Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software
December 16th, 2014
Gepresenteerd is een flexibele informatica workflow waardoor multiplex-image-based analyse van fluorescent gelabelde cellen. De workflow kwantificeert nucleaire en cytoplasmatische markers en berekent marker translocatie tussen deze compartimenten. Procedures zijn voorzien verstoring van cellen met siRNA en betrouwbare methode voor het merkerdetectie door indirecte immunofluorescentie in 96-well formaat.
Het algemene doel van deze procedure is om de reacties van individuele cellen objectief te meten door specifieke fluorescente markerintensiteiten van microscoopbeelden te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een adherent weefselkweekcel te onderwerpen aan irna-gemedieerde genknockdown. In de tweede stap worden de cellen fluorescent gekleurd en vervolgens geïmaged voor verschillende markers van belang.
In de laatste stap wordt de expressie van de markers binnen specifieke subcellulaire gebieden algoritmisch gedefinieerd, zijn individuele cellen. Uiteindelijk kunnen de cellulaire reacties op biologische signalen van genknockdown worden geanalyseerd door de fluorescente expressieniveaus van de markers van belang en hun subcellulaire Translocatie te meten. Hoewel deze procedure inzicht biedt in de regulatie van G één celcyclustransitie als reactie op siRNA's.
Het kan ook worden toegepast op studies die fluorescente celbeelden genereren, nucleaire transport en eiwithomeostase bestuderen. Het demonstreren van de procedure zal Daniel Wek en Car K HO fellow postdocs uit mijn laboratorium zijn Begin met het dispenseren van 70 microliter van 200 nanomolair irna, verdund in een irna buffer, in de juiste putjes van een steriele 96-well plate in een steriele weefselkweekhood. Voeg vervolgens 105 microliter van transfectielipoïd verdund in 40 volumes serumvrij DMEM medium toe aan elke put van een sir a meng de plaat door zachte vibratie bij kamertemperatuur, en verdeel na 10 minuten de resulterende 175 microliter in drie 50 microliter replica's per doelwit in een ondoorzichtige weefselkweek behandelde 96-well plaat met een transparante bodem.
Spuit vervolgens 8.000 cellen per put in 150 microliter DMEM met 10%serum direct op de 50 microliter lipid irna complexen zonder te mengen. Verzegeld de plaat vervolgens met een steriele ademende membraan en plaats de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. 48 uur later aspireer het medium van de platen.
Fixeer vervolgens de cellen in 100 microliter van 4% buffer formaldehyde in een afzuigkap bij kamertemperatuur Na 10 minuten aspireer het fixeermiddel en voer drie 100 microliter wasbeurten uit met PBS na de laatste wasbeurt. Verwijder de PBS en perforeer de cellen met drie cycli van 100 microliter permeabilisatie oplossing incubaties van 10 minuten elk bij kamertemperatuur zonder te schudden. Na de laatste incubatie, verwijder de permeabilisatie oplossing en voeg vervolgens 100 microliter van de blokoplossing per put toe gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Aspireer vervolgens de blokoplossing en probeer de cellen met 50 microliter van de primaire antilichaam van belang binnen twee weken na het labelen uc confocale microscoop met een 20 x objectief om afzonderlijke 16 bit grijstinten TIFF-beelden in drie kanalen te nemen die overeenkomen met de DNA kleurstof GFP en immunokleuring. Flora vieren vangen veel niet-overlappende beeldsets of frames om ongeveer 1000 tot 2000 cellen per put te beeld. Noem het beeldbestand systematisch met de metadata-informatie zodat elke bestandsnaam een unieke combinatie is van experimentnaam, putadres, framenummer en kanaalidentificator.
Open vervolgens de cell profiler software en klik op bestand en importeer pijplijn. Selecteer vervolgens onder van bestand het bestand drie kanalen pijplijn CP pipe file, die de nodige instructies bevat voor de software om de metadata van het beeldbestand te interpreteren uit de opgeslagen bestandsnaam. Cell Profiler kan nu worden gebruikt om de afbeeldingen te relateren, de nucleaire DNA en antilichaam intensiteiten uit de bestanden te extraheren en het GFP-kanaal te gebruiken om de verhouding van de nucleaire versus cytoplasma intensiteit te berekenen. Voor elke gedetecteerde cel, klik op de knop weergave uitvoerinstellingen en klik vervolgens op de standaard invoer en standaard uitvoer mappen.
Selecteer de locatie van de beeldbestanden voor analyse en de bestemming voor de geëxtraheerde gegevens respectievelijk. Klik vervolgens in het analysemodulesvenster op de juiste oogpictogrammen om de primaire objecten en tertiaire objecten te observeren en identificeren tijdens de analyse en klik op analyseer afbeeldingen wanneer de analyse is voltooid. Klik op oké in het berichtvenster en ga naar de standaard uitvoer map Locatie waar alle gegevensbestanden worden opgeslagen als door komma's gescheiden waarden.
Om de gegevensextractie uit te voeren, vind het nieuwe nucleï CSV-bestand dat is opgenomen onder de output van cell profiler, dat de individuele celgegevens bevat voor de fluorescente nucleaire antilichaamintendintensiteit, nucleaire DNA-intensiteit en GFP CDK twee reporter verhoudingswaarden. Kopieer het opgegeven pulse script bestand naar gait classifier PL in dezelfde map als het nucleï CSV-gegevensbestand. Dubbelklik vervolgens op het pictogram voor Pearl Script.
En wanneer gevraagd, typ de volledige naam van het gegevensbestand gevolgd door een DOT CSV-bestandsnaam voor het bestand waarin de cellen moeten worden gesorteerd en de poortwaarden voor de antilichaamfluorescentie en G FP CDK twee reporter gegevens. Bevestig dat het nieuw gemaakte bestand de ruwe individuele celassaywaarden van de originele celprofielgegevens combineert met de subpopulatielabels die laten zien hoe elke cel van elke put presteert ten opzichte van beide poorten. Open nu de R Studio software om de gegevens voor elke experimentele conditie te plotten met behulp van de individuele celasubpopulatielabels door op bestand en open bestand te klikken en vervolgens het opgegeven analyse dot r-bestand te selecteren.
Typ het computeradres van de map met de gesorteerd gegevens, inclusief de stationsletter en de naam van het bestand zelf. Markeer vervolgens regels een tot en met 17 in het bovenste linkervenster van onze studio, en klik op de knop uitvoeren om de experimentele gegevensdrempelwaarden en putlocatiedetails in te voeren. Markeer ten slotte de individuele blokken van de resterende code onder lijn 17 en klik op de knop uitvoeren om de bijbehorende grafieken te maken.
Bekijk de grafieken in het venster in de rechterbenedenhoek van onze studio, en klik vervolgens op de knop exporteren om deze op te slaan in verschillende formaten. De hier beschreven workflow analyseert de fluorescente microscoopbeelden om ruwe gegevens te produceren in de vorm van een lijst die elke geïdentificeerde cel en de bijbehorende
Overzicht
Dit artikel presenteert een flexibele informatica-workflow voor multiplexed beeldgebaseerde analyse van fluorescent gelabelde cellen. De workflow kwantificeert nucleaire en cytoplasmatische markers, waardoor de berekening van markertranslocatie tussen deze compartimenten mogelijk wordt.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Het begrijpen van cellulaire reacties op gen-knockdown is cruciaal voor het bestuderen van verschillende biologische processen.
- Fluorescente markers zijn essentieel voor het visualiseren en kwantificeren van cellulaire componenten.
- Beeldgebaseerde analyse biedt een krachtig hulpmiddel voor het beoordelen van cellulair gedrag.
- Betrouwbare methodologieën voor markerdetectie zijn nodig voor nauwkeurige resultaten.
Doel van het onderzoek
- Om individuele celreacties op biologische signalen objectief te meten.
- Om specifieke fluorescente markerintensiteiten uit microscoopbeelden te kwantificeren.
- Om de translocatie van markers tussen nucleaire en cytoplasmatische compartimenten te analyseren.
Gebruikte methoden
- siRNA-gemedieerde gen-knockdown van adherente weefselcultuurcellen.
- Fluorescente kleuring van cellen gevolgd door beeldvorming voor meerdere markers.
- Algorithmische definitie van markerexpressie binnen subcellulaire regio's.
- Gegevensextractie en analyse met behulp van Cell Profiler en R Studio.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van nucleaire en cytoplasmatische markerintensiteiten.
- Analyse van cellulaire reacties op gen-knockdown door middel van fluorescente expressieniveaus.
- Identificatie van subcellulaire translocatiepatronen van markers.
- Generatie van gedetailleerde gegevensbestanden voor individuele celassaywaarden.
Conclusies
- De workflow maakt een uitgebreide analyse van fluorescent gelabelde cellen mogelijk.
- Het biedt inzichten in cellulaire reacties en regulerende mechanismen.
- Deze methodologie kan worden toegepast op verschillende studies die fluorescente beeldvorming en cellulaire analyse omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This workflow enables biopharma R&D teams to extract quantitative, single-cell fluorescence data from standard microscope images, supporting mechanistic de-risking in target validation. By quantifying marker translocation and subcellular localization at single-cell resolution, it enhances predictive confidence in early discovery and reduces reliance on population-averaged assays that mask heterogeneous responses. The open-source nature of the pipeline lowers barriers to adoption, promoting reproducibility and cross-functional data sharing across discovery biology and assay development teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking siRNA-mediated gene knockdown to quantitative changes in nuclear/cytoplasmic marker ratios.
- Operational Value: Provides single-cell resolution data that clarifies pathway activity and functional target engagement beyond bulk measurements.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying subpopulation-specific responses that may indicate differential compound sensitivity or resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative single-cell outputs compatible with high-content screening formats and plate-based perturbation studies.
- Reproducibility: Uses algorithmic segmentation and gating via Cell Profiler to minimize user bias and ensure consistent feature extraction across laboratories.
- Scalability: Processes thousands of cells per well, enabling robust statistical analysis of heterogeneous responses in large-scale siRNA or compound screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links phenotypic screening readouts to mechanistic biomarkers by correlating marker translocation with functional outcomes like cell cycle progression.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from on-target pathway modulation versus off-target effects through subcellular resolution of signaling dynamics.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions by quantifying the penetrance and uniformity of cellular responses across treatment conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative imaging-based phenotyping that informs hit selection and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic perturbations alter biomarker localization and intensity in defined subcellular compartments.
- Screening: Delivers assay-ready, normalized single-cell data suitable for Z'-factor calculation and hit confirmation in multiplexed fluorescence assays.
- Analytics: Enables statistical comparison of subpopulation distributions using gated outputs from Cell Profiler and R-based visualization, facilitating condition-to-condition comparisons.
- Translational Research: Connects imaging phenotypes to downstream validation by preserving single-cell resolution data that can be correlated with orthogonal assays like flow cytometry or Western blot.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable informatics pipeline for multiplexed image analysis that can be adapted across disease models and marker panels without revalidation of core algorithms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by revealing heterogeneous responses and translocation dynamics masked in population averages.
- Operational Value: Promotes standardization through open-source tools (Cell Profiler, R) and defined file-naming conventions that reduce variability across sites.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling high-content-like analysis on universal fluorescence microscopes, reducing dependency on specialized, high-cost instrumentation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying the consistency and depth of target engagement across genetic or chemical perturbations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, image-based assay design, and basic scripting for pipeline execution in Cell Profiler and R Studio.
- Depends on access to fluorescence-capable microscopes and storage infrastructure for managing large TIFF image datasets generated during screening campaigns.
- Necessitates cross-team agreement on image naming conventions, segmentation parameters, and gating thresholds to ensure data comparability across experiments and users.
- Involves adaptation considerations when applying the workflow to new cell types, marker combinations, or subcellular regions of interest, requiring validation of identification and classification modules.
- Practical limitations include reliance on adequate signal-to-noise ratio in fluorescence channels and the need for optimization of illumination and exposure settings to prevent saturation or bleed-through.
