Name: Steekwond Letsel van de zebravis Adult Telencephalon: Een methode om Onderzoek gewervelde Brain Neurogenese and Regeneration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer een steekwondprotocol voor het volwassen zebravis-telencephalon om neurogenese en regeneratie van het centrale zenuwstelsel te bestuderen. Deze methode maakt efficiënt onderzoek naar hersenherstel mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken N. Borel en haar team van het vissenhuis, M. Rastegar voor hun hulp met microscopie, en T. Dickmeis voor opmerkingen over het manuscript. We zijn dankbaar voor de steun van de EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, het Interreg Netwerk voor Synthetische Biologie in het Boven-Rijndal (NSB-Upper Rhine) en het door BMBF gefinancierde netwerk EraSysBio.

Zebravis werden gehandhaafd in de vis-faciliteit van het Instituut voor Toxicologie en Genetica (ITG) in Karlsruhe Institute of Technology (KIT). Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse dierenbescherming normen en werden goedgekeurd door de regering van Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Duitsland (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 &#39;Adulte neurogenese&#39;). 1. Het genereren van een steekwond in de Telencephalon <ol><li> Anesthesie <ol><li> Om een ​​voorraad oplossing van tricaïne (3-amino benzoëzuurethylester, ook wel ethyl-3-aminobenzoaat) bereiden gebruiken 400 mg tricaïne poeder en los het op in 97,9 ml water en 2,1 ml 1 M Tris / HCl buffer (pH 9). Stel de pH op 7. Voeg 5 ml porties en bewaar ze bij -20 ° C tot gebruik. </li><li> Transfer een passend aantal 0,5-1 jaar oude zebravis uit hun tanks in plastic muis kooien. Opmerking: De schedel van een volwassen zebravissen op ongeveer 12maanden nog relatief zacht en kan gemakkelijk worden geperforeerd met een naald (zie paragraaf 1.2.3 en Figuur 1A). </li><li> De volwassen zebravissen verdoven combineren 5 ml tricaïne (voorraadoplossing) in een plastic kruising kooi met -100 ml zuiver aquarium water (eindconcentratie van tricaïne 0.02% (w / v) tricaïne). </li><li> Incubeer de vis in de anesthesie, totdat ze niet meer bewegen (45-60 sec). </li></ol></li><li> Telencephalon Injury <ol><li> Plaats individuele verdoofd zebravis in een spleet in een blok van-tricaïne doorweekt schuim. </li><li> Volgens een dissectie microscoop met licht van boven zachtjes Houd de vis met een hand en oriënteren op een manier die toegang tot de kop van boven mogelijk maakt. </li><li> Met de andere hand duw een 30 G injectiespuit (insulinespuit met geïntegreerde naald) verticaal door de schedel in het middengebied van een telencephalic halfrond (figuren 1A-1B). De hemisferen van de grote hersenen eenopnieuw zichtbaar door de schedel. Zorg ervoor dat de ingevoerde laesie is niet dieper dan 2 mm (figuur 1C). Opmerking: Het wordt sterk aanbevolen om de laesie altijd introduceren in hetzelfde halfrond naar de identificatie van de plaats van de laesie gemak bij het ontleden van de hersenen uit de schedel. </li><li> Na de introductie van de telencephalic letsel, plaats de vis in verse vis water. Blijf op de 10 vissen in een 2 L muis kooi gevuld met vis water voor het herstel en de muis kooi om een ​​waterstroom systeem. Opmerking: Het overlevingspercentage is meestal ~ 97% als vissen gezond zijn en geen andere experimenten werden uitgevoerd met de vis voor. Toevoeging van antibiotica om de vis water is niet noodzakelijk. Na herstel, vis normaal gedragen: ze zwemmen, voer, en stuurman. </li></ol></li></ol> 2. Analyseren van het effect van telencephalic Injury <ol><li> Brain Dissection en Fixation <ol><li> Re-verdoven de teruggewonnen vis op verschillende tijdstippen na laesie (typically, 1, 3, 5 en 14 dagen na laesie (DPL)) met 0,02% (w / v) tricaïne zoals hierboven en euthanize ze door ze gedurende 5 minuten in ijswater. </li><li> Leg de vis op een papieren tissue gedrenkt in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en scheiden het hoofd van het lichaam door te snijden achter de kieuwen met een scherpe schaar. </li><li> Houd de hoofden in 1x PBS gedurende 5 minuten om bloeden te staan. Opmerking: Dit riool bloed uit het weefsel, dat verdere stappen in het protocol kan verstoren. </li><li> Bevestig de koppen overnacht bij 4 ° C in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS of 4 uur bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Was vast hoofden tweemaal met 1x PBS in een petrischaal. </li><li> Ontleden hersenen zorgvuldig in 1x PBS onder een dissectiemicroscoop 23. De laesie is doorgaans zichtbaar onder de stereomicroscoop. Brains zonder zichtbare laesie moet worden weggegooid. </li><li> Transfer hersenen in 2 ml reageerbuisjes gevuld met 1,5 ml 100% Methanol (MeOH) en draai de buizen 5x vóór incubatieze bij -20 ° C gedurende ten minste 16 uur. Opmerking: De hersenen kan enkele maanden in MeOH bewaard bij -20 ° C totdat het nodig is voor immunohistochemie en in situ hybridisatie. </li></ol></li><li> Tissue Voorbereiding voor Immunohistochemistry <ol><li> Hydrateren de hersenen door een afnemende reeks methanol in 2 ml kunststofbuizen (sequentieel 75% MeOH (1 x PBS, 0,1% Tween-20 = PTW). 50% MeOH, 25% MeOH Incubeer de hersenen (15 hersenen / 2 ml reactiebuizen ) gedurende 5 min in elke oplossing. </li><li> Was de hersenen in PTW gedurende 5 minuten. 4x herhalen met verse PTW. </li></ol></li><li> Inbedding van de Brains voor Snijden <ol><li> Voor het inbedden, overdracht van de hersenen van de 2 ml reageerbuis in PTW in de holten van een polyethyleen molding plateau met een transfer pipet (5 mm diameter). </li><li> Bereid 2% agarose (DNA) af in 1x PBS in een erlenmeyer. Verwarmen in de magnetron bij 600 W totdat de agarose volledig is opgelost. Bereid 50 ml voor 10 hersenen. Laat the agarose afkoelen gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur voor gebruik. Houd de agarose op een voorverwarmde verwarmingsblok (60 ° C) terwijl inbedding de hersenen om stolling te voorkomen. </li><li> Verwijder de 1x PBS uit de matrijs die een brein door een Pasteur pipet (1 mm). Wees voorzichtig de hersenen niet te beschadigen. </li><li> Giet agarose in de vorm en vul het geheel. Gebruik een dissectie naald naar de hersenen krul in de agarose weg te wassen PTW het gemakkelijker om de hersenen te bedden. </li><li> Oriënteer de hersenen in de mal ventrale kant naar beneden, dorsale kant naar boven en plaats het recht. </li><li> Laat de agarose afkoelen. Voor een snellere koeling, zet de schimmel op ijs. Herhaal stappen. </li><li> Herhaal 2.3.3-2.3.6 voor alle hersenen. </li></ol></li><li> Trimmen van de Agarose Block <ol><li> Met behulp van een dissectie naald, pop uit de agarose blok. </li><li> Met een scherp scheermes, stuurde de agarose aan het achterste uiteinde van de hersenen. Zorg ervoor dat deze parallel loopt aan het telencephalon. </li><li> Snijd de agarose aan het voorste uiteinde van de hersenen. Dan flip het blok, zodat het staat op de achterste vliegtuig. </li><li> Verwijder de overmaat aan agarose door te snijden in parallel aan dorsale de hersenen en ventrale zijden. Dan draait u de hersenen terug, zodat het ligt op zijn buikzijde. </li><li> Snijd het blok een afgeknotte driehoek waarin de grote hersenen zich op het kleinere oppervlak (figuur 2). </li></ol></li><li> Voorbereiden van de Vibratome voor Snijden <ol><li> Bereid de vibratome volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik een nieuw scheermesje en te vervangen na 10 hersenen. </li><li> Vul het bad buffer met 1 x PBS tot een niveau dat enkel de onderzijde van het blad bereikt. </li><li> Plaats een kleine stip secondelijm op de bovenkant van het monster schijf van de vibratome. </li><li> Plaats het vlak dat zich posterieur van de hersenen van de superlijm voorzichtig. De lijm zal zo snel verharden als het in contact met de 1x PBSde vibratome buffer bad. </li><li> Plaats de objectplaatje het model in de buffer lade met behulp van de manipulator van de microtoom. </li><li> Gebruik de manipulator met het model schijf in de gewenste positie te draaien. Richt het blok in de buffer bad op een manier die de grote hersenen lokaliseert net onder het oppervlak, het dorsale gedeelte van de hersenen tegenover het blad. Draai vervolgens de SCRW met een 3 mm inbussleutel en verwijder de manipulator. Opmerking: De klemschroef of een van de spanmiddelen mag zich niet over het gat in de objectplaatje; in deze posities vastzetten van de objectplaatje niet mogelijk. </li></ol></li><li> Snijden de Brain <ol><li> Bereid een 24-wells plaat bij de afdelingen te verzamelen. Per hersenen worden doorgesneden, vul een putje met 1 ml blokkerende buffer (0,1% (v / v) 10% Tween-20, 0,2% (w / v) runderserumalbumine (BSA), 1% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO) in PBS). </li><li> Begin snijden op 50 urn dikte 1 mm / sec snelheid, en 70 Hzmet behulp van een trillende microtoom. </li><li> Gebruik een synthetische borstel (1 mm) te halen de dunne plakjes agarose als ze komen uit het blad en ze te verzamelen in de 24-well plaat. </li></ol></li><li> Immunohistochemie op vibratoomcoupes <ol><li> Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in blockingbuffer (0,1% (v / v) 10% Tween 20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO in PBS). </li><li> Verwijder het supernatant en voeg 250 ul antilichaam verdund in blokkerende buffer gedurende de nacht bij 4 ° C. Alternatief incubeer het primaire antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Was daarna 3x gedurende 10 min in PTW. Opmerking: Voor PCNA kleuring gebruiken een 1:400 verdunning (muis anti-PCNA Voor details zie tabel van materialen.). Meervoudige primaire antilichamen kunnen worden geïncubeerd tegelijk. </li><li> Incubeer de secties in het secundair antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur daarna wassen 3x gedurende 10 min in PTW. Opmerking: 1:1000 verdunning in PTW, voor detail zie tabel van materialen. Meerdere secundaire antilichamen kunnen worden geïncubeerd tegelijk. </li><li&gt; Optioneel: De beste resultaten worden waargenomen wanneer secties overnacht worden bewaard in PTW bij 4 ° C om het wassen zodat uit niet-specifiek gebonden secundaire antilichamen. In dit geval, vervang dan de PTW opnieuw voor de montage. </li></ol></li><li> Adult Brain RNA in situ hybridisatie (alternatief voor immunohistochemie) <ol><li> Brain Dissection en fixatie (dezelfde procedure als voor immunohistochemie): <ol><li> Hybridisatie van de probe. </li><li> Hydrateren hersenen in 2 ml reageerbuizen zoals beschreven voor immunohistochemie. </li><li> Incubeer hersenen in proteïnase K (ProtK;. 10 ug / ml eindconcentratie) in PTW gedurende 30 minuten. Na incubatie tijd verwijderen ProtK / PTW en zet de hersenen opnieuw gedurende 20 min in BT-Fix (4% PFA, 4% sucrose, 0,12 mM CaCl2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4). </li><li> Was 5x hersenen gedurende 5 min in PTW (0,1% (v / v) Tween-20 in PBS). </li><li> Verwijder PTW en spoel de hersenen in 500 piHYB buffer (50% (v / v) gedeïoniseerd formamide, 5x SSC, 500 ug / ml gist tRNA, 50 ug / ml heparine, 0,1% Tween-20, 9 mM citroenzuur). Wacht tot hersenen naar de bodem van de buis dan de bovenstaande vloeistof en voeg 500 ul van schone HYB buffer en incuberen bij 65-70 ° C gedurende 3-4 uur. </li><li> Verdun de RNA probe 1:200 of 1:400 (afhankelijk van de probe) in 400 pl eindvolume van HYB buffer. Verwarm de verdunde RNA probe bij 70 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder supernatant uit de hersenen en voeg de RNA probe, incuberen bij 65-70 ° C (O / N). Alle wasbuffer oplossingen moeten worden voorverwarmd en bewaard bij 70 ° C. </li></ol></li><li> Labeling <ol><li> Was de hersenen bij 65-70 ° C (gedurende alle 4 wasstappen) met 500 ui wasbuffer 1 (50% formamide, 1 x SSC, 0,05% Tween 20) tweemaal gedurende 30 minuten. Vervang buffer 1 met buffer 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20) en incubeer gedurende 15 minuten. Verwijder buffer 2 en was hersenen in buffer 3 (0,2 x SSC, 0,1% Tween 20) for 30 min, tweemaal Herhaal deze stap 2. Vervang buffer 3 door buffer 4 (0,1 x SSC, 0,05% Tween 20 in PTW), incubeer gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de supernatant en was gedurende 5 min in 500 ui PTW bij KT. </li><li> Embed hersenen in 2% agarose (in 1x PBS) en knip vibratoomcoupes (50-100 urn) zoals beschreven voor immunohistochemie. </li><li> Wash 1x gedurende 5 min in 500 pl blokkerende buffer (1x PBS, 0,1% Tween-20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO). </li><li> Verwijder de supernatant en voeg 500 ul blokkeerbuffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder supernatant en voeg 300 ul anti-Dig AP-gekoppeld antilichaam verdund 1:4000 in het blokkeren van buffer. </li><li> Incubeer o / n bij 4 ° C. </li></ol></li><li> NBT / BCIP kleuring <ol><li> Was 5x 15 min met PTW buffer bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel 1x in vlekken buffer. Was tweemaal 5 min in vlekken buffer (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20). </li><li> Verwijder supernatant en vlek met 500 μl kleurstofoplossing (3,5 gl 4-nitroblauwtetrazolium chloride (NBT) en 5-broom-4-chloor-3-indolyl-fosfaat (BCIP) per 1 ml kleurbuffer). </li><li> Stop kleuring door spoelen 3x tot 5x met PTW. </li></ol></li></ol></li><li> Montage van de afdelingen <ol><li> Monteer de secties op dia&#39;s met behulp van een in water oplosbare, niet-fluorescerende montage medium (zie de tabel Materials). </li><li> Houd dia in de koelkast bij 4 ° C. Opmerking: De kleuring is stabiel gedurende enkele weken of zelfs maanden. </li><li> Analyseer de dia onder een verbinding of confocale microscoop. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain%3A+significant+answers+and+significant+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li>
<li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).</li>
<li>Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+potential+of+glia%3A+lessons+from+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis.</a> Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).</li>
<li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Dev. 8, 3(2013).</li>
<li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+neuronal+regeneration+in+the+central+nervous+system+of+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish.</a> Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).</li>
<li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+fish+as+a+model+system+to+study+successful+regeneration+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).</li>
<li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295, 278-293 (2006).</li>
<li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+origin%2C+proliferation+dynamics%2C+migration+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Dev Biol. 295, 263-277 (2006).</li>
<li>Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+migration%2C+neuronal+differentiation%2C+and+long-term+survival+of+new+cells+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain.</a> J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).</li>
<li>Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29, 745-757 (2007).</li>
<li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+a+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li>
<li>Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+composition+of+neurogenic+periventricular+zones+in+the+adult+zebrafish+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain.</a> J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).</li>
<li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li>
<li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).</li>
<li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).</li>
<li>Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).</li>
<li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon%3A+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60, 343-357 (2011).</li>
<li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).</li>
<li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).</li>
<li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138, 4831-4841 (2011).</li>
<li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338, 1353-1356 (2012).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).</li>
<li>Armant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+whole+mount+in+situ+analysis+of+transcriptional+regulators+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 380, 351-362 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We beschrijven hier een methode om een telencephalic beschadiging te induceren door op een naald door de schedel van de volwassen zebravissen, en de cellulaire en moleculaire reactie hierop schade door immunohistochemie en in situ hybridisatie analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek andere bestaande benaderingen zijn eenvoud, snelheid en kostenefficiëntie. Daarom kan deze techniek, die in korte tijd productie van veel gewonden hersenen kan gemakkelijk gecombineerd worden met een grootschalige in situ hybridisatie scherm om genen met een rol in regeneratie en neurogenese. De leeftijd van de volwassen zebravissen waarop de schade wordt uitgevoerd is van cruciaal belang. Als de vissen ouder dan 1,5 jaar, de schedel te hard en het is mogelijk dat de schedel wordt omlaag geduwd of gebroken in plaats van netjes geperforeerd. In tegenstelling, bij jongere vissen (jonger dan 4 maanden), is er nog veel van neurogenese gaande, die misschien wel lead vals-positieve resultaten met betrekking tot reactief neurogenese. Een andere belangrijke stap in deze benadering is om de efficiëntie van de steekwond verifiëren en sluiten dat beide hemisferen gewond. Dit kan worden gevolgd door het kleuren van de secties met de anti-PCNA-antilichaam. In een correct ingevoerd laesie moet PCNA aanzienlijk up-gereguleerd in slechts een van de hemisferen. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat de geïnduceerde mechanische verwonding verschillende bijwerkingen zoals niet-specifieke cel ablatie, verhoogde celdood als gevolg van secundaire degeneratie, ontsteking en vernietiging van de bloed-hersenbarrière, en beschadiging van ventriculaire zone en zo zal hebben een mogelijk gevolg stroming van het hersenvocht in de hersenen parenchym. Echter, de gewonde vis lijken weinig last van de blessure. Binnen 2 minuten zijn ze vrij zwemmen weer en normale eetgedrag wordt hersteld binnen ongeveer 4 uur. Na 3 weken injury is morfologisch niet meer zichtbaar. In onze handen, van enkele honderden operaties hebben we niet een enkele vis te verliezen, ondanks het feit dat we een 100% percentage letsels zoals vastgesteld door histologie op 5 dagen na de laesie. In de laatste jaren andere technieken zoals transgene benaderingen zijn ontwikkeld in zebravis weefsel of celtype specifieke ablatie 2 produceren. Hoewel deze technieken zijn zeer elegant en minimaal invasieve ze zijn gebaseerd op het genereren van complexe DNA-constructen en de instelling van verschillende stabiele transgene zebravis lijnen die zeer vervelend en tijdrovend zijn. Daarom eenvoudige mechanische benaderingen zoals de in dit protocol beschreven assay blijven een belangrijk instrument om volwassen hersenen neurogenese en regeneratie te bestuderen.

Zoogdieren hebben een zeer beperkte capaciteit om nieuwe neuronen te genereren op volwassen leeftijd en volwassen neurogenese in de hersenen is grotendeels beperkt tot twee telencephalic gebieden gelegen aan de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone (SGZ) van de dentate gyrus in de hippocampus 1. Zoogdieren evenmin letsel aan de hersenen veroorzaakt door neurodegeneratieve ziekten, beroerte of letsel herstellen efficiënt. Verloren neuronen niet vervangen, maar proliferatie van verschillende soorten gliacellen, zoals astrocyten, microglia en oligodendrocyten, waargenomen. Als gevolg van deze proliferatieve proces genaamd reactieve gliosis, wordt de verwonde hersenweefsel afgedicht door de vorming van een gliale litteken, die neuronale en axonale regeneratie 2-4 remt. In tegenstelling tot zoogdieren, beenvissen, zoals de zebravis vormen nieuwe neuronen overvloedig in volwassen stadia en hebben een hoge regeneratieve en proliferative potentieel letsels van het centrale zenuwstelsel 2,5-7 herstellen. De zebravis volwassen hersenen bevat 16 verschillende neurale stamcellen niches die een groot aantal nieuwe neuronen te genereren gedurende de gehele levensduur 8-11. Neuronen geboren in deze specifieke proliferatie zones van de volwassen hersenen zebravis migreren naar hun doelgebieden, waar ze zullen rijpen en te integreren in de bestaande neuronale netwerken 8,10,12-15. Onder de voorlopercellen zones die in volwassen zebravissen, de telencephalic ventriculaire zone is een van de meest bestudeerde neuronale stamcellen niches. Cellen in deze voorlopercellen niche kan worden ingedeeld in drie typen betrekking tot hun morfologie, divisie snelheid en expressie van verschillende gliale en neuronale merkers. Type I en type II cellen radiale gliale als cellen die lange processen. Ze drukken stamcellen markers inclusief GFAP, nestine en S100β. Type I cellen niet vermenigvuldigen, terwijl type II cellen proliferate langzaam, zoals blijkt uit hun expressie van proliferatie merkers zoals prolifererende cel nucleair antigen (PCNA) en de toevoeging van desoxythymidine analogen. Het type III cellen zijn snel delende cellen die zich inzetten voor neurale voorlopercellen en expressbedrijf neurale marker-genen, zoals PSA-NCAM 5,16. Hoewel de regeneratieve capaciteit van beenvissen goed gedocumenteerd zijn, hebben echter slechts enkele publicaties beschreven en in detail onderzocht de cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij neuronale regeneratie in de volwassen grote hersenen in antwoord op letsels 15,17-22. Om de mechanismen die betrokken zijn bij de zebravis volwassen centrale zenuwstelsel regeneratie en reparatie ontcijferen en de gelijkenissen en de verschillen tussen constitutieve en regeneratieve neurogenese begrijpen, ontwikkelden we een zebravis model van volwassen telencephalic letsel. Hier beschrijven we visueel hoe een blessure te genereren in een van de telencephalic hemispheres met behulp van een injectienaald, terwijl de contralaterale zijde unlesioned als een interne controle. We zullen zien hoe veranderingen na verwonding in celproliferatie en genexpressie door immunohistochemie en in situ hybridisatie assays volgen.

<table><tbody><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS (-/-)</td><td>Life technologies</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>30 G spuit (Omnican 40)</td><td>B.Braun Melsungen</td><td>916162</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen vormbek</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>PeqGOLD Universal Agarose</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Rundereiwit</td><td>Biochrom</td><td>W 2835919108</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie naald</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 414</td><td>Schäffler und Wörner</td><td><a href="http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx?ItemID=06%201362%200020">06 1362 0020</a></td><td></td></tr><tr><td>Glazen plaatjes</td><td>Labonord</td><td>5305103</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes 24 x 60 mm</td><td>Labonord</td><td>5305060</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen, 94 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon buisjes, 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>24-well plaat</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100 (1:500)</td><td>Dako</td><td>Z031101-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PCNA (1:400)</td><td>Dako</td><td>M087901</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP (1:1.000)</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>anti-Dig AP-gekoppeld antilichaam</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloor-3-indolyl-fosfaat (BCIP)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383221</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitroblue tetrazoliumboorchloride (NBT)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen vormbek</td><td>Polysciences</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop Sp5 DM6000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop Nikon SMZ 645</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well vlakbodem weefselkweekplaten</td><td>Falcon catalogus</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Student Dumont #5 Pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio Tg(olig2:EGFP)</td><td>Shin et al.24</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio WT stammen (bijv., AB2O2)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

steekwond letsel van de zebravis adult telencephalon: een methode om onderzoek gewervelde brain neurogenese and regeneration

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Volwassen zebravissen hebben een geweldig vermogen om na een blessure hun centrale zenuwstelsel te regenereren. Om de cellulaire respons en de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de zebravis volwassen centrale zenuwstelsel (CNS) regeneratie en reparatie onderzoeken, ontwikkelden we een zebravis model van volwassen telencephalic letsel. In deze benadering, we handmatig een blessure te genereren door op een insuline naald in de zebravis volwassen telencephalon. Op verschillende bericht letsel dagen, zijn vis opgeofferd, hun hersenen ontleed uit en gekleurd door immunohistochemie en / of in situ hybridisatie (ISH) met geschikte markers om celproliferatie, gliogenesis en neurogenese observeren. De contralaterale hemisfeer unlesioned dient als een interne controle. Deze methode gecombineerd met bijvoorbeeld RNA deep sequencing kan helpen om het scherm voor nieuwe genen met een rol in de zebravis volwassen telencephalon neurogenese, regeneratie en reparatie.

De in dit artikel beschreven werkstroom, werd een laesie ingebracht in de rechterhelft van een volwassen zebravissen telencephalon (Figuren 1A-1B). Een correcte verwonding leidt tot een laesie kanaal dat zich uitstrekt van dorsale ventrale de hele pallium van de grote hersenen (Figuur 3C). Het letsel moet worden beperkt tot een van de hemisferen en mag niet de mediale ventrikel te steken. Het letsel kanaal is zichtbaar met helder veld microscopie (figuur 3C) en zal genezen na ongeveer 35 dagen 15. Eerder werd aangetoond dat na verwonding een up-regulatie van prolifererende celkernantigeen (PCNA, figuur 3A) en S100β (figuur 3B) en 3 tot 7 RAP detecteerbaar door immunohistochemie 15. De kleuring van PCNA en S100β overlappingen aangeeft proliferatie van radiale gliacellen. Furthermore, teneinde oligodendrocyt-voorlopercellen (OPC) visualiseren, werd een steekwond assay uitgevoerd op de Tg (Olig2: EGFP) vis 24. Na kleuring met anti-GFP-antilichaam, accumulatie van OPC dicht bij de laesie kanaal detecteerbaar (Figuur 3D). Deze opeenstapeling is van voorbijgaande aard, en OPC clusters worden niet meer waargenomen bij 35 dpl 15. Als het letsel niet goed is ingevoerd, zal de laesie kanaal niet zichtbaar zijn, en up-regulatie van PCNA en S100β of accumulatie van OPC&#39;s zal niet detecteerbaar zijn. PCNA is de meest gevoelige marker voor hersenletsel. Om de efficiëntie van de steekwond te verifiëren en uit te sluiten dat beide hersenhelften zijn gewond, is het sterk aanbevolen om altijd vlekken op de secties met een anti-PCNA antilichaam. In een correct ingevoerd laesie moet PCNA aanzienlijk up-gereguleerd (tot 4 maal 15) in slechts een van de hemisferen. Hoewel in de meeste gevallen isvoldoende om alleen de contralaterale unlesioned kant als een interne controle met betrekking tot veranderingen in genexpressie controleren, is het sterk aanbevolen om de genexpressie te vergelijken in de controle halfrond met de expressie in telencephalic hemisferen van wild type hersenen. Zo kan systemische effecten van de laesie op genexpressie dat zou beïnvloeden beide hemisferen gedetecteerd. De steekwond assay in combinatie met een systematische expressie scherm van transcriptie regulatoren (TR) (25 en Schmidt et al.., Ongepubliceerd) kunnen ook worden gebruikt TR genen met mogelijke rol bij neurogenese en regeneratie (Figuren 4A-4C). Deze benadering heeft een aantal factoren die zijn uitgedrukt in de grote hersenen en waarvan de expressie specifiek up-gereguleerd in reactie op verwonding (figuur 4A-C) geïdentificeerd. <imgalt = &quot;Figuur 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figuur 1. Schematische weergave van volwassen zebravissen telencephalic stab verwonden. A) Een insuline spuit naald wordt geduwd door de schedel van een volwassen zebravissen een telencephalic letsel te genereren. De witte onderbroken lijn geeft de grens tussen de twee hersenhelften telencephalic en het groene kruis geeft de positie van de steekwond. B) Dorsal weergave van een volwassen hersenen zebravis. De belangrijkste hersengebieden aangegeven. De groene kruis toont de positie van de geïnduceerde schade. C) De punt van de naald, die dient om de telencephalic beschadiging te induceren, meet 2 mm. Reukbol (ob), grote hersenen (tel) en optische tectum (ot). <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2. SChematic voorstelling van een volwassen zebravis hersenen in een bijgesneden agarose blok net voor vibratome snijden. Anterior is up. Reukbol (ob), grote hersenen (tel), optische tectum (ot), cerebellum (cb) en merg (m). Schaal bar: 500 micrometer. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3. Regeneratieve reacties op wond letsel steken. AD) Volwassen zebravis hersenen op 5 dagen na de laesie (DPL). AB) De proliferatieve marker PCNA (A) en de radiale gliale marker S100β (B) zijn up-gereguleerd in de ventriculaire zone (pijlen) op stab verwonden. (C) Het letsel kanaal is zichtbaar onder helderveld (pijlen). De ventriculaire zone wordt aangegeven met de groene lijn. (D) Oligodendrocyte voorlopercellen (Olig2: EGFP +) ophopen op de plaats van laesie (pijlen). Schaal bar: 200 micrometer. In alle panelen, de rechter hersenhelft is de laesie halfrond. Dorsale is up. De stippellijn in A tot en met D geeft de grens tussen het pallium en de subpallium. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" /> Figuur 4. Voorbeeld genen up-gereguleerd in reactie op verwonding steken. Merk de sterke opwaartse regulatie (pijlen) van eomesa (A, B) en sox4a (C) mRNA expressie in de rechter hemisfeer telencephalic (gestoken halfrond) wordt bewaakt door in situ hybridisatie bij 5 DPL. De linker hersenhelft is ongedeerd en dient als controle. (B) Toont een sterkere vergroting van de dorsale telencephalic regio A. Dorsale is up. Schaalbalk: 200 urn voor A en C en 55 urn voor B.stippellijn in A en C geeft de scheiding tussen het pallium en de subpallium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <table><tbody><tr><td colspan="2"> AFKORTINGEN </td></tr><tr><td> AP </td><td> Alkalische fosfatase </td></tr><tr><td> BVIE </td><td> 5-broom-4-chloor-3&#39;-indolyphosphate </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Runderserumalbumine </td></tr><tr><td> CNS </td><td> Centrale zenuwstelsel </td></tr><tr><td> Graven </td><td> Digoxygenine </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Dimethylsulfoxide </td></tr><tr><td> dpl </td><td> Dagen na de laesie </td></tr><tr><td> eomesa </td><td> Eomesodermin homoloog een </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Gliale fibrillaire zure eiwit </td></tr><tr><td> hr </td><td> Uur </td></tr><tr><td> HYBbuffer </td><td> Hybridisatiebuffer </td></tr><tr><td> ISH </td><td> in situ hybridisatie </td></tr><tr><td> MeOH </td><td> Methanol </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Nitro-blauw tetrazolium </td></tr><tr><td> OPC&#39;s </td><td> Oligodendrocyt voorlopercellen </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing </td></tr><tr><td> PCNA </td><td> Uitdijende celkernantigeen </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Paraformaldehyde </td></tr><tr><td> ProtK </td><td> Proteinase K </td></tr><tr><td> PSA-NCAM </td><td> Polysialylated neuronale celadhesie molecule </td></tr><tr><td> PTW </td><td> PBS, 0,1% Tween-20 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> Ribonucleïnezuur </td></tr><tr><td> RT </td><td> Kamertemperatuur </td></tr><tr><td> SGZ </td><td> Subgranulaire zone </td></tr><tr><td> sox4a </td><td> SRY-doos met gen 4a</td></tr><tr><td> SSC </td><td> Zoutoplossing-natriumcitraat </td></tr><tr><td> SVZ </td><td> Subventriculaire zone </td></tr><tr><td> TR </td><td> Transcriptie regulatoren </td></tr></tbody></table>

Om licht te werpen op de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurogenese en regeneratie bij volwassen zebravissen, ontwikkelden we een protocol voor invasieve chirurgie dat mechanische verwondingen veroorzaakt in het volwassen telencephalon van de zebravis en daaropvolgend bewaken van veranderingen in de 'gestoken' hemisfeer door middel van immunohistochemie of in situ hybridisatie.

Steekwond Letsel van de zebravis Adult Telencephalon: Een methode om Onderzoek gewervelde Brain Neurogenese and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de cellulaire respons en de moleculaire mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij neurogenese bij volwassenen en de regeneratie en herstel van het centrale zenuwstelsel. Bij zebravis wordt dit eerst bereikt door handmatig een letsel te veroorzaken door de rechter cerebrale hemisfeer van een volwassen zebravis te doorboren. Vervolgens wordt de vis vijf dagen na het letsel geofferd, waarna de hersenen worden gedisseceerd en ingebed in oros voor het maken van coupes in een ome.Vervolgens worden de hersensecties gekleurd via immunohistochemie of in situ hybridisatie met geschikte markers. Om celproliferatie, gliogenese en neurogenese waar te nemen, worden resultaten verkregen die een upregulatie tonen van de proliferatiemarker PCNA, de radiogliale marker S100 beta en Oli2 EGFP-gelabelde oligodendrocyten-precursorcellen in de ventriculaire zone na een steekwonde. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de transgene benadering om weefsel- of celtypespecifieke ablatie te produceren, is de eenvoud, snelheid en kostenefficiëntie, waardoor in korte tijd veel beschadigde hersenen kunnen worden geproduceerd.Nadat de volwassen zebravissen zijn gebenestheed volgens het tekstprotocol, plaatst u de vissen individueel in een gleuf van een blok met in trica gedrenkt weefselpapier onder een dissectiemicroscoop met bovenverlichting. Houd de vis voorzichtig met één hand vast en oriënteer deze zodanig dat de kop van bovenaf toegankelijk is met een spuit voorzien van een naald met maat 30 gauge. Duw met de andere hand de naald verticaal door de schedel, niet dieper dan 2 mm, in de mediale regio van één cerebrale hemisfeer.Plaats de vis na het aanbrengen van het cephalische letsel in vers viswater. Wanneer dit voltooid is, brengt u de vis terug naar het waterstroomsyteem. Laat de vissen gedurende de gewenste periode herstellen en euthanaseer ze volgens het tekstprotocol; offer ze vervolgens op op ijs en gebruik een scherpe schaar om achter de kieuwen te knippen om de kop van het lichaam te scheiden.Incubeer de koppen in 1X PBS gedurende vijf minuten om bloedingen mogelijk te maken. Breng de koppen vervolgens over in 4% paraformaldehyde in PBS en incubeer deze overnacht bij 4 °C of gedurende vier uur bij kamertemperatuur. Gebruik na fixatie 1X PBS in een Petrischaal om de koppen twee keer te wassen.Dissekeer vervolgens de hersenen zorgvuldig in PBS onder een dissectiemicroscoop. Verwijder alle hersenen zonder zichtbare laesie. Breng de hersenen over in reactiebuisjes van twee milliliter gevuld met 1,5 milliliter 100% methanol en keer de buisjes vijf keer om voordat ze gedurende ten minste 16 uur worden geïncubeerd bij minus 20 graden Celsius.Om het weefsel te rehydrateren voor immunohistochemie, worden de hersenen telkens vijf minuten geïncubeerd in een aflopende methanolreeks, waarna de hersenen vijf keer gewassen worden met PBS tween 20 of PTW. Telkens gedurende vijf minuten. Om de hersenen vervolgens in te bedden, wordt een transferpipet gebruikt om ze in de holtes van een polyethyleen gietvormenplaat te plaatsen; lossen 2% agros op in 1x PBS door het te verhitten in een magnetron op 600 watt.Laat de agros drie minuten afkoelen voor gebruik. Verwijder vervolgens voorzichtig de PTW uit één brein voordat de aros wordt gebruikt om de mal volledig te vullen. Gebruik de dissectienaald om het brein in de aros te draaien om de PTW weg te wassen en oriënteer het brein met de ventrale zijde naar beneden en de dorsale zijde naar boven, en positioneer het recht voordat de agros wordt afgekoeld.Verwijder het agros-blok uit de mal met een dissectienaald. Snijd vervolgens met het scherpe scheermes het agros parallel aan het talon cephalon aan het posterieure uiteinde van de hersenen. Snijd nu het agros aan het anterieure uiteinde van de hersenen voordat u het blok omkeert zodat het op het posterieure vlak staat.Verwijder het overtollige agar door sneden parallel aan de dorsale en ventrale zijden van de hersenen te maken. Draai de hersenen vervolgens terug zodat ze op de ventrale zijde liggen. Snijd het blok ten slotte in een afgeknotte driehoek waarbij het cephalon zich aan het kleinere vlak bevindt.Nadat het viome is voorbereid volgens de instructies van de fabrikant, wordt XPBS gebruikt om het bufferbad te vullen tot het net de onderkant van het mes bereikt. Plaats vervolgens een kleine druppel secondelijm op de bovenkant van de specimen-schijf van de vibrator. Plaats daarna voorzichtig het vlak van het blok dat zich posterieur aan de hersenen bevindt op de secondelijm.Gebruik de microtoommanipulator om de monsterschijf in het bufferbakje te plaatsen en draai de monsterschijf naar de gewenste positie. Gebruik vervolgens een inbussleutel van drie millimeter om de schroef aan te draaien en verwijder de manipulator. Plaats het blok in het bufferbad zodanig dat het cephalon net onder het oppervlak ligt, met de dorsale zijde van het brein naar het mes gericht om de hersenen te snijden.Bereid een 24-wellplaat voor het opvangen van de coupes door één milliliter blokkeringsbuffer per brein in de wells van de plaat met de vibratiotom te voegen. Begin het coupesnijden bij een dikte van 50 micrometer, een snelheid van één millimeter per seconde en een frequentie van 70 hertz. Gebruik een synthetisch penseel om de dunne plakjes aros op te vangen zodra ze van het mes komen en verzamel deze in de 24-wellplaat.Blokkeer voor het uitvoeren van immunohistochemie de aspecifieke bindingsplaatsen gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder na de incubatie de buffer en voeg 250 µL antilichaam toe, verdund in blokkeringsbuffer; incubeer dit overnacht bij 4 °C of gedurende twee uur bij kamertemperatuur, voordat de monsters drie keer gedurende één minuut per keer worden gewassen met PTW. Incubeer vervolgens de secundaire antilichamen gedurende twee uur bij kamertemperatuur.Was de coupes drie keer. Gebruik een wateroplosbaar, niet-fluorescerend monteermiddel om de coupes te monteren. Analyseer de monsters vervolgens met een lichtmicroscoop of een confocale microscoop.Wanneer correct uitgevoerd, leidt een wond tot een letselkanaal dat zich van dorsaal naar ventraal uitstrekt door het palam van het tale cephalon en dat na 35 dagen zal genezen. Met behulp van immunohistochemie werd eerder aangetoond dat wondvorming een opregulatie van PCNA en S 100 beta triggert, met een overlappend patroon drie tot zeven dagen na het letsel, wat wijst op proliferatie van radiale gliacellen.Deze figuur demonstreert een tijdelijke accumulatie van oligodendrocyten-precursorcellen of OPC's in directe nabijheid van een steekwond die is veroorzaakt in transgene olig two EEG FP-vissen, wat op dag 35 na de letseling niet langer wordt waargenomen. Als de letseling niet correct wordt aangebracht, zal het letselkanaal niet zichtbaar zijn. Een opregulatie van PCNA en S 100 bèta of een accumulatie van OPC's is dan niet detecteerbaar.Zoals hier gepresenteerd, heeft een systemische expressiescreening die transcriptieregulatoren in de hersenen van vissen met laesies vergelijkt met wild-type hersenen, een aantal factoren geïdentificeerd die tot expressie komen in het telencephalon en die zijn opgereguleerd als reactie op letsel. De stapwondmethode kan, bijvoorbeeld in combinatie met RNA deep sequencing en/of in situ hybridisatie, helpen bij het identificeren van nieuwe genen die betrokken zijn bij de volwassen neurogenese, regeneratie en herstel bij zebravis.

stab-wound-injury-zebrafish-adult-telencephalon-method-to-investigate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video beschrijft de techniek van microdissection van de hersenen van een volwassen zebravis. Deze methode helpt bij het verkrijgen van hele hersenen afgeleide neuorospheres die verder kunnen worden bestudeerd.

Zebrafish Brain Disissection: Een techniek van vis neurobiologie

In dit artikel tonen we een werkwijze voor het manipuleren van genexpressie in het ventriculaire cellen van het volwassen zebravissen telencephalon met morfolino antisense oligonucleotiden. Wij stellen deze werkwijze efficiënt en snel protocol dat kan worden gebruikt voor functionele studies in de volwassen gewervelde hersenen.

Micromanipulatie van genexpressie in de Adult zebravis hersenen met behulp Cerebroventricular Micro-injectie van Morfolino Oligonucleotides

Hoewel het perifere zenuwstelsel (PNS) in staat is om significant herstel na een blessure, is weinig bekend over de cellulaire en moleculaire mechanismen die dit fenomeen regeren. Met behulp van levende, transgene zebravis en een reproduceerbare zenuw doorsnijding test, kunnen we dynamische gliacel gedrag te bestuderen tijdens zenuw degeneratie en regeneratie.

Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis

Na spinale doorsnijding, volwassen zebravissen hebben functioneel herstel van zes weken na het letsel. Om te profiteren van larvale transparantie en sneller herstel nemen, presenteren we een methode voor het doorsnijden van de larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, zien we zintuiglijke herstel vanaf 2 dagen na het letsel, en C-bocht beweging door 3 dagen na het letsel.

Spinal Cord doorsnijding in het larvale zebravis

Dit protocol beschrijft de synthese, karakterisering en injectie van monomeer amyloid-β42 peptiden voor het genereren van amyloïde toxiciteit in volwassen zebrafish om een model van de ziekte van Alzheimer, gevolgd door histologische analyses en detectie van samenvoegingen.

Modelleren van Amyloid-β42 toxiciteit en neurodegeneratie in volwassen Zebrafish hersenen

Hier is een elektroporation methode voor plasmide DNA levering en ependymoglial cellabeling in de volwassen zebravis telencephalon. Dit protocol is een snelle en efficiënte methode om individuele ependymoglial cellen te visualiseren en te traceren en opent nieuwe mogelijkheden om elektroporation toe te passen op een breed scala aan genetische manipulaties.

Elektroporation methode voor in vivo levering van plasmide DNA in de volwassen zebravis Telencephalon

Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

We hebben het Marmarou-gewichtsverliesmodel voor volwassen zebravissen aangepast om een breed scala aan pathologieën te onderzoeken na traumatisch hersenletsel met stompe kracht (TBI) en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de daaropvolgende neuronale regeneratie. Dit Botte kracht TBI-model is schaalbaar, induceert een milde, matige of ernstige TBI en vat heterogeniteit van letsel samen die wordt waargenomen bij menselijke TBI.

Een schaalbaar model om de effecten van blunt-force letsel bij volwassen zebravissen te bestuderen

Een mechanisch hersenletselmodel bij de volwassen zebravis wordt beschreven om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die hun hoge regeneratieve capaciteit reguleren. De methode legt uit om een steekwondletsel te creëren in het optische tectum van meerdere soorten kleine vissen om de regeneratieve reacties te evalueren met behulp van fluorescerende immunostaining.

Steekwondletselmodel van het volwassen optische tectum met behulp van zebravissen en medaka voor de vergelijkende analyse van regeneratieve capaciteit

Volwassen zebravis is in staat tot functioneel herstel na een dwarslaesie en is een vooraanstaand modelsysteem om aangeboren mechanismen van neurale regeneratie op te helderen. Hier beschrijven we zwemuithoudingsvermogen en zwemgedragstests als functionele uitlezingen van regeneratie van het ruggenmerg.

Beoordeling van zwemuithoudingsvermogen en zwemgedrag bij volwassen zebravissen

Het huidige protocol beschrijft een methode om weefselspecifieke en zeer reproduceerbare verwondingen bij zebravislarven te induceren met behulp van een laserlaesiesysteem in combinatie met een geautomatiseerd microfluïdisch platform voor het hanteren van larven.

Gecontroleerde semi-geautomatiseerde lasergeïnduceerde verwondingen voor het bestuderen van spinale regeneratie bij zebravislarven

Leer een steekwondprotocol voor het volwassen zebravis-telencephalon om neurogenese en regeneratie van het centrale zenuwstelsel te bestuderen. Deze methode maakt efficiënt onderzoek naar hersenherstel mogelijk.

Steekwond Letsel van de zebravis Adult Telencephalon: Een methode om Onderzoek gewervelde Brain Neurogenese and Regeneration

Meer video's verkennen