Name: Biochemische assays voor het analyseren van activiteiten van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling Enzymen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Leer biochemische assays voor het analyseren van ATP-afhankelijke chromatin remodeling enzymen met EMSA en dunne-laagchromatografie. Deze methoden meten nucleosoomsliding, bindingsactiviteit en ATPase-activiteit van NO80-complexen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in het laboratorium van de auteurs wordt ondersteund door een subsidie van het National Institute of General Medical Sciences (GM41628) en door een subsidie aan het Stowers Institute for Medical Research van het Helen Nelson Medical Research Fund bij de Greater Kansas City Community Foundation.

1 ATP-afhankelijke Nucleosome Remodeling Testen Meten ATP-afhankelijke nucleosoom remodeling activiteiten, immuungezuiverd INO80 of INO80 subcomplexen geïncubeerd met ATP en mononucleosomal substraat, waarbij een enkele nucleosoom geplaatst aan een uiteinde van een 216-bp 32P-gemerkte DNA-fragment bevat. De reactieproducten worden vervolgens onderworpen aan elektroforese in natieve poly-acrylamide gels. <ol><li> De 32-P gemerkt, &#39;601&#39; DNA fragment genereren amplificeren van pGEM-3Z-4 601 a 216 bp DNA fragment dat een einde 601 gelegen nucleosoom positionering volgorde met de oligonucleotiden 5&#39;-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG en 5&#39;-als AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG forward en reverse primers. <ol><li> Stel een 100 ui PCR-reactie zoals beschreven in Tabel 1. </li><li> Voer de PCR-reacties in een thermische cycler met het volgende programma: 1 min bij 96 ° C, followed door 45 sec bij 94 ° C, 30 seconden bij 57 ° C, 60 seconden bij 72 ° C gedurende 30 cycli; eindigend met 7 min bij 72 ° C. </li><li> Nadat de PCR reactie is voltooid, verwijdert de niet opgenomen nucleotiden door het passeren van de reactieproducten tweemaal door nuclease-vrij spinkolommen. </li><li> Run 5 ui van het gezuiverde PCR product in een 1,2% agarose gel om te bevestigen dat het PCR reactie gegenereerde het gewenste ~ 216 bp DNA fragment. </li><li> Verdun 5 ui van het gezuiverde PCR product 20-voudig, en meet de DNA-concentratie met een UV spectrofotometer. De gemiddelde opbrengst is ~ 40 ng / ul. </li><li> Meet de radioactiviteit van 1 pl van het gezuiverde PCR product in een scintillatieteller. Schat de labelingsefficiëntie door het berekenen van de cpm / ng. Een succesvolle labeling reactie wordt verwacht ~ 15.000 cpm / ng 601 DNA fragment verkregen. </li></ol></li><li> Transfer Hela cel nucleosomen op het label 601 DNA met behulp van een seriële verdunning methode 5. <ol><li> Meng 2 pmol32p gemerkte DNA-fragment met 601 6 ug Hela nucleosomen (bereid zoals beschreven 5) in 50 ul van een buffer die 1,0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, en 1 mM DTT en incubeer bij 30 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Opeenvolgend verdun het mengsel tot 0,8 M, 0,6 M en 0,4 M NaCl door verdunning met 12,5 ul, 20,8 pl en 41,6 pl van respectievelijk 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, en 1 mM DTT, met een 30 min incubatie bij 30 ° C na elke verdunning. </li><li> Verdun het mengsel tot 0,2 M en 0,1 M NaCl door toevoeging van 125 ul en 250 ul van dezelfde buffer die 0,1% Nonidet P-40, 20% glycerol en 200 ug / ml BSA, met een 30 minuten incubatie bij 30 ° C tussen de laatste twee verdunningen. Bewaar de mononucleosome substraat bij 4 ° C gedurende maximaal 3 maanden. </li></ol></li><li> Voer ATP-afhankelijke nucleosoom glijden reacties in een totaal volume van 10 pl. De reaction bestanddelen worden vermeld in tabel 2. Aangezien de optimale NaCl concentratie INO80 nucleosoom remodeling activiteit ~ 50 mM NaCl (ongepubliceerde resultaten), passen de totale concentratie van NaCl in elke reactie tot 50 mM, met inachtneming van de hoeveelheid NaCl in bereidingen van nucleosomen en enzym. <ol><li> Voordat u begint met het opzetten van de assays, gegoten inheemse poly-acrylamide gels (18 x 16 cm). Om een gel dat 5% acrylamide bereiden (acrylamide: bisacrylamide 37,5: 1), 0,5 x TBE (45 mM Tris boraat, 1 mM EDTA), 0,01% ammoniumpersulfaat (APS) en 0,001% N, N, N&#39;, N&#39;-tetramethylethyleendiamine (TEMED) en meng het in tabel 3 vermelde bestanddelen. Laat de gel polymeriseren ten minste 2 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Ondertussen, voor elke reactie uit te voeren combineren in een vooraf gekoelde silicium 1,5 ml microcentrifugebuis ~ 20 nM INO80 of INO80 subcomplex (bereid zoals beschreven 3) met een hoeveelheid EB100 buffer ( <strong&gt; Tabel 4) voldoende om een volume van 4,75 pl geven. Onmiddellijk opnieuw bevriezen eventuele resterende-INO80 bevattende fracties in poedervorm droogijs of vloeibare stikstof. </li><li> Stel een meester cocktail met de rest van de ingrediënten, opschaling een factor X (waarbij X = aantal reacties +3). De hoeveelheid van elk die nodig is voor een 10 gl reactiemengsel ingrediënt wordt in tabel 5; het recept worden opgeschaald volgens het aantal reacties te voeren. Meng goed door de buis te tikken of door op en neer pipetteren met een Pipetman en draai de buis gedurende een paar seconden in een microcentrifuge benchtop. </li><li> Doseer 5.25 gl van de master cocktail aan elk van de reageerbuizen tijdens stap 1.3.2. Meng goed door en neer te pipetteren. Start de reactie door overdracht reactiebuizen een 30 ° C verwarmingsblok of waterbad en incubeer gedurende 2 uur. </li><li> Ondertussen bereiden &#39;verwijderen mix&#39; cocktail met concurrent DNAen nucleosomen, opschaling met een factor X (X = aantal reacties + 4). De hoeveelheid van elk die nodig is om 1,5 gl verwijderen mix voor een enkele reactie bereiden ingrediënt in Tabel 6; het recept worden opgeschaald afhankelijk van het aantal tests worden uitgevoerd. </li><li> Beëindig reacties door 1,5 pi van het mengsel te verwijderen. Meng goed, spin down en incubeer bij 30 ° C nog eens 30 minuten. </li><li> Ondertussen voorlooptijd het natieve polyacrylamidegel in een verticale elektroforese-eenheid bij 100 V gedurende 30 minuten bij 4 ° C, met 0,5 x TBE als loopbuffer met een magnetische roerstaaf in de onderste kamer constant buffer omloop gegarandeerd. </li><li> Om het monster te laden, voeg 2,5 pl ladingskleurstof met 3x TBE, 30% glycerol, 0,25% broomfenolblauw en 0,25% xyleencyanol FF. Meng goed, kort draaien de monsters, en laden op de gel met behulp van tips voor het laden. </li><li> Voer de elektroforese bij 200 V gedurende 4,5 uur bij 4 ° C met buffer circulatie.</li><li> Om het detecteren, breng de gel Stapels twee vellen filtreerpapier. Wikkel het filter papier met de gel op de top met behulp van duidelijke plastic omslag, en vervolgens bloot aan een opslag fosfor scherm bij 4 ° C voor de gewenste tijd. </li><li> Scan het scherm met een isotoop afbeeldingsscanner systeem en het analyseren met geschikte software. </li></ol></li></ol> 2 Mononucleosome bindingstests De bindingsaffiniteit van een bepaalde INO80 complex voor mononucleosomes assay Voer een elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA) met de mononucleosomal substraat gegenereerd in stap 1.2. <ol><li> Opzetten van de reactie mixen voor bindingsbepalingen zoals beschreven voor nucleosoom remodeling assays maar laat de ATP en het verwijderen mix van de reacties; incubeer bij 30 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Voeg 2,5 ul van laadkleurstof aan elk reactiemengsel, en gelden voor een native polyacrylamide gel met 3,5% acrylamide (acrylamide: bis 37,5: 1), 1% glycerol, 0.5x TBE, 0.01% APS en 0,001% TEMED. </li><li> Met 0.5x TBE als loopbuffer, voert de gel bij 200 V gedurende 2,5 uur bij 4 ° C met buffer circulatie en blootstellen aan een opslag fosforscherm. </li></ol> 3 DNA en Nucleosome-afhankelijke ATPase Assays Voer ATPase assays 5 pl reactiemengsels bevatten 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl, 6,6 mM MgCl2, 0,8 mM EDTA, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% glycerol, 0,1 mg / ml BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 pCi [α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol). Per INO80 complex of hoeveelheid INO80 complex te testen opgezet drie parallelle reacties, een met EB100 buffer om DNA of nucleosoom-onafhankelijke ATPase, een meet bevattende gesloten circulair plasmide-DNA (5.000 bp, ~ 30 nM) te meten DNA afhankelijke ATPase en een met Hela oligonucleosomen (~ 185 nM) voor nucleosoom-afhankelijke ATPase meten. Stel alle reacties op het ijs. <ol&gt; <li> Voor elke reactie samen 10-50 nM van de immuungezuiverd INO80 of INO80 subcomplexen met een hoeveelheid EB100 buffer voldoende om een ​​volume van 2,2 pl geven voorgekoeld gesmeerd 1,5 ml microcentrifuge buisjes. Onmiddellijk opnieuw te bevriezen elke-INO80 bevattende fracties in poedervorm droogijs of vloeibare stikstof. </li><li> Het opzetten van een master-cocktail. De hoeveelheid van elk die nodig is voor een enkele reactie ingrediënt wordt in tabel 7. Opwaardering het recept door grotere met een factor 3 (X +2) 1, waarin X = het aantal INO80 preparaten te testen. </li><li> Voor te bereiden &#39;sub-cocktails&#39; met buffer alleen, DNA, of nucleosomen, afzien 2,5 (X + 2) ul van de master cocktail in drie aparte buizen. Voeg 0,3 (X + 2) pi hetzij EB100, gesloten circulair plasmide-DNA (1,5 ug / ul) of Hela oligonucleosomen (1,5 ug / ul) en meng. </li><li> Doseer 2,8 pi van de juiste sub-cocktail naar de enzymbevattende reactiebuizen opgericht in step 3.1. Voorzichtig pipet op en neer om te mengen; voorkomen dat er bubbels. </li><li> Om reacties te beginnen, de overdracht van de reageerbuisjes op een 30 ° C warmte-blok. </li><li> Na 5, 15, 30 en 60 min incubatie spot 0,5 pi van elk reactiemengsel op een cellulose polyethyleenimine dunnelaagchromatografie (TLC) plaat (20 x 10 cm) in een rechte lijn ten minste 1,5 cm van de onderkant . Onmiddellijk terug reageerbuisjes tot 30 ° C warmteblok dus verschillende tijdstippen kan worden genomen van een enkele buis. Na het spotten, droog de TLC-platen met behulp van een föhn. </li><li> Breng de TLC platen met een glazen kamer die voldoende 0,375 M kaliumfosfaat (pH 3,5) zodat de bodem van 0,5 cm van de TLC-plaat wordt ondergedompeld in de oplossing. </li><li> Bedek de kamer en ontwikkelen tot de voorzijde van de vloeibare fase de top van de TLC-platen bereikt. Onmiddellijke droog de platen grondig met behulp van een föhn. </li><li> Maak de gedroogde TLC platen een fosforscherm opslag bij kamertemperatuur.Scan het scherm met een isotoop afbeeldingsscanner systeem bepalen de hoeveelheid radioactief ATP substraat en ADP product. </li><li> Om de hoeveelheid ATP gehydrolyseerd Vermenigvuldig het% ATP gehydrolyseerd door de hoeveelheid ATP in het uitgangsmateriaal aanwezige reactiemengsel met de volgende formule: pmol ATP gehydrolyseerd = 10 pmol ATP in conferentie reactiemengsel x [ADP / (ADP + ATP)] </li></ol>

<ol><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The biology of chromatin remodeling complexes.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).</li>
<li>Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ATP-dependent+chromatin-remodeling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes.</a> Cell. 154 (3), 490-503 (2013).</li>
<li>Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+purification+of+human+INO80+chromatin+remodeling+complexes+and+subcomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes.</a> , (2013).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).</li>
<li>Owen-Hughes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nucleosome+disruption+by+ATP-driven+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes.</a> Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).</li>
<li>Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INO80+ATP-dependent+chromatin+remodeling+complex+is+a+nucleosome+spacing+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor.</a> Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).</li>
<li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex%3A+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li>
<li>Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+histone+octamer+sliding+mediated+by+the+chromatin+remodeling+complex+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF.</a> Cell. 97 (7), 833-842 (1999).</li>
<li>Polach, K. J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+enzymes+as+probes+of+nucleosome+stability+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics.</a> Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).</li>
<li>Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+access+of+proteins+to+buried+nucleosomal+DNA+target+sites+occurs+via+a+mechanism+that+is+distinct+from+nucleosome+translocation%2C+Mol.Cell+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol.</a> 22 (20), 7147-7157 (2002).</li>
<li>Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+through+directional+DNA+translocation+from+an+internal+nucleosomal+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).</li>
<li>Gottschalk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+directs+recruitment+and+activation+of+an+ATP-dependent+chromatin+remodeler%2C+Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.</a> 106 (33), 13770-13774 (2009).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Measurement+of+Rapid+Inorganic+Phosphate+Release+Using+a+Novel+Fluorescent+Probe+and+Its+Application+to+Actomyosin+Subfragment+1+ATPase%2C+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry.</a> 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Luk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+histone+replacement+by+SWR1+requires+dual+activation+with+histone+H2A.Z+and+canonical+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome.</a> Cell. 143 (5), 725-736 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Om nucleosoom remodeling en ATPase activiteiten we waarnemen in assays afhankelijk van de katalytische activiteit van INO80 complexen, en niet op contaminerende remodeling en / of ATPase enzymen, we routinematig assay nucleosoom remodeling en ATPase activiteit van katalytisch inactieve versies INO80 complexen, gezuiverd parallel met wildtype INO80 volgens dezelfde procedure. Een negatieve controle reactie ontbreekt ATP moet worden uitgevoerd als het testen nucleosoom remodeling activiteit te testen op de aanwezigheid va...

SNF2 familie chromatine remodeling complexen zijn voorzien van een centrale SNF2-achtige ATPase subunit 1,2. Sommige SNF2-achtige ATPases functie enkelvoudige subeenheid enzymen, terwijl anderen werken als katalytische subeenheid grotere multi-subunit complexen. Ophelderen van de moleculaire mechanismen die voor elk van de subeenheden van chromatine remodeling complexen bijdragen aan hun activiteiten vereist het vermogen om biochemische testen die de verbouwing proces ontleden voeren. ATP-afhankelijke nucleosoom remodeling door de menselijke INO80 complex en andere chromatine hermodellering enzymen kunnen worden voorgesteld als een meerstaps proces dat begint met binding van het enzym remodeling nucleosomen, gevolgd door activering van de DNA en / of nucleosoom-afhankelijke ATPase, translocatie van de verbouwing enzym op nucleosomale DNA, en de eventuele herpositionering van nucleosomen 1,2. Inzicht in de moleculaire details van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling proces requires dissectie van de verbouwing reactie in zijn individuele stappen en definitie van de bijdragen van de individuele colli van het chromatine remodeling complex om elke stap van de reactie. Dergelijke analyses vereisen het vermogen om nucleosoom remodeling en andere activiteiten geanalyseerd middels gedefinieerde moleculaire substraten in vitro. In een eerdere JOVE protocol, beschreven we procedures gebruikt om INO80 chromatine remodeling complexen en subes met gedefinieerde subunit composities 3 te genereren. Hier presenteren we drie biochemische assays die kwantitatieve analyse van de nucleosoom binden, DNA en nucleosoom-geactiveerde ATPase en nucleosoom remodeling activiteiten die bij dergelijke complexen mogelijk.

<table><tbody><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR reaction buffer&nbsp;</td><td>Roche Applied Science&nbsp;</td><td>11435094001</td><td></td></tr><tr><td>Roche Taq DNA Polymerase</td><td>Roche Applied Science&nbsp;</td><td>11435094001</td><td></td></tr><tr><td>NucAway Nuclease-free Spin Columns&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>Cat. # AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ultrapure ATP&nbsp;</td><td>USB/Affymetrix</td><td>77241 25 UM</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide/Bis 37.5:1</td><td>Amresco</td><td>0254-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sonicated salmon sperm DNAs&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>27-4565-01</td><td></td></tr><tr><td>10% ammonium persulfate (APS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>benzonase&nbsp;</td><td>Novagen</td><td>Cat. No. 70664</td><td></td></tr><tr><td>dCTP, [&alpha;-32P]- 6,000 Ci/mmol</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU013Z250UC</td><td></td></tr><tr><td>PCR thermal cycler PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>Hoefer vertical electrophoresis unit</td><td>Hoefer</td><td>SE600X-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Storage Phosphor Screen&nbsp;</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0034-79</td><td></td></tr><tr><td>3MM filter paper</td><td>Whatman&nbsp;</td><td>28458-005</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Typhoon PhosphorImager&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant software</td><td>GE Healthcare</td><td>ver2003.02</td><td></td></tr><tr><td>TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F</td><td>Millipore</td><td>5725-7</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe</td><td>Biodex</td><td>Model 14C</td><td></td></tr></tbody></table>

biochemische assays voor het analyseren van activiteiten van de atp-afhankelijke chromatine remodeling enzymen

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Leden van de SNF2-familie van ATPasen functioneren vaak als onderdelen van multi-subunit chromatine-opnieuw vormende complexen die nucleosoomdynamiek en DNA-toegankelijkheid reguleren door ATP-afhankelijke nucleosoomopnieuwvorming te katalyseren. Biochemisch onderzoek naar de bijdragen van individuele subeenheden van dergelijke complexen aan de meervoudige ATP-afhankelijke chromatine-opnieuw vormingsreactie vereist het gebruik van assays die de productie van reactieproducten monitoren en de vorming van reactie-intermediaten meten. Dit JOVE-protocol beschrijft assays die het mogelijk maken om de biochemische activiteiten van chromatine-opnieuw vormende complexen of subcomplexen met verschillende combinaties van subeenheden te meten. Chromatine-opnieuw vorming wordt gemeten met behulp van een ATP-afhankelijke nucleosoomverschuivingsassay, die de beweging van een nucleosoom op een DNA-molecuul volgt met behulp van een op EMSA gebaseerde methode. De nucleosoombindende activiteit wordt gemeten door de vorming van hermodelleringscomplex-gebonden mononucleosomen te volgen met behulp van een vergelijkbare EMSA-gebaseerde methode, en DNA- of nucleosoomafhankelijke ATPase-activiteit wordt getest met behulp van dunne-laagchromatografie (TLC) om de snelheid van conversie van ATP naar ADP en fosfaat te meten in aanwezigheid van DNA of nucleosomen. Met behulp van deze assays kan men de functies van subeenheden van een chromatine-opnieuw vormend complex onderzoeken door de activiteiten van het complete complex te vergelijken met die welke een of meer subeenheden missen. Het menselijke INO80 chromatine-opnieuw vormende complex wordt als voorbeeld gebruikt; de hier beschreven methoden kunnen echter worden aangepast voor het onderzoek naar andere chromatine-opnieuw vormende complexen.

De figuren tonen representatieve resultaten van biochemische assays gebruikt INO80 activiteiten te karakteriseren, zoals nucleosoom schuiven (figuur 1) en binding (figuur 2) assays en DNA of nucleosoom-afhankelijke ATPase tests (figuur 3). De in figuur 1 experiment vergelijkt het vermogen van intacte INO80 complexen gezuiverd door FLAG-Ies2 of FLAG-INO80E en INO80 subes gezuiverd door hetzij FLAG-Ino80ΔN of Ino80ΔNΔHSA verbo...

Hier beschrijven we biochemische analyses die kunnen worden gebruikt om ATP-afhankelijke chromatine-hermodelleringsenzymen te karakteriseren op hun vermogen om 1) ATP-afhankelijk nucleosoomglijden te katalyseren, 2) te interageren met nucleosoomsubstraten en 3) ATP te hydrolyseren op een nucleosoom- of DNA-afhankelijke manier.

Biochemische assays voor het analyseren van activiteiten van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling Enzymen

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Het doel van de volgende procedure is om de verschillende biochemische activiteiten van chromatin remodelleringscomplexen die afhankelijk zijn van TP te meten. Dit wordt bereikt door het meten van een TP-afhankelijke verschuiving van een gepositioneerd nucleosoom van één uiteinde van een DNA-molecuul naar een meer centrale positie op het DNA, met behulp van een electrophoretic mobility shift assay of EMSA. Een soortgelijke methode op basis van EMSA kan worden gebruikt om de vorming van mononucleosomen gebonden aan het remodelleringscomplex te monitoren, om zo de nucleosoombindingsactiviteit van de chromatin remodelleringscomplexen te beoordelen.Daarnaast kan dunne-laagchromatografie worden gebruikt om de APA-activiteit van TP-afhankelijke chromatineremodelleringscomplexen te meten. Uiteindelijk kunnen deze methoden worden gebruikt om de TP-afhankelijke chromatineremodellering van menselijke O 80-complexen te meten. In deze video demonstreer we biochemische assays voor het bestuderen van NO 80-chromatineremodelleringscomplexen.Een soortgelijke methode kan ook worden toegepast om andere chromatineremodelleringscomplexen te bestuderen om een TP-afhankelijke nucleosoom-remodelleringsassay uit te voeren. Bereid eerst de nucleosoomsubstraten voor nadat een PCR-reactie van 100 microliter is opgezet zoals beschreven in de tabel. Voer de PCR-reacties uit in een thermocycler en laat de reactieproducten vervolgens twee keer door nucleasevrije spinzuilen lopen om eventuele niet-ingebouwde nucleotiden te verwijderen.Meng vervolgens twee picomol $^{32}\text{P}$-gelabelde 601 DNA-fragmenten met zes microgram hilaire nucleosomen in 50 $\mu\text{L}$ buffer en incubeer het mengsel 30 minuten bij 30 °C. Verdun het mengsel vervolgens sequentieel tot 0,8 M, 0,6 M en 0,4 M natriumchloride door respectievelijk 12,5 $\mu\text{L}$, 20,8 $\mu\text{L}$ en 41,6 $\mu\text{L}$ tris-HCl-buffersolution, aangevuld met EDTA, PMSF en DTT, toe te voegen; incubeer na elke toevoeging 30 minuten bij 30 °C. Voeg na de laatste incubatie 125 en vervolgens 250 $\mu\text{L}$ tris-hydrochloridebuffer toe, verder aangevuld met non-indebt P 40 glycerol en PSA, in twee aanvullende verdunningen van 30 minuten bij 30 °C tot respectievelijk 0,2 M en 0,1 M natriumchloride.Bewaar het mono-nucleosoomsubstraat vervolgens bij vier graden Celsius gedurende maximaal drie maanden voordat de assays met native polyacrylamidegels worden opgezet. Combineer vervolgens voor elke uit te voeren reactie ongeveer 20 nanomolair in oh 80 met de juiste hoeveelheid EB 100-buffer, voldoende om een volume van 4,75 microliter te verkrijgen in een vooraf gekoelde gesiliconiseerde 1,5 milliliter microcentrifugebuis; vries alle overgebleven NO 80-bevattende fracties onmiddellijk opnieuw in met gepulveriseerd droogijs.Dispenseer vervolgens 5,25 µL vers bereide mastercocktail in elke reactiebuis en meng goed door herhaaldelijk op en neer te pipetteren. Incubeer de reacties vervolgens in een warmteblok van 30 °C. Voeg aan het einde van de incubatie 1,5 µL vers bereide removing mix toe aan elke buis om de reacties te beëindigen en meng vervolgens elke reactiebuis.Centrifuge ze vervolgens en incubeer ze gedurende nog eens 30 minuten bij 30 °C. Ondertussen wordt de native polyacrylamidegel voorbereid in een verticale elektroforese-unit bij 100 volt gedurende 30 minuten bij 4 °C, waarbij 0,5 XTBE als runbuffer wordt gebruikt met een magnetische roerstaaf in de onderste kamer om een constante buffercirculatie te behouden. Na afloop van de incubatie worden 2,5 µL laadkleurstof aan elke reactie toegevoegd. Na een kortstondige centrifugatie worden de monsters met laadtips op de gel aangebracht.Laat de gel lopen bij 200 volt gedurende 4,5 uur bij vier graden Celsius met buffercirculatie. Plaats de gel vervolgens op een stapel van twee vellen filterpapier en wikkel de filters met de gel erbovenin vershoudfolie om het signaal te detecteren. Stel de gel voor de gewenste tijd bloot aan een opslagfosforscherm bij vier graden Celsius en scan het scherm vervolgens met een isotoop-beeldvormingsscanner en analyseer de gegevens met de geschikte software om de DNA- en nucleosoom-afhankelijke APA-assays uit te voeren.Begin door 10 tot 50 nanomolair van de immunogezuiverde subcomplexen te combineren met een hoeveelheid eeb 100-buffer die voldoende is om een volume van 2,2 µL te verkrijgen in één vooraf gekoelde, gesmeerde 1,5 ml microcentrifugebuis voor elke reactie, en vries vervolgens alle fracties die NO 80 bevatten onmiddellijk opnieuw in in poederdruis-ijs. Meng daarna voorzichtig 2,8 µL van een vers bereide subcocktail die DNA-nucleosomen bevat, of een cocktail zonder deze, in de enzymbevattende reactiebuisjes door middel van up-and-down pipetteren en plaats de buisjes in een warmteblok van 30 °C. Gebruik vervolgens een potlood om een zeer lichte lijn te trekken op ten minste 1,5 cm van de onderrand van een 20 bij 10 polyethyleen.Ik bedoel dunne-laagchromatografie of een TLC-plaat. Breng vervolgens 0,5 µL van elk reactiemengsel aan op de lijn na 5, 15, 30 en 60 minuten incubatie, waarbij elk monster onmiddellijk wordt teruggeplaatst in het warmteblok, zodat er meerdere tijdspunten van één enkele buis kunnen worden genomen. Gebruik na het aanbrengen van het laatste monster een haardroger om de plaat te drogen en plaats de plaat vervolgens in een glazen kamer die voldoende bevat.0,375 molair kaliumfosfaat, zodat de onderste 0,5 centimeter van de TLC-plaat in de oplossing wordt ondergedompeld. Sluit de kamer en laat de reactie lopen tot het front van de vloeistoffase de bovenkant van de TLC-plaat bereikt, waarna de plaat onmiddellijk drooggeblazen en blootgesteld moet worden aan een opslagfosfor-screen bij kamertemperatuur. Scan vervolgens het screen met een isotoop-beeldvormingsscannersysteem om de hoeveelheid radioactief a TP-substraat en d DP-product te bepalen.Dit eerste experiment demonstreert dat het complex dat is gezuiverd via flag IES twee flag, N-O-A-T-E en flag NO 80 delta N soortgelijke nucleosoom-glijactiviteiten vertonen, wat aangeeft dat het N-terminus van NO 80 en/of de daarmee geassocieerde subunits overbodig zijn voor nucleosoom-remodellering door het NO 80-complex. In tegenstelling hiermee zijn complexen die zijn gezuiverd via flag NO 80 delta n delta HSA inactief in deze assay, wat aangeeft dat de remodelleringsactiviteit afhankelijk is van het HSA-domein van de NO 80 APAs en/of de daarmee geassocieerde subunits. Door gebruik te maken van een aanpassing van de procedure voor de nucleosoom-glijassay, kan men de nucleosoom-bindingsactiviteit van chromatine-remodelleringscomplexen meten.In dit experiment leidde de incubatie van de nucleosomen met toenemende hoeveelheden intacte NO 80-complexen, gezuiverd via de NO 80 E-subeenheid, tot een dosisafhankelijk verdwijnen van de band die overeenkomt met de vrije mononucleosomen en het verschijnen van een nieuwe verschoven species die nabij de bovenkant van de gel migreerde. Daarentegen migreerde de verschoven species sneller wanneer de nucleosomen werden geïncubeerd met kleinere complexen die waren gezuiverd via NO 80 delta N en waarin een subset van NO 80-subeenheden ontbrak, wat suggereert dat de relatieve mobiliteit van de super-verschoven band wordt bepaald door de grootte van de complexen in de assay. In dit laatste experiment worden de resultaten getoond van een assay waarin de DNA- en NUCLEOSOOM-geactiveerde APA-activiteiten van twee verschillende NO 80-subcomplexen worden vergeleken.De langzamer migrerende vlekken komen overeen met de startende alpha 32 P gelabelde a TP, en de sneller migrerende species zijn de A DP reactieproducten, waarbij de pijlen de richting van de solventmigratie aangeven. Bij het gebruik van deze procedures is het belangrijk om assays uit te voeren met variërende tijdsduuren en verschillende enzymconcentraties. Dit garandeert dat de metingen worden uitgevoerd op het moment dat de producttijd- en dosisresponscurves lineair zijn.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de nucleosoombindings- en nucleosoomglijactiviteiten van gezuiverde chromatin remodellingcomplexen via TPAs kunt analyseren. Vergeet niet dat het werken met radioactieve materialen gevaarlijk kan zijn. Men dient voorzorgsmaatregelen te nemen, zoals het dragen van een laboratoriumjas en oogbescherming, het controleren op radioactieve contaminatie en het correct afvoeren van radioactief afval.

biochemical-assays-for-analyzing-activities-atp-dependent-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft hoe chromatine immunoprecipitatie (ChIP) wordt gebruikt om de dynamische wijzigingen studie naar de chromatine sjabloon die transcriptie veroorzaakt door een signaal transductie route te reguleren.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) om Assay Dynamic histon-eiwitten in Actieve genexpressie in menselijke cellen

Chromatine Interactie Analyse door Gekoppeld-End Tag Sequencing (Chia-PET) is een methode...

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

We beschrijven een basisprotocol voor het kwantificeren van in vitro ATPase-activiteit. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd op basis van het activiteitsniveau en de vereisten voor een bepaalde gezuiverde ATPase.

Meten<em&gt; In Vitro</em&gt; ATPase activiteit voor enzymatische Karakterisatie

Sequentiële zout winning van chromatine gebonden eiwitten is een nuttig instrument voor het bepalen van de bindende eigenschappen van grote eiwitcomplexen. Deze methode kan worden gebruikt om te evalueren van de rol van individuele subeenheden of domeinen in de algehele affiniteit van een eiwit complex om te bulk chromatine.

Sequentiële zout extracties uit te voeren voor de analyse van Bulk chromatine bindende eigenschappen van chromatine complexen wijzigen

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Remmers van histonacetyltransferases (HAT's, ook bekend als lysine acetyltransferasen), zoals CBP/p300, zijn potentiële therapieën voor de behandeling van kanker. Er zijn echter rigoureuze methoden nodig om deze remmers te valideren. Drie in vitro methoden voor validatie omvatten HAT-tests met recombinant acetyltransferases, immunoblotting voor histonacetylatie in de celcultuur en ChIP-qPCR.

Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

De interactie van een ATP-afhankelijke chromatine remodeller met een DNA-ligand wordt beschreven met behulp van CD-spectroscopie. De geïnduceerde conformatieveranderingen op een genpromotor geanalyseerd door de gegenereerde pieken kunnen worden gebruikt om het mechanisme van transcriptionele regulatie te begrijpen.

CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Dit protocol beschrijft een reeks methoden die analytische grootte-uitsluitingschromatografie omvatten om histon chaperone oligomerisatie en stabiliteit te bestuderen, pull-down assay om histon chaperone-histon interacties te ontrafelen, AUC om de stoichiometrie van de eiwitcomplexen te analyseren, en histon chaperoning assay om functioneel een vermeende histon chaperone in vitro te karakteriseren.

In vitro Karakterisering van Histone Chaperones met behulp van Analytische, Pull-Down en Chaperoning Assays

DNA-gordijn, een high-throughput single-molecule beeldvormingstechniek, biedt een platform voor real-time visualisatie van diverse eiwit-DNA-interacties. Het huidige protocol maakt gebruik van de DNA-gordijntechniek om de biologische rol en het moleculaire mechanisme van Abo1 te onderzoeken, een Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase.

Het ontcijferen van moleculair mechanisme van histonassemblage door DNA-gordijntechniek

Snelle en nauwkeurige chemische tests om te screenen op specifieke remmers zijn een belangrijk hulpmiddel in het arsenaal aan geneesmiddelenontwikkeling. Hier presenteren we een schaalbare acetyl-klikchemietest om de remming van HAT1-acetyleringsactiviteit te meten.

Een acetyl-klikchemietest om histonacetyltransferase 1-acetylering te meten

Leer biochemische assays voor het analyseren van ATP-afhankelijke chromatin remodeling enzymen met EMSA en dunne-laagchromatografie. Deze methoden meten nucleosoomsliding, bindingsactiviteit en ATPase-activiteit van NO80-complexen.

Biochemische assays voor het analyseren van activiteiten van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling Enzymen

Meer video's verkennen