Steekwond Letsel van de zebravis Adult Telencephalon: Een methode om Onderzoek gewervelde Brain Neurogenese and Regeneration
August 4th, 2014
Om licht te werpen op de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurogenese en regeneratie bij volwassen zebravissen, ontwikkelden we een protocol voor invasieve chirurgie dat mechanische verwondingen veroorzaakt in het volwassen telencephalon van de zebravis en daaropvolgend bewaken van veranderingen in de 'gestoken' hemisfeer door middel van immunohistochemie of in situ hybridisatie.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de cellulaire respons en de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij neurogenese bij volwassenen en regeneratie en herstel van het centrale zenuwstelsel te onderzoeken. Bij zebravissen wordt dit eerst bereikt door handmatig een verwonding te veroorzaken door de rechter cephalische hemisfeer van een volwassen zebravis te doorboren. Vervolgens, vijf dagen na de verwonding, wordt de vis gedood en wordt zijn hersenen uitgesneden en in aros ingebed voor het snijden in een ome.
Vervolgens worden de hersensecties gekleurd door immunohistochemie of in C twee hybridisatie met geschikte markers. Om celproliferatie te observeren, glio, agenesie en neurogenese, worden resultaten verkregen die een upregulatie van de prolifereringsmarker, PCNA, de radio gliale marker S 100 beta en oli twee EGFP gelabelde oligodendrocyten voorlopercellen die zijn gelabeld in de ventrikelzone na een steekwond, laten zien. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden betreft de transgene benadering om weefsel- of celtypespecifieke ablatie te produceren, wat betreft de eenvoud, snelheid en veroorzaakte efficiëntie, waardoor het mogelijk is om in korte tijd veel gewonde hersenen te produceren.
Na het anestheseren van volwassen zebravissen, plaatst u volgens het tekstprotocol individuele vissen in een snede in een blok trica gedrenkt tissuepapier onder een dissectiemicroscoop met licht van boven. Houd de vis voorzichtig met één hand vast en richt hem zodanig dat de toegang tot het hoofd vanaf de bovenkant mogelijk is met een spuit uitgerust met een naald van 30 gauge. Druk in de andere hand de naald verticaal door de schedel, niet dieper dan twee millimeter in de mediale regio van één cephalische hemisfeer.
Na het introduceren van de cephalische verwonding, plaatst u de vis in vers viswater. Wanneer het voltooid is, plaatst u de vis terug in het waterstromingssysteem. Laat de vis na het herstel gedurende de gewenste periode en euthaniseert u ze volgens het tekstprotocol, doodt ze op ijs en gebruikt u een scherpe schaar om achter de kieuwen te snijden om het hoofd van het lichaam te scheiden.
Breng de hoofden gedurende vijf minuten in één XPBS aan om te laten bloeden. Breng de hoofden vervolgens over in 4% para formaldehyde in PBS en incubeer ze een nacht bij vier graden Celsius of gedurende vier uur bij kamertemperatuur. Gebruik één XPBS in een petrischaal om de hoofden twee keer te wassen.
Snij vervolgens onder een dissectiemicroscoop de hersenen voorzichtig in PBS. Gooi alle hersenen zonder zichtbare laesie weg. Breng de hersenen over in twee milliliter reactiebuisjes gevuld met 1,5 milliliter 100% methanol en draai de buisjes vijf keer om voordat u ze gedurende ten minste 16 uur bij min 20 graden Celsius incubeert.
Om het weefsel voor immunohistochemie te rehydreren, incubeer de hersenen gedurende vijf minuten in een aflopende methanolreeks voordat u PBS tween 20 of PTW gebruikt om de hersenen vijf keer te wassen. Gedurende vijf minuten elke keer. Om de hersenen in te bedden, gebruikt u een overdrachtpipet om ze in de holtes van een polyethyleen vormbeker te plaatsen. Los 2% agros op in één XPBS door het in een magnetron bij 600 watt te verwarmen.
Laat de agros drie minuten afkoelen voor gebruik. Verwijder vervolgens voorzichtig de PTW van één hersenen voordat u aros gebruikt om de mal volledig te vullen. Gebruik de dissectienaald om de hersenen in de aros te draaien om de PTW weg te spoelen en oriënteer de hersenen met de ventrale kant naar beneden, dorsale kant naar boven en recht voordat u de agros laat afkoelen.
Verwijder met behulp van een dissectienaald het agrosblok uit de mal. Snijd vervolgens met de scherpe scheermes het agros parallel aan het talon cephalon aan het achterste uiteinde van de hersenen. Snijd nu het agros aan het voorste uiteinde van de hersenen voordat u het blok omdraait zodat het op het achterste vlak staat.
Verwijder het overtollige agros door sneden parallel aan de dorsale en ventrale zijde van de hersenen te maken. Draai vervolgens de hersenen terug zodat ze op hun ventrale kant liggen. Snijd ten slotte het blok in een afgesneden driehoek waarin het cephalon zich op het kleinere vlak bevindt.
Nadat u de viome hebt voorbereid volgens de instructies van de fabrikant, gebruikt u één XPBS om de bufferbaan te vullen, zodat deze net de bodem van de kling bereikt. Plaats vervolgens een kleine druppel superlijm op de bovenkant van de monsterschijf van de vibrator. Plaats vervolgens voorzichtig het vlak van het blok dat zich achter de hersenen bevindt op de superlijm.
Gebruik de microtoommanipulator om de monsterschijf in de bufferbak in te brengen en draai de monsterschijf naar de gewenste positie. Gebruik vervolgens een sleutel van drie millimeter Allen om de schroef vast te draaien en de manipulator te verwijderen. Plaats het blok in de bufferbaan zodat het cephalon net onder het oppervlak ligt met de dorsale kant van de hersenen naar de kling om de hersenen te snijden.
Bereid een 24-wellsplaat voor om de secties te verzamelen door één milliliter blokkeerbuffer per hersenen toe te voegen in de putjes van de plaat met de vibrerende microtoom. Begin met snijden met een dikte van 50 micrometer, een snelheid van één millimeter per seconde en een frequentie van 70 hertz. Gebruik een synthetisch borstel om de dunne plakjes aros op te pakken zodra ze van de kling komen en verzamel ze in de 24-wellsplaat.
Voer immunohistochemie uit door niet-specifieke sites gedurende één uur bij kamertemperatuur te blokkeren. Verwijder na de incubatie de buffer en voeg 250 microliters antilichaam verdund in blokkeerbuffer toe, incubeer een nacht bij vier graden Celsius of gedurende twee uur bij kamertemperatuur voordat u PTW gebruikt om de monsters drie keer gedurende één minuut elk te wassen. Na het incuberen en secundaire antilichamen gedurende twee uur bij kamertemperatuur.
Was de secties drie keer. Gebruik een wateroplosbaar niet-fluorescerend montage
Overzicht
Deze studie onderzoekt de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurogenese en regeneratie bij zebravissen. Er is een protocol ontwikkeld voor het induceren van mechanische verwondingen in het telencephalon van de zebravis, wat vervolgens analyse mogelijk maakt door middel van immunohistochemie en in situ hybridisatie.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Regeneratieve biologie
- Cellulaire biologie
Achtergrond
- Zebravissen zijn een modelorganisme voor het bestuderen van neurogenese.
- Begrip van de respons op verwondingen in het centrale zenuwstelsel is cruciaal voor regeneratieve geneeskunde.
- Eerdere studies hebben aangetoond dat wondvorming cellulaire proliferatie triggert.
- Immunohistochemische analyse is een belangrijke techniek voor het analyseren van cellulaire reacties.
Doel van het onderzoek
- Om een chirurgisch protocol te ontwikkelen voor het induceren van hersenletsel bij zebravissen.
- Om cellulaire reacties na de verwonding te monitoren.
- Om de upregulatie van specifieke markers geassocieerd met neurogenese te analyseren.
Gebruikte methoden
- Manuele verwondingsinductie door punctie van de hersenen van de zebravis.
- Dissectie en inbedding van hersenweefsel voor analyse.
- Immunohistochemische en in situ hybridisatietechnieken.
- Analyse van cellulaire proliferatie en gliële reacties.
Belangrijkste resultaten
- Verwonding leidt tot upregulatie van proliferatiemarkers zoals PCNA.
- Verhoogde aanwezigheid van radiale gliële cellen na de verwonding.
- Wondgenezing waargenomen binnen een gedefinieerde tijdsperiode.
- De techniek maakt efficiënte productie van meerdere verwonde monsters mogelijk.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is effectief voor het bestuderen van neurogenese bij zebravissen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrijpen van regeneratiemechanismen van het centrale zenuwstelsel.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methodologie voor verdere inzichten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic de-risking of neurogenic targets by providing a reproducible vertebrate model for CNS regeneration studies. It supports target validation through quantifiable proliferation and glial response readouts, facilitating early-stage hypothesis testing in discovery pipelines. The approach enhances predictive confidence for neurotherapeutic lead identification by linking injury response to molecular mechanisms in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses via quantifiable upregulation of PCNA and S100 beta markers post-injury.
- Operational Value: Provides a simple, rapid, and cost-efficient method to generate multiple injured models for target screening.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by linking lesion induction to observable neurogenic and gliogenic responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems suitable for immunohistochemistry and in situ hybridization-based assay development.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized lesion depth and contralateral internal controls.
- Scientific Value: Enables quantitative readouts of cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a disease-relevant system to study continuity from acute injury response to long-term regeneration and repair.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by enabling temporal profiling of marker expression (e.g., PCNA, S100 beta, OPCs) across post-injury days.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by identifying injury-induced transcriptional regulators via RNA deep sequencing integration.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, enabling iterative refinement of neurogenic leads based on regeneration phenotypes.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through lesion-induced marker upregulation and cellular response profiling.
- Screening: Delivers assay-ready tissue sections with standardized injury models for reproducible compound screening.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (e.g., PCNA+ cell density, OPC accumulation) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical work by modeling temporal dynamics of regeneration relevant to human CNS repair.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized platform for cross-project neurogenesis and regeneration screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through lesion-correlated neurogenic and gliogenic responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and high-throughput sample generation via simple manual injury induction.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neurogenic pathway modulation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of leads based on regeneration efficacy in a vertebrate disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish neuroanatomy and microsurgical techniques for consistent lesion placement.
- Dependent on instrumentation for sectioning (vibratome), immunohistochemistry, and imaging (confocal/compound microscopy).
- Necessitates cross-team standardization of injury depth, fixation, and sectioning protocols for reproducible results.
- Adaptation considerations include transgenic reporter lines (e.g., olig2:EGFP) for cell-type-specific tracking across model systems.
- Practical limitations include variability in lesion canal formation if injury depth exceeds two millimeters or is misdirected.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Generating a Stab Wound in the Telencephalon
2:21
Analyzing the Effect of Telencephalic Injury
4:36
Trimming the Agarose Block and Sectioning the Brain
6:36
Immunohistochemistry on Vibratome Sections
7:28
Telencephalon Stab Wound Results
8:49
Conclusion
