Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software

Het algemene doel van deze procedure is om de reacties van individuele cellen objectief te meten door specifieke fluorescente markerintensiteiten van microscoopbeelden te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een adherent weefselkweekcel te onderwerpen aan irna-gemedieerde genknockdown. In de tweede stap worden de cellen fluorescent gekleurd en vervolgens geïmaged voor verschillende markers van belang.

In de laatste stap wordt de expressie van de markers binnen specifieke subcellulaire gebieden algoritmisch gedefinieerd, zijn individuele cellen. Uiteindelijk kunnen de cellulaire reacties op biologische signalen van genknockdown worden geanalyseerd door de fluorescente expressieniveaus van de markers van belang en hun subcellulaire Translocatie te meten. Hoewel deze procedure inzicht biedt in de regulatie van G één celcyclustransitie als reactie op siRNA's.

Het kan ook worden toegepast op studies die fluorescente celbeelden genereren, nucleaire transport en eiwithomeostase bestuderen. Het demonstreren van de procedure zal Daniel Wek en Car K HO fellow postdocs uit mijn laboratorium zijn Begin met het dispenseren van 70 microliter van 200 nanomolair irna, verdund in een irna buffer, in de juiste putjes van een steriele 96-well plate in een steriele weefselkweekhood. Voeg vervolgens 105 microliter van transfectielipoïd verdund in 40 volumes serumvrij DMEM medium toe aan elke put van een sir a meng de plaat door zachte vibratie bij kamertemperatuur, en verdeel na 10 minuten de resulterende 175 microliter in drie 50 microliter replica's per doelwit in een ondoorzichtige weefselkweek behandelde 96-well plaat met een transparante bodem.

Spuit vervolgens 8.000 cellen per put in 150 microliter DMEM met 10%serum direct op de 50 microliter lipid irna complexen zonder te mengen. Verzegeld de plaat vervolgens met een steriele ademende membraan en plaats de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. 48 uur later aspireer het medium van de platen.

Fixeer vervolgens de cellen in 100 microliter van 4% buffer formaldehyde in een afzuigkap bij kamertemperatuur Na 10 minuten aspireer het fixeermiddel en voer drie 100 microliter wasbeurten uit met PBS na de laatste wasbeurt. Verwijder de PBS en perforeer de cellen met drie cycli van 100 microliter permeabilisatie oplossing incubaties van 10 minuten elk bij kamertemperatuur zonder te schudden. Na de laatste incubatie, verwijder de permeabilisatie oplossing en voeg vervolgens 100 microliter van de blokoplossing per put toe gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Aspireer vervolgens de blokoplossing en probeer de cellen met 50 microliter van de primaire antilichaam van belang binnen twee weken na het labelen uc confocale microscoop met een 20 x objectief om afzonderlijke 16 bit grijstinten TIFF-beelden in drie kanalen te nemen die overeenkomen met de DNA kleurstof GFP en immunokleuring. Flora vieren vangen veel niet-overlappende beeldsets of frames om ongeveer 1000 tot 2000 cellen per put te beeld. Noem het beeldbestand systematisch met de metadata-informatie zodat elke bestandsnaam een unieke combinatie is van experimentnaam, putadres, framenummer en kanaalidentificator.

Open vervolgens de cell profiler software en klik op bestand en importeer pijplijn. Selecteer vervolgens onder van bestand het bestand drie kanalen pijplijn CP pipe file, die de nodige instructies bevat voor de software om de metadata van het beeldbestand te interpreteren uit de opgeslagen bestandsnaam. Cell Profiler kan nu worden gebruikt om de afbeeldingen te relateren, de nucleaire DNA en antilichaam intensiteiten uit de bestanden te extraheren en het GFP-kanaal te gebruiken om de verhouding van de nucleaire versus cytoplasma intensiteit te berekenen. Voor elke gedetecteerde cel, klik op de knop weergave uitvoerinstellingen en klik vervolgens op de standaard invoer en standaard uitvoer mappen.

Selecteer de locatie van de beeldbestanden voor analyse en de bestemming voor de geëxtraheerde gegevens respectievelijk. Klik vervolgens in het analysemodulesvenster op de juiste oogpictogrammen om de primaire objecten en tertiaire objecten te observeren en identificeren tijdens de analyse en klik op analyseer afbeeldingen wanneer de analyse is voltooid. Klik op oké in het berichtvenster en ga naar de standaard uitvoer map Locatie waar alle gegevensbestanden worden opgeslagen als door komma's gescheiden waarden.

Om de gegevensextractie uit te voeren, vind het nieuwe nucleï CSV-bestand dat is opgenomen onder de output van cell profiler, dat de individuele celgegevens bevat voor de fluorescente nucleaire antilichaamintendintensiteit, nucleaire DNA-intensiteit en GFP CDK twee reporter verhoudingswaarden. Kopieer het opgegeven pulse script bestand naar gait classifier PL in dezelfde map als het nucleï CSV-gegevensbestand. Dubbelklik vervolgens op het pictogram voor Pearl Script.

En wanneer gevraagd, typ de volledige naam van het gegevensbestand gevolgd door een DOT CSV-bestandsnaam voor het bestand waarin de cellen moeten worden gesorteerd en de poortwaarden voor de antilichaamfluorescentie en G FP CDK twee reporter gegevens. Bevestig dat het nieuw gemaakte bestand de ruwe individuele celassaywaarden van de originele celprofielgegevens combineert met de subpopulatielabels die laten zien hoe elke cel van elke put presteert ten opzichte van beide poorten. Open nu de R Studio software om de gegevens voor elke experimentele conditie te plotten met behulp van de individuele celasubpopulatielabels door op bestand en open bestand te klikken en vervolgens het opgegeven analyse dot r-bestand te selecteren.

Typ het computeradres van de map met de gesorteerd gegevens, inclusief de stationsletter en de naam van het bestand zelf. Markeer vervolgens regels een tot en met 17 in het bovenste linkervenster van onze studio, en klik op de knop uitvoeren om de experimentele gegevensdrempelwaarden en putlocatiedetails in te voeren. Markeer ten slotte de individuele blokken van de resterende code onder lijn 17 en klik op de knop uitvoeren om de bijbehorende grafieken te maken.

Bekijk de grafieken in het venster in de rechterbenedenhoek van onze studio, en klik vervolgens op de knop exporteren om deze op te slaan in verschillende formaten. De hier beschreven workflow analyseert de fluorescente microscoopbeelden om ruwe gegevens te produceren in de vorm van een lijst die elke geïdentificeerde cel en de bijbehorende