Biochemische assays voor het analyseren van activiteiten van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling Enzymen

Het doel van de volgende procedure is om de verschillende biochemische activiteiten van chromatin remodelleringscomplexen die afhankelijk zijn van TP te meten. Dit wordt bereikt door het meten van een TP-afhankelijke verschuiving van een gepositioneerd nucleosoom van één uiteinde van een DNA-molecuul naar een meer centrale positie op het DNA, met behulp van een electrophoretic mobility shift assay of EMSA. Een soortgelijke methode op basis van EMSA kan worden gebruikt om de vorming van mononucleosomen gebonden aan het remodelleringscomplex te monitoren, om zo de nucleosoombindingsactiviteit van de chromatin remodelleringscomplexen te beoordelen.

Daarnaast kan dunne-laagchromatografie worden gebruikt om de APA-activiteit van TP-afhankelijke chromatineremodelleringscomplexen te meten. Uiteindelijk kunnen deze methoden worden gebruikt om de TP-afhankelijke chromatineremodellering van menselijke O 80-complexen te meten. In deze video demonstreer we biochemische assays voor het bestuderen van NO 80-chromatineremodelleringscomplexen.

Een soortgelijke methode kan ook worden toegepast om andere chromatineremodelleringscomplexen te bestuderen om een TP-afhankelijke nucleosoom-remodelleringsassay uit te voeren. Bereid eerst de nucleosoomsubstraten voor nadat een PCR-reactie van 100 microliter is opgezet zoals beschreven in de tabel. Voer de PCR-reacties uit in een thermocycler en laat de reactieproducten vervolgens twee keer door nucleasevrije spinzuilen lopen om eventuele niet-ingebouwde nucleotiden te verwijderen.

Meng vervolgens twee picomol $^{32}\text{P}$-gelabelde 601 DNA-fragmenten met zes microgram hilaire nucleosomen in 50 $\mu\text{L}$ buffer en incubeer het mengsel 30 minuten bij 30 °C. Verdun het mengsel vervolgens sequentieel tot 0,8 M, 0,6 M en 0,4 M natriumchloride door respectievelijk 12,5 $\mu\text{L}$, 20,8 $\mu\text{L}$ en 41,6 $\mu\text{L}$ tris-HCl-buffersolution, aangevuld met EDTA, PMSF en DTT, toe te voegen; incubeer na elke toevoeging 30 minuten bij 30 °C. Voeg na de laatste incubatie 125 en vervolgens 250 $\mu\text{L}$ tris-hydrochloridebuffer toe, verder aangevuld met non-indebt P 40 glycerol en PSA, in twee aanvullende verdunningen van 30 minuten bij 30 °C tot respectievelijk 0,2 M en 0,1 M natriumchloride.

Bewaar het mono-nucleosoomsubstraat vervolgens bij vier graden Celsius gedurende maximaal drie maanden voordat de assays met native polyacrylamidegels worden opgezet. Combineer vervolgens voor elke uit te voeren reactie ongeveer 20 nanomolair in oh 80 met de juiste hoeveelheid EB 100-buffer, voldoende om een volume van 4,75 microliter te verkrijgen in een vooraf gekoelde gesiliconiseerde 1,5 milliliter microcentrifugebuis; vries alle overgebleven NO 80-bevattende fracties onmiddellijk opnieuw in met gepulveriseerd droogijs.

Dispenseer vervolgens 5,25 µL vers bereide mastercocktail in elke reactiebuis en meng goed door herhaaldelijk op en neer te pipetteren. Incubeer de reacties vervolgens in een warmteblok van 30 °C. Voeg aan het einde van de incubatie 1,5 µL vers bereide removing mix toe aan elke buis om de reacties te beëindigen en meng vervolgens elke reactiebuis.

Centrifuge ze vervolgens en incubeer ze gedurende nog eens 30 minuten bij 30 °C. Ondertussen wordt de native polyacrylamidegel voorbereid in een verticale elektroforese-unit bij 100 volt gedurende 30 minuten bij 4 °C, waarbij 0,5 XTBE als runbuffer wordt gebruikt met een magnetische roerstaaf in de onderste kamer om een constante buffercirculatie te behouden. Na afloop van de incubatie worden 2,5 µL laadkleurstof aan elke reactie toegevoegd. Na een kortstondige centrifugatie worden de monsters met laadtips op de gel aangebracht.

Laat de gel lopen bij 200 volt gedurende 4,5 uur bij vier graden Celsius met buffercirculatie. Plaats de gel vervolgens op een stapel van twee vellen filterpapier en wikkel de filters met de gel erbovenin vershoudfolie om het signaal te detecteren. Stel de gel voor de gewenste tijd bloot aan een opslagfosforscherm bij vier graden Celsius en scan het scherm vervolgens met een isotoop-beeldvormingsscanner en analyseer de gegevens met de geschikte software om de DNA- en nucleosoom-afhankelijke APA-assays uit te voeren.

Begin door 10 tot 50 nanomolair van de immunogezuiverde subcomplexen te combineren met een hoeveelheid eeb 100-buffer die voldoende is om een volume van 2,2 µL te verkrijgen in één vooraf gekoelde, gesmeerde 1,5 ml microcentrifugebuis voor elke reactie, en vries vervolgens alle fracties die NO 80 bevatten onmiddellijk opnieuw in in poederdruis-ijs. Meng daarna voorzichtig 2,8 µL van een vers bereide subcocktail die DNA-nucleosomen bevat, of een cocktail zonder deze, in de enzymbevattende reactiebuisjes door middel van up-and-down pipetteren en plaats de buisjes in een warmteblok van 30 °C. Gebruik vervolgens een potlood om een zeer lichte lijn te trekken op ten minste 1,5 cm van de onderrand van een 20 bij 10 polyethyleen.

Ik bedoel dunne-laagchromatografie of een TLC-plaat. Breng vervolgens 0,5 µL van elk reactiemengsel aan op de lijn na 5, 15, 30 en 60 minuten incubatie, waarbij elk monster onmiddellijk wordt teruggeplaatst in het warmteblok, zodat er meerdere tijdspunten van één enkele buis kunnen worden genomen. Gebruik na het aanbrengen van het laatste monster een haardroger om de plaat te drogen en plaats de plaat vervolgens in een glazen kamer die voldoende bevat.

0,375 molair kaliumfosfaat, zodat de onderste 0,5 centimeter van de TLC-plaat in de oplossing wordt ondergedompeld. Sluit de kamer en laat de reactie lopen tot het front van de vloeistoffase de bovenkant van de TLC-plaat bereikt, waarna de plaat onmiddellijk drooggeblazen en blootgesteld moet worden aan een opslagfosfor-screen bij kamertemperatuur. Scan vervolgens het screen met een isotoop-beeldvormingsscannersysteem om de hoeveelheid radioactief a TP-substraat en d DP-product te bepalen.

Dit eerste experiment demonstreert dat het complex dat is gezuiverd via flag IES twee flag, N-O-A-T-E en flag NO 80 delta N soortgelijke nucleosoom-glijactiviteiten vertonen, wat aangeeft dat het N-terminus van NO 80 en/of de daarmee geassocieerde subunits overbodig zijn voor nucleosoom-remodellering door het NO 80-complex. In tegenstelling hiermee zijn complexen die zijn gezuiverd via flag NO 80 delta n delta HSA inactief in deze assay, wat aangeeft dat de remodelleringsactiviteit afhankelijk is van het HSA-domein van de NO 80 APAs en/of de daarmee geassocieerde subunits. Door gebruik te maken van een aanpassing van de procedure voor de nucleosoom-glijassay, kan men de nucleosoom-bindingsactiviteit van chromatine-remodelleringscomplexen meten.

In dit experiment leidde de incubatie van de nucleosomen met toenemende hoeveelheden intacte NO 80-complexen, gezuiverd via de NO 80 E-subeenheid, tot een dosisafhankelijk verdwijnen van de band die overeenkomt met de vrije mononucleosomen en het verschijnen van een nieuwe verschoven species die nabij de bovenkant van de gel migreerde. Daarentegen migreerde de verschoven species sneller wanneer de nucleosomen werden geïncubeerd met kleinere complexen die waren gezuiverd via NO 80 delta N en waarin een subset van NO 80-subeenheden ontbrak, wat suggereert dat de relatieve mobiliteit van de super-verschoven band wordt bepaald door de grootte van de complexen in de assay. In dit laatste experiment worden de resultaten getoond van een assay waarin de DNA- en NUCLEOSOOM-geactiveerde APA-activiteiten van twee verschillende NO 80-subcomplexen worden vergeleken.

De langzamer migrerende vlekken komen overeen met de startende alpha 32 P gelabelde a TP, en de sneller migrerende species zijn de A DP reactieproducten, waarbij de pijlen de richting van de solventmigratie aangeven. Bij het gebruik van deze procedures is het belangrijk om assays uit te voeren met variërende tijdsduuren en verschillende enzymconcentraties. Dit garandeert dat de metingen worden uitgevoerd op het moment dat de producttijd- en dosisresponscurves lineair zijn.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de nucleosoombindings- en nucleosoomglijactiviteiten van gezuiverde chromatin remodellingcomplexen via TPAs kunt analyseren. Vergeet niet dat het werken met radioactieve materialen gevaarlijk kan zijn. Men dient voorzorgsmaatregelen te nemen, zoals het dragen van een laboratoriumjas en oogbescherming, het controleren op radioactieve contaminatie en het correct afvoeren van radioactief afval.