) om Assay Dynamic histon-eiwitten in Actieve genexpressie in menselijke cellen

We beschrijven een robuuste methode voor het chromatine immunoprecipitatie met primaire T-cellen. De methode is gebaseerd op standaard methoden, maar gebruikt een specifieke set van omstandigheden en reagentia die de efficiëntie van een beperkte hoeveelheid cellen verbeteren. Belangrijk is een gedetailleerde beschrijving van de data analysefase gepresenteerd.

Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

De combinatie van chromatine immunoprecipitatie en ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) kan identificeren en in kaart eiwit-DNA-interacties in een bepaald weefsel of cellijn. Geschetst is hoe je een hoge kwaliteit ChIP sjabloon voor de daaropvolgende sequencing, met ervaring met de transcriptiefactor TCF7L2 als een voorbeeld te genereren.

Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Hier beschrijven we biochemische analyses die kunnen worden gebruikt om ATP-afhankelijke chromatine-hermodelleringsenzymen te karakteriseren op hun vermogen om 1) ATP-afhankelijk nucleosoomglijden te katalyseren, 2) te interageren met nucleosoomsubstraten en 3) ATP te hydrolyseren op een nucleosoom- of DNA-afhankelijke manier.

Biochemische assays voor het analyseren van activiteiten van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling Enzymen

De identificatie van moleculen die geassocieerd zijn met specifieke genomische regio's van belang is vereist om de mechanismen van regulatie van de functies van deze regio's te begrijpen. Dit protocol beschrijft procedures om geëngineerde DNA-bindende molecuul-gemedieerde chromatine immunoprecipitatie (enChIP) uit te voeren voor de identificatie van eiwitten en RNA's die geassocieerd zijn met een specifiek genoomgebied.

Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP

Hier presenteren we een protocol om een resolutie van bijna base-paar te bereiken van eiwit-DNA-interacties. Dit wordt verkregen door exonuclease-behandeling van DNA-fragmenten die selectief zijn verrijkt door chromatine-immunoprecipitatie (ChIP-exo) gevolgd door high-throughput sequencing.

De chip-exo Methode: Het identificeren van eiwit-DNA interacties met Near basenparen Precision

Sequentiële zout winning van chromatine gebonden eiwitten is een nuttig instrument voor het bepalen van de bindende eigenschappen van grote eiwitcomplexen. Deze methode kan worden gebruikt om te evalueren van de rol van individuele subeenheden of domeinen in de algehele affiniteit van een eiwit complex om te bulk chromatine.

Sequentiële zout extracties uit te voeren voor de analyse van Bulk chromatine bindende eigenschappen van chromatine complexen wijzigen

Hier beschrijven we een protocol voor efficiënte chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door high-throughput DNA sequentiebepaling (ChIP-seq) van bruin vetweefsel (BAT) geïsoleerd van een muis. Dit protocol is geschikt voor zowel mapping histone modificaties en genoom-brede lokalisatie van niet-Histon proteïnen van belang in vivoonderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitation van lymfkliertest bruin vetweefsel

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Dit protocol presenteert een locus-specifieke chromatine-isolatiemethode op basis van plaatsspecifieke recombinatie om een single-copy genlocus van belang in zijn natuurlijke chromatinecontext te zuiveren van ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae.

Single-Copy Gene Locus Chromatine Zuivering in Saccharomyces cerevisiae

Leer het genereren en zuiveren van wild-type en mutant INO80 chromatine-remodelleringscomplexen uit HEK293-cellen met Anti-Flag-affiniteitschromatografie. Deze methode analyseert subunit-samenstelling via western blot.

Generatie en zuivering van Human INO80 chromatine remodeling Complexen en subes

Meer video's verkennen