Name: Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer een informatica-workflow voor kwantificering van fluorescente merkers in individuele cellen met behulp van Cell Profiler en R Studio. Deze methode analyseert subcellulaire translocatie en genexpressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies CRUK 15.043 en CRUK 14.251. Wij danken Daniel Wetterskog en Ka Kei Ho voor technische bijstand en kritisch lezen van het manuscript.

1. Experimentele Perturbation en Cell Labeling voor Response Markers (Reverse Transfection siRNA Screen) <ol><li> In een steriele weefselkweek kap pipet 70 ul van 200 nM siRNA in 1x siRNA buffer in putjes van een steriele, gewoon 96 well plaat. Verdun transfectie lipide in 40 volumes serumvrij DMEM medium en breng 105 pl in elk putje met siRNA. OPMERKING: Verdunnen 262,5 pl lipide in 10,5 ml serumvrij DMEM levert een master mix geschikt om hele plaat met 96 putjes van siRNA, leveren 2.6 pl lipide per putje. Het gebruik van 200 nM siRNA beginconcentratie in deze stap een werkende concentratie van 20 nM leveren in stap 1.3, maar procedures zal voor werken concentraties tot 5 nM, met de beginconcentratie dienovereenkomstig aangepast (50 nM). Lagere werkende concentratie kan off-target vals positieve scores te verminderen, hoewel ze de omvang van on-target respons kan verminderen, wat leidt tot verhoging van de on-Target fout-negatieve uitslagen. </li><li> Meng de plaat met zachte trillingen gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Splitsen het resulterende 175 ul in drie replicaten per 50 ul doel op een ondoorzichtige, weefselkweek behandeld, 96-wells plaat met een transparante basis. </li><li> Reverse transfecteren door intrekking 8000 cellen per putje in 150 ul DMEM bevattende 10% serum direct op de 50 pl lipide-siRNA complexen. Gebruik HCT116 humane colorectale cellen stabiel tot expressie van een GFP-gelabelde marker rapportage CDK2 activiteit 5,8. Geen verdere menging nodig. Sluit de plaat met een steriele, zelfklevende ademend membraan vochtregeling en plaat &quot;edge-effecten te voorkomen&quot; en plaats de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur. </li><li> Zuig het medium zodanig dat een kleine resthoeveelheid media blijft de putjes. Fixeer de cellen door toevoeging van 100 pl 4% gebufferde formaldehyde aan elk putje en incubeer in een zuurkast gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur temperature. </li><li> Verwijder de fixeeroplossing door opzuigen van de plaat. Op dit moment de stoppen de proef door wassen van de plaat driemaal met 100 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar afgedicht onder 100 ul PBS in het donker bij 4 ° C gedurende maximaal een week, of doorgaan met de permeabilisatie van de cellen. OPMERKING: We raden verwerking platen zo spoedig mogelijk na fixatie, en algemeen de voorkeur opslag van volledig verwerkt platen. Biociden conserveermiddelen zoals thimerosal, natriumazide of commerciële alternatieven worden toegevoegd micoroganismal groei te voorkomen. Toevoeging van fosfataseremmers helpt fosfo-epitopen behouden, en andere middelen voor eiwitmodificatie toestanden behouden kan bruikbaar relevante assay contexten </li><li> Verwijder PBS uit de plaat en permeabiliseren de cellen door toevoeging van 100 ul permeabilisatie oplossing. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder schudden. Zuig het permeabilisatie oplossing met behulp van een multikan.Annel pipet. Herhaal deze stap drie keer. </li><li> Blokkeer de cellen door toevoeging van 100 pi blokkeren oplossing per putje gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het blok oplossing opzuigen de plaat vervolgens sonde met 50 pl anti P-S780 RB1 antilichaam verdund 500-voudig in het blok oplossing 2 uur in het donker bij kamertemperatuur. </li><li> Was de plaat drie keer met 100 ul plaat wassen oplossing, waardoor de oplossing op de plaat gedurende 5 minuten per keer. Probe de plaat overnacht in het donker bij 4 ° C met 50 ul fluorescent gelabelde secundaire antilichaam 1000-voudig verdund in blok-oplossing aangevuld met 2 uM van de chromatine-specifieke DNA kleurstof bisbenzimide. Was de plaat driemaal vóór en opslag verzegeld onder 100 ul PBS in het donker bij 4 ° C. De plaat binnen twee weken. </li></ol> 2. Imaging and Image Segmentatie <ol><li> Gebruik een confocale of spinning-disk fluorescentie microscoop met een 20X objectief apart te nemen 16bit, grijswaarden TIFF-afbeeldingen in drie kanalen die overeenkomt met het DNA-kleurstof, GFP en immuno-kleuring fluoroforen. Leg vele niet-overlappende beeldreeksen, hier aangeduid als frames, naar afbeelding ongeveer 1000-2000 cellen per putje. </li><li> Noem de beeldbestanden systematisch zodat elke bestandsnaam is een unieke combinatie van &#39;experiment naam&#39;, &#39;goed adres&#39;, &#39;framenummer&#39; en &#39;channel identifier&#39;, in deze volgorde (figuur 3). De set voorbeeld data maakt gebruik van &quot;Blue&quot; (chromatine DNA vlekken) of &quot;Groen&quot; (GFP) of &quot;Red&quot; (de immuno-gekleurd fluorofor) als kanaal identificatiemiddelen. De goed adres, framenummer en kanaalidentificeermerk worden verder aangeduid als de metadata. Gebruik de underscore symbool om verwarrende goed en het frame metadata te voorkomen. </li><li> Geef de bestanden met deze metadata elementen in de aangegeven volgorde. Dit is nodig om ervoor te zorgen dat de volgende software stappen Correctly groep sets van beelden voor analyse. </li><li> Download en installeer de freeware Cell Profiler, Active Perl Community Edition, R statistische programmeeromgeving en RStudio. Accepteer alle standaard opties tijdens de installatie; PC-gebruikers de installatie van Active Perl moeten alle opties met betrekking tot PATH, bestandsextensie vereniging en script in kaart brengen waar gevraagd in te schakelen. Actieve Perl is optioneel voor Mac-gebruikers, maar zij anders zal nodig hebben om de Perl-script draaien in stap 3.2 van de Terminal command line in plaats van het pictogram te klikken. </li><li> Open de Cell Profiler-software, klikt u op &#39;Bestand&#39;, &#39;Import Pipeline&#39; dan &#39;Uit bestand &quot;en selecteer het bestand 3_channels_pipeline.cppipe (Cijfers S1A &amp; S1B). Het bestand bevat instructies die noodzakelijk zijn voor de software om image-bestand metagegevens interpreteren vanuit de bestandsnaam conventie beschreven. Cell Profiler betreft nu de beelden, uittreksels nucleair DNA en antilichamen intensiteiten van these en gebruikt de GFP kanaal om de verhouding van nucleaire versus cytoplasma intensiteit te berekenen voor elke cel gedetecteerd (figuren 4 en 5). </li><li> Klik op de knop &#39;Bekijk output-instellingen&#39; in de linkerbenedenhoek van de Cell Profiler venster. Aan de bovenkant van het nieuwe scherm zijn tekstvakken label &#39;Default Input Folder&#39; en &#39;Standaard Output Folder&#39;. Een tegelijk, op de map-iconen aan de rechterkant van deze dozen en selecteer de locatie van de beeldbestanden voor analyse en de bestemming voor de opgehaalde gegevens, respectievelijk (Figuur S1C). </li><li> Begin de beeldanalyse door op de knop &#39;Analyze Images&#39; in de linkerbenedenhoek van Cell Profiler. Aan de onderkant van het scherm te houden aan de resterende tijd voor de extractie van gegevens, het &#39;Stop Analysis&#39; en &#39;Pause&#39; toetsen. Indien nodig pauze de analyse door het selecteren van de &#39;Pause&#39; knop op elk gewenst moment, wat handig isbij het bekijken van de beelden die worden geanalyseerd (beschreven in stap 2.8). </li><li> Eventueel, de ramen open voor een van de stappen beeldanalyse door te klikken op het oog-pictogrammen in het paneel op de uiterst links van het programmavenster (Figuur S1D). Observeer het venster &#39;IdentifyPrimaryObjects&#39; en die voor &#39;Secundair&#39; en &#39;Tertiaire Objects&#39; om te controleren of de huidige instellingen in Cell Profiler om te presteren beeldsegmentatie zijn geschikt (zie figuur 1 en discussie voor advies over het wijzigen van deze instellingen). </li><li> Klik op &#39;OK&#39; in het bericht dat wordt weergegeven wanneer de analyse is voltooid. Ga naar de locatie &#39;Standaard Output Folder&#39; waar alle data bestanden met de resultaten worden opgeslagen als komma-gescheiden-waarde (.csv) (Figuur S2A). </li></ol> 3. Gegevens Extraction <ol><li> Vind het nieuwe bestand &#39;Nuclei.csv&#39;, die is opgenomen onder deoutput van Cell Profiler. Dit bestand bevat individuele cellen voor tl-nucleaire antilichamen intensiteit, nucleair DNA intensiteit en GFP-CDK2 reporter ratiowaarden (figuren 6A &amp; S2A). OPMERKING: Verschillende laboratoria willen dergelijke gegevens verwerken aard van hun assays passen. Voorgesteld voor de huidige gegevens is het gating van de cellen van elke behandeling conditie volgens het antilichaam gegevens en het GFP-CDK2 reporter waarden met behulp van de meegeleverde Perl-script &#39;2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Kopieer de voorwaarde Perl-script bestand &#39;2_gate_classifier.pl&#39; in dezelfde map als de &#39;Nuclei.csv&#39; databestand (figuur S2A). Dubbelklik op het pictogram voor de Perl-script en, als daarom wordt gevraagd, typt u de volledige naam van het gegevensbestand, gevolgd door een &#39;.csv&#39; filename naam voor het bestand waarin de cellen moeten worden afgesloten en uiteindelijk de poort waarden voor het antilichaamfluorescentie en GFP-CDK2 reporter gegevens. OPMERKING: Hoe voornamelijk bepalen poort instellingen en deze toe te passen voor de analyse van de gegevens worden hieronder in de sectie representatieve gegevens en figuur 6 besproken (om de verstrekte gegevens gebruik &#39;0.004&#39; en &#39;1.5&#39;, respectievelijk te analyseren). Mac-gebruikers moeten het Perl-script van de Terminal commandoregel te typen draaien: &#39;perl 2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Let op de nieuw aangemaakte bestand waar de rauwe individuele cel assaywaarden combineert uit de oorspronkelijke Cell Profiler gegevens met sub-populatie labels die laten zien hoe elke cel van elk goed presteert tegen beide poorten (figuur 6C). </li><li> Plot de gegevens voor elke experimentele conditie met behulp van de individuele cel subpopulatie labels door het openen van de RStudio software. Klik op &#39;Bestand&#39; en &#39;Open File&#39; en selecteer vervolgens de voorwaarde &#39;analysis.r&#39; bestand. Let op de commando&#39;s van de figuren 6B plotten, <strong&gt; 7 en 8 in de linker venster van RStudio (figuur S2B). In het venster linksboven, tussen de dubbele aanhalingstekens symbolen op de lijnen 5 en 6, typt u de computer het adres van de map met de gated gegevens. Onder meer de stationsletter en de naam van het bestand zelf, respectievelijk (bijvoorbeeld &quot;C: / analyse map / analyse output&quot; en &quot;nuclei_gated.csv&quot;). OPMERKING: Als RStudio wordt gebruikt voor de eerste keer op een bepaalde computer, zal de R grafische pakket &#39;ggplot2&#39; moeten eerst worden geïnstalleerd. Dit is een eenmalige stap voor een nieuwe installatie van RStudio, waarna deze stap overbodig. Om &#39;ggplot2&#39; te installeren, klik op het tabblad genaamd &#39;Pakketten&#39; boven het venster in de rechter benedenhoek van RStudio, klikt u op de knop &#39;Install Packages&#39; die onder deze verschijnt. Een nieuw venster verschijnt. Type &#39;ggplot2&#39; (het weglaten van citaten) in de &#39;pakketten&#39; stempo in dit nieuwe venster en tenslotte klikt u op de knop &#39;Installeren&#39; om het venster te sluiten, installeert u de benodigde ggplot2 functies en terug te keren naar de belangrijkste RStudio venster om verder met stap 3.6. </li><li> Hoogtepuntlijnen 1 tot en met 17 in de linker raam van RStudio, klik op de knop &#39;Uitvoeren&#39;. Dit zal de experimentele gegevens, drempelwaarden en goed locatie gegevens in te voeren in R (figuur S2C). R zal nu tijdelijk de relevante gegevens te houden voor het plotten. </li><li> Markeer individuele blokken van de rest van de code onder lijn 17 en maak de bijbehorende percelen met maar voordat u op de &#39;Run&#39; te klikken. Let op de percelen in het venster in de rechterbenedenhoek van RStudio en aantal formaten opslaan door op de knop Exporteren (Figuur S2D). </li><li> Bij het sluiten RStudio, klik op &#39;Do not Save&#39; als daarom wordt gevraagd. Dit voorkomt verwarring over het volgende gebruik van RStudio die anders gegevens houdenvan de vorige sessie. </li></ol>

<ol><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), 100(2006).</li>
<li>Khan, A., Eldaly, H., Rajpoot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-gaussian+mixture+model+for+detection+of+mitotic+cells+in+breast+cancer+histopathology+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Inform%22%5BJournal%5D)">A gamma-gaussian mixture model for detection of mitotic cells in breast cancer histopathology images.</a> J Pathol Inform. 4, 11(2013).</li>
<li>Selzer, P., Beibel, M., Gubler, H., Parker, C. N., Gabriel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multivariate+data+analysis+strategies+for+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Comparison of multivariate data analysis strategies for high-content screening.</a> J Biomol Screen. 16 (3), 338-347 (2011).</li>
<li>Lyman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content%2C+high-throughput+analysis+of+cell+cycle+perturbations+induced+by+the+HSP90+inhibitor+XL888%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High content, high-throughput analysis of cell cycle perturbations induced by the HSP90 inhibitor XL888.</a> PLoS One. 6 (3), e17692(2011).</li>
<li>Richardson, E., Stockwell, S. R., Li, H., Aherne, W., Cuomo, M. E., Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+screen+establishes+signalling+framework+for+DNA+damage-associated+G1+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based screen establishes signalling framework for DNA damage-associated G1 checkpoint response.</a> PLoS One. 7 (2), e17692(2012).</li>
<li>Heynen-Genel, S., Pache, L., Chanda, S. K., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+and+high-content+screening+for+target+discovery+and+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Functional genomic and high-content screening for target discovery and deconvolution.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (10), 955-968 (2012).</li>
<li>Krausz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+siRNA+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">High-content siRNA screening.</a> Mol Biosyst. 3 (4), 232-240 (2007).</li>
<li>Gu, J., Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle-dependent+Regulation+of+a+Human+DNA+Helicase+That+Localizes+in%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Damage+Foci.+Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle-dependent Regulation of a Human DNA Helicase That Localizes in.</a> DNA Damage Foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).</li>
<li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pRB+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of pRB phosphorylation.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (1), 21-27 (1998).</li>
<li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein--from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein--from bench to bedside.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 97-107 (2005).</li>
<li>Nybo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+imaging+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">GFP imaging in fixed cells.</a> BioTechniques. 52 (6), 359-360 (2012).</li>
<li>Schwartz, R. L., Foy, B. D., Phoenix, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchwartz%2C+RL+%22Learning+Perl+-+Making+Easy+Things+Easy+and+Hard+Things+Possible%22">Learning Perl - Making Easy Things Easy and Hard Things Possible</a>. , 6th ed, O'Reilly Media. 1-363 (2011).</li>
<li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22ggplot2%3A+Elegant+Graphics+for+Data+Analysis%22">ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis</a>. , Springer. New York. 978-970 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

De beschreven workflow vormt een procedure voor multiwell perturbance cellen met siRNA daaropvolgende merkerdetectie en uiteindelijk gebruik van een reeks softwarematig ondersteunde stappen extractie van kwantitatieve gegevens van de resulterende fluorescentie microscopie beelden vergemakkelijken. De aanpak is gericht op de levering van nucleaire en cytoplasmatische intensiteit waarden voor individuele cellen, die een brede praktische toepassing in veel cellen gebaseerde toepassingen heeft. Het voorbeeld van gegevens die hier gebruikt werd gegenereerd in een siRNA scherm setting waarin twee tl-assays voor G1-fase van de celcyclus transit zijn getest en weer terug naar een meer directe biofysische maatregel van DNA-gehalte nucleaire gecorreleerd. Het gebruik van een fluorescente DNA kleurstof aan het kern-DNA is een essentiële stap in het beeld segmentatieproces omdat hiermee identificatie van afzonderlijke cellen en de resulterende &quot;Kernen mask &#39;dient als uitgangspunt overeenkomstige cytoplasmi identificerenC-gebieden. De GFP-gelabeld CDK2 reporter, die stabiel tot expressie wordt gebracht in de cellen, geeft nog een variabele consistent hoger dan achtergrondsignaal in het cytoplasma waarin dit compartiment kan worden afgebakend. Dezelfde analyse pijpleiding moet voor de analyse van eiwit translocatie gebeurtenissen op andere geschikte fluorescentie gebonden reporters en hun reactie op perturbance zijn. Ook substitueren van de GFP-reporter CDK2 met cytoplasma-specifieke fluorescente kleurstoffen zou het alternatief gebruik van deze algoritme om de afmetingen van het cytoplasma en de relatieve afmetingen van de cellen in het beeld te meten. Een andere overweging bij het ontwerp beeldsegmentatie strategie beschreven is het gebruik van Cell Profiler geïntegreerde intensiteitswaarden voor DNA kwantificatie leveren. Integratie van de intensiteit waarden voor de nucleaire DNA-kleuring gegevens mogelijk te maken voor mogelijke variaties in de kern grootte, en vertegenwoordigt een spannende wedstrijd voor de kwantificering profielen gezienvoor propidiumiodide gebrandschilderde FACS data. Echter, kan geïntegreerde intensiteit geen geschikte middel om eiwitfunctie beoordelen waar de gemiddelde concentratie, geïllustreerd door de gemiddelde intensiteit van de fluorescentie-antigeen, is meer biologisch relevant dan de geïntegreerde totale hoeveelheid eiwit (en bijbehorende fluorescentie) binnen een cel compartiment. Daarom gemiddelde intensiteit waarden werden gebruikt voor de P-S780 RB1 en GFP gegevens. De optie om te veranderen tussen de twee modi (gemiddelde of geïntegreerde) van data evaluatie is te vinden op het paneel &#39;ExportToSpreadsheet&#39; van de Cell Profiler-software. De analyse instellingen in het 3_channels_pipeline.cppipe bestand zijn geoptimaliseerd voor de beelden in de set voorbeeld data. Analyse van nieuwe beelden sets met dit protocol vereist dat de bestandsnamen nemen de naamgeving hierboven beschreven (figuur 3). Ook gevoeligheid waarden voor de helderheid van nucleair DNA kleuring en drempels voor achtergrond pastintensiteiten in de nieuwe beeldreeksen moet worden ingesteld binnen het Cell Profiler instellingen. Gegeven de sleutelrol de DNA kleuring geldt voor de bouw van de verschillende beeldsegmentatie maskers, de toepassing van juiste gevoeligheid voor dit kanaal is essentieel voor een succesvolle analyse nieuwe beeldgegevens met de Cell Profiler software. Het dossier Cell Profiler instellingen (3_channels_pipeline.cppipe) bevat aantekeningen over de meest bruikbare parameters voor de aanpassing van de analyse om nieuwe gegevens. Deze notities zijn in het tekstvak aan de bovenkant van het scherm in de Cell Profiler hoofdvenster en bevatten voor het wijzigen van de gevoeligheid en het aanpassen van het aantal kanalen te analyseren. Zoals aangeklaagd in protocol paragraaf 2.8, de instellingen voor de nieuwe beeldgegevens te testen kan het nodig zijn om het beeld segmentatie tijdens beeldanalyse observeren door te klikken openen het &#39;oog&#39; iconen voor elk van de &#39;Identificeren ... Objects&#39; protocol stappen (Figuur S1D </strong&gt;). Met name visualisatie van de beeldgegevens via &quot;IdentifyPrimaryOjects &#39;tonen als de kernen masker correct geïdentificeerd uit beelden van het DNA kleuring. Op de Cell Profiler-software pagina voor module de &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; is de drempel correctiefactor. Trial and error aanpassing van deze waarde zal de meeste fouten nucleaire erkenning te repareren. De waarden van de balans van de DNA-kanaal tegen de achtergrond intensiteit voor elk beeld. Drempel correctiefactor waarden scharnier rond 1, waar meer dan dit is strenger (goed voor heldere beelden) en minder dan 1 wordt toegeeflijk (geschikt voor afbeeldingen met minder contrast tussen vlekken en achtergrond). De ruwe uitvoer van individuele cel gegevens Cell Profiler kunnen worden geanalyseerd op verschillende manieren aan de behoeften van andere studies passen. Afgebeeld is het gebruik van een Perl-script om gates toepassing op twee van de gemeten parameters per cel om te helpen extraheren biologische trends uit de gegevens eend vergunning kruisverwijzingen van de geïdentificeerde subpopulaties met aanvullende metingen. Hoewel het ook mogelijk om elementen van gating omvatten in het kader van Cell Profiler, de alternatieve route hier gebruikte grotere flexibiliteit en snelheid, vooral als grote datasets moeten worden beoordeeld. De langzaamste etappe in de post-afbeelding overname fasen van het huidige protocol is het verloop van de Cell Profiler-software. Cel profiler hier wordt gerund zonder dat poorten naar een-un gated reeks ruw gegevens die sneller kunnen worden opnieuw geanalyseerd met de volgende Perl-script te produceren en, indien nodig, iteratief met verschillende poort waarden. Niet alle studies zullen van tevoren weten de geschikte poort waarden omdat dit kan variëren met de reagentia op een bepaalde set van gegevens, en mogelijk in de tijd. Het is daarom aan te raden om histogrammen beeltenis van de ruwe data distributie verkregen van Cell Profiler voor positieve controles en mock-verstoorde cellen te genereren om geschikte poort waardevolle identificerenes voor de parameters van belang. De Perl scripts zijn geschreven om een ​​strikt gedefinieerde kolom structuur van de gegevens van de Cel Profiler te accepteren en kan stoppen met werken als een gebruiker het aantal parameters uitgang door Cell Profiler met de instellingen van de &#39;ExportToSpreadsheet&#39; wijzigt. Te helpen uitvoeren wijziging van de instellingen noten worden opgenomen in de Perl-script-bestanden. Om te zien deze te bekijken het script in een teksteditor, bij voorkeur teksteditor voor programmeurs ingesteld op kleurcode Perl-elementen (bijv http://www.activestate.com/komodo-edit). Deze notities geven waar het script aan te passen aan te passen aan veranderingen in data-formaat. Vergelijkbaar met de Perl-scripts, de R-code bestand geleverd (analysis.r), met daarin de instructies voor het plotten van de cijfers van de beeldanalyse gegevens kan worden gelezen in een teksteditor of RStudio software om extra toelichting op het gebruik en de aanpassing te zien. Deze notities kunnen worden aangevuld met informatie over reguliere expressies en Perl &lt;sup&gt; 12 en het pakket ggplot2 13 voor R, die beide vormen de basis van de data wordt gelezen, geannoteerd en uitgezet, respectievelijk. Nieuwe studies met fluorescentiemicroscopie als ruwe gegevens gedeponeerd met open source publicaties vatbaar analysemethoden zoals hier beschreven. De aard van high content data leent zich recursieve analyse met verschillende analytische accenten afhankelijk van de interesses van een bepaalde waarnemer. Ofschoon de vragen die de gebruiker aan de gegevens worden beperkt door de sondes oorspronkelijk gebruikt, beeldgegevens kunnen vaak zinvol reanalyzed buiten het kader van de onderzoeken die hen gegenereerd.

De hier gepresenteerde werk beschrijft het gebruik van de vrij beschikbare software Cell Profiler-algoritme geleide verdeling van fluorescentie microscopie beelden van hechtende cellen aan individuele cellen en subcellulaire gedefinieerde gebieden identificeren voeren. Deze benadering genoemd beeldsegmentatie, kan de daaropvolgende meervoudige parametrische analyse van de afgebeelde cellen kwantificeren fluorescent gelabelde markers gelokaliseerd op elke cel of subcellulaire gebied (aangeduid als gesegmenteerde objecten). Deze workflow vormt een basis voor het inschakelen van high-inhoudelijke analyse en is bedoeld om te dienen als een instrument dat verder kan worden ontwikkeld en aangepast om multi-parametrische passen, individuele cel-analyses in laboratoria zonder toegang tot gespecialiseerde high-gehalte instrumenten of proprietary software. De met dit manuscript aangeleverde bestanden bevatten een test reeks relevante ruwe beeldgegevens, algoritme instellingen en het ondersteunen van scripts om de beschreven analyse te genereren. De verstrekte algoritme instellingen fof Cell Profiler zijn geoptimaliseerd voor Voorbeeld dataset en de discussie sectie gegevens welke aanpassingen nodig zijn om gebruik van beeldgegevens uit andere studies mogelijk. Zodra kwantitatieve gegevens wordt gewonnen met behulp van Cell Profiler, kunnen verschillende laboratoria verschillende vereisten om op de door de individuele cel waarden in de ruwe data informatie te gebruiken; hier is een benadering waarbij poorten worden toegepast op de ruwe gegevens voor elke assay. Met behulp van deze poorten, worden de gegevens omgezet in binaire termen van respons, waardoor visualisatie van trends verbinding van verschillende behandelingen met de subpopulaties van cellen die respons gedefinieerd door de poorten. De poorten zijn ingesteld op basis van opmerkingen van de verdelingen verkregen voor passende negatieve en positieve controles voor elke relevante meting. Het gebruik van poorten is slechts een voorbeeld van hoe je de ruwe, cel-gebaseerde metingen te beheren. Ook hier is het gebruik van nucleair DNA intensiteit measurements in hun ruwe vorm als een continue reeks van waarden in combinatie met de gated gegevens. Andere manieren waarop het beeld analysegegevens worden overwogen, afhankelijk van de aard van de studie; statistische alternatieven voor poorten voor het toekennen cellen subpopulaties gemeld 2 en systematische vergelijkingen van strategieën om high content samenvat in grote aantallen parameters gemeld 3. High-inhoud analyses van beeldgegevens hebben gebruik in cellulaire studies van drug-respons gevonden, reverse genetics en milieu-stress signalisatie 4-6. De verdienste van high content analyse komt voort uit het feit dat algoritmische analyse van fluorescentiemicroscopie gegevens maakt kwantitatieve en ruimtelijke parameters tegelijk worden beschouwd in afzonderlijke cellen 7. Zo kan cellulaire resultaten voor meerdere assays kruisverwijzingen, differentiële gedrag van assay-d zijnefined cel subpopulaties kunnen worden gevolgd binnen de experimentele condities en testen kunnen worden gekeken naar morfologische variabelen. De strategieën en analyse workflow besproken, als voor andere hoog-gehalte benaderingen kunnen leveren gemultiplexte gegevens die zijn kruisverwijzingen naar individuele cellen. High-inhoud methoden pak studies die fluorescentiemicroscoop beelden te genereren en zijn van toepassing op de analyse van gegevens, variërend van tientallen beelden geproduceerd in lage doorvoer conventionele fluorescentie gebaseerde microscopie door naar de duizenden beelden geproduceerd met behulp van geautomatiseerde high content platforms. De workflow wordt hier geïllustreerd met bijvoorbeeld gegevens uit die afzonderlijke tests worden gemeten in termen van zowel de nucleaire fluorescerende marker intensiteiten of nucleaire / cytoplasmatische translocatie van een fluorescerende reporter eiwit. De workflow is flexibel doordat deze testen kunnen afzonderlijk worden onderzocht of in combinatie, afhankelijk each gegeven onderzoeksvraag door verschillende onderzoekers. De voorbeeldgegevens worden geproduceerd als onderdeel van een RNA interferentie (RNAi) experiment (figuur 1). Kleine interfererende RNA oligonucleotiden (siRNA) worden gebruikt om specifieke eiwitten knockdown in HCT116 humane colorectaal carcinoom cellen die tot veranderingen twee fluorescente reporters van kinase (CDK) activiteit van cycline afhankelijke. De CDK6-afhankelijke fosforylatie van het nucleaire retinoblastoma eiwit op serine 780 (P-S780 RB1) wordt beoordeeld door antilichaam kleuring. In dezelfde cellen, wordt een groen fluorescent proteïne-gemerkte reporter van CDK2 activiteit (GFP-reporter CDK2) bepaald door de nucleaire cytoplasmatische verhouding waarin bij afwezigheid van CDK2 activiteit van de reporter bevindt in de kern en bij CDK2 activatie shuttles in het cytoplasma 8. Bovendien wordt de kern-DNA van elke cel gekleurd met een DNA intercalerende kleurstof, bisbenzimide, die dient als middel om cellen kernen grenzen opsporen en definiëren de beelden ook eensa mate van DNA overvloed voorlichting over celcyclus positie van de cel (figuur 2). De activiteiten van CDK6 en CDK2 zijn detecteerbaar als cellen doorvoer van G1 naar S-fase van de celcyclus 5 en volgen elkaar 9,10 en, als zodanig, is nauwe overeenstemming tussen de twee reporters in individuele cellen verwacht. De demonstratie dataset hier gebruikte analyses als voorbeeld het effect van siRNA gericht CDK6, retinoblastoma proteïne (RB1) en een niet-gerichte negatieve controle (tabel 1). Knockdown van CDK6 moet zowel een afname van de P-S780 RB1 epitoop en een accumulatie van cellen in G1 fase van de celcyclus te wekken. De RB1 knock-down dient als reagens controle voor de specificiteit van de fosfo-S780 antilichaam. Fluorescentie microscoop beelden van formaline gefixeerde 11, fluorescerend gekleurd HCT 116 weefselkweek cellen worden gebruikt voor het algoritmische beeldanalyse. De verkregen numerieke data wordt dan gebruikt omkruisverwijzingen de verslaggevers en peilen naar de impact van de verschillende knockdown staten. De potentiële omvang van de door dit type analyse van gegevens kan een uitdaging om de normale analyse-instrumenten te presenteren. Bijvoorbeeld, kan de individuele cel data groter is dan sommige spreadsheet-software zal plaats zijn. Inbegrepen zijn Perl scripts die eenvoudige, zeer repetitieve, begeleid verwerking uitvoeren van de gegevens ten behoeve van analyse van grote datasets. De Perl scripts zijn speciaal geschreven voor de output bestanden door Cell Profiler bij de verwerking beeldbestanden met een specifiek bestandsnaamconventie (figuur 3), en laat variabele aantal velden per putje voor gebruik in de analyse. Het is vaak belangrijk gate individuele cel assay gegevens om trends in cel subpopulaties 5 volgen en hier is het gebruik van een Perl-script om vlag elke cel gebaseerd op een voorafbepaalde poort voor elk type assay. Ook inbegrepen zijn optionele Perl scriptswaarvan de gegevens samenvatten resultaat voor afzonderlijke putjes (of condities) levert: percentage cellen binnen de gestelde poort en de gemiddelde waarden van de ruwe test scores. Deze laatste, meer homogene manier bekijken van de gegevens, is geldig wanneer responsen invloed op alle of de meeste cellen in een put. Zoals hierboven besproken, zoals evaluatie lager nuttiger dan die welke de individuele cel gegevens gating waarin respons beperkt tot een subset van cellen in een populatie. De bruikbaarheid van de beschreven werkstroom is niet beperkt tot verstoring van siRNA of de marker assays beschreven. Studies hebben deze benadering gebruikt om reacties in weefselkweek experimenten met combinaties van siRNA, chemische remmers en bestraling en voor de beoordeling van andere dan CDK6 markers en CDK2 activiteit 5 assay. Conceptueel, de experimentele strategie maakt het mogelijk een verscheidenheid van biologisch bruikbare subcellulaire regio&#39;s automatisch worden geregistreerdin individuele cellen aanwezig in fluorescentiemicroscoop afbeeldingen. Als zodanig kan deze benadering kwantitatieve multiplex waaruit biologische informatie die kunnen worden gemist door technieken die gericht zijn op populaties plaats van individuele cellen opleveren. Met kleine aanpassingen kan de aanpak en analyse workflow beschreven kwantitatieve, individuele cel gegevens opleveren voor elke fluorescentie gebaseerde test uitgangen en cel-biologische reacties, waar de kwantitatieve beoordeling van DNA-gehalte, kwantificering van nucleaire of cytoplasmatische fluorescentie of het pendelen van merkers tussen deze twee compartimenten afzonderlijk of in een multiplex wijze van belang. Publicatie-eisen steeds meer neigen naar het indienen van openlijk toegankelijke ruwe gegevens, toegang tot en vertrouwdheid met gratis tools voor het microscopie analyse zoals die hier beschreven zal ook van direct belang zijn voor laboratoria op zoek naar gepubliceerde gegevens opnieuw analyseren.

<table><tbody><tr><td>AllStars negative control siRNA</td><td>Qiagen</td><td>1027280</td><td>Negatieve controle siRNA.</td></tr><tr><td>CDK6 siRNA</td><td>Dharmacon/ Custom synthesis</td><td>NA</td><td>Antisense sequentie: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td></tr><tr><td>RB1 siRNA</td><td>Dharmacon/ Custom synthesis</td><td>NA</td><td>Antisense sequentie: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td></tr><tr><td>5x siRNA buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>B-002000-UB-100</td><td>Te verdunnen met nuclease-vrije, niet-DEPC behandeld water.</td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water (niet-DEPC)</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9937</td><td>Voor verdunning van siRNA buffer.</td></tr><tr><td>Hiperfect</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>Transfectie lipide.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td>Met pyruvaat en hoog-glucose aangevuld weefselkweekmedium.</td></tr><tr><td>96 well weefselkweekplaat</td><td>Falcon</td><td>3072</td><td>Vlakke, 96 well weefselkweekplaat voor het parallelle, gecompartimenteerde mengen van transfectiecomplexen.</td></tr><tr><td>Packard Viewplate</td><td>Perkin Elmer LAS</td><td>6005182</td><td>96 well TC plaat met optische basis waarop cellen worden getransfecteerd, gekweekt, gefixeerd en uiteindelijk geïmaged. Geleverd met ondoorzichtige, zelfklevende plaatverbindingen, die worden gebruikt tijdens het opslaan van gebruikte platen.</td></tr><tr><td>Ademende membraan</td><td>Alpha Labs</td><td>LW2783</td><td>Steriele, gas-doorlaatbare, zelfklevende membraan.</td></tr><tr><td>Neutraal gebufferd formaline, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-1CS</td><td>10% Formaline (4% formaldehyde) fixatief gebruikt in zuivere vorm in protocol.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100PC</td><td>Niet-ionogene detergent</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethaan)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Voor plaatwasoplossing.</td></tr><tr><td>Anti-P-S780 RB1 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab32513</td><td>Konijnen monoklonaal</td></tr><tr><td>AlexaFluor647 Anti-konijn</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>Hoogwaardig gekruisadsorbeerd, fluorescent gelabeld secundair antilichaam.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (Bisbenzimide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Fluorescent, chromatine-intercaleerende, DNA kleurstof.</td></tr><tr><td>Permeabilisatieoplossing</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0,1% Triton X-100 in 50 mM Tris-gebufferde zoutoplossing, pH 8,0.</td></tr><tr><td>Plaatwasoplossing</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20.</td></tr><tr><td>Blokoplossing</td><td>NA</td><td>NA</td><td>5% poedervormig melk in Tris-gebufferde zoutoplossing en 0,1% Tween-20. Voor het blokkeren van plaat voorafgaand aan immunokleuring en verdunning van antilichamen.</td></tr><tr><td>Cell Profiler 2.1</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td></tr><tr><td>Active Perl Community Edition</td><td>ActiveState</td><td></td><td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td></tr><tr><td>R programmeeromgeving</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>http://www.r-project.org</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>http://www.rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

workflow voor high-inhoud, individuele cel kwantificering van fluorescente merkers van universal microscoop gegevens, ondersteund door open source software

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Vooruitgang in het begrijpen van de controlemechanismen inzake het gedrag van cellen in aanhangend zoogdieren weefselkweek modellen worden steeds meer afhankelijk van vormen van single-cell analyse. Methoden die composite data die de gemiddelde waarden van biomarkers van celpopulaties leveren riskeren subpopulatie dynamiek dat de heterogeniteit van de onderzochte biologische systeem reflecteren. In overeenstemming hiermee worden traditionele benaderingen vervangen of ondersteund, meer verfijnde vormen van cellulaire assay ontwikkeld voor de beoordeling van high content microscopie mogelijk. Deze testen kunnen leiden tot grote aantallen beelden van TL-biomarkers, die mogelijk gemaakt door de begeleidende proprietary software pakketten, zorgt voor een multi-parametrische metingen per cel. Echter, de relatief hoge kapitaalkosten en overspecialisatie van veel van deze apparaten hun toegankelijkheid verhinderd om vele onderzoekers. Hier beschreven is eenuniverseel toepasbaar workflow voor de kwantificering van meerdere fluorescente merker intensiteiten van specifieke subcellulaire gebieden van individuele cellen geschikt voor beelden door de fluorescente microscoop. De sleutel tot deze werkstroom is de uitvoering van de vrij beschikbare Cell Profiler software 1 tot afzonderlijke cellen in de afbeeldingen segment ze in bepaalde subcellulaire gebieden onderscheiden en leveren fluorescentie marker intensiteitswaarden specifiek zijn voor deze regio. De extractie van individuele cel intensiteitswaarden van beeldgegevens het hoofddoel van deze werkstroom en wordt geïllustreerd met de analyse van bedieningsgegevens van een siRNA scherm G1 controle punt regelgevers hechtende menselijke cellen. Echter, de hier gepresenteerde workflow worden toegepast op de analyse van gegevens van andere middelen cel verstoring (bijvoorbeeld verbinding screens) en andere vormen van op fluorescentie gebaseerde cellulaire merkers en aldus zou nuttig zijn voor diverse laboratoria.

Gepresenteerd is een flexibele informatica workflow waardoor multiplex-image-based analyse van fluorescent gelabelde cellen. De workflow kwantificeert nucleaire en cytoplasmatische markers en berekent marker translocatie tussen deze compartimenten. Procedures zijn voorzien verstoring van cellen met siRNA en betrouwbare methode voor het merkerdetectie door indirecte immunofluorescentie in 96-well formaat.

Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Het algemene doel van deze procedure is om de reacties van individuele cellen objectief te meten door specifieke fluorescente markerintensiteiten van microscoopbeelden te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een adherent weefselkweekcel te onderwerpen aan irna-gemedieerde genknockdown. In de tweede stap worden de cellen fluorescent gekleurd en vervolgens geïmaged voor verschillende markers van belang.In de laatste stap wordt de expressie van de markers binnen specifieke subcellulaire gebieden algoritmisch gedefinieerd, zijn individuele cellen. Uiteindelijk kunnen de cellulaire reacties op biologische signalen van genknockdown worden geanalyseerd door de fluorescente expressieniveaus van de markers van belang en hun subcellulaire Translocatie te meten. Hoewel deze procedure inzicht biedt in de regulatie van G één celcyclustransitie als reactie op siRNA's.Het kan ook worden toegepast op studies die fluorescente celbeelden genereren, nucleaire transport en eiwithomeostase bestuderen. Het demonstreren van de procedure zal Daniel Wek en Car K HO fellow postdocs uit mijn laboratorium zijn Begin met het dispenseren van 70 microliter van 200 nanomolair irna, verdund in een irna buffer, in de juiste putjes van een steriele 96-well plate in een steriele weefselkweekhood. Voeg vervolgens 105 microliter van transfectielipoïd verdund in 40 volumes serumvrij DMEM medium toe aan elke put van een sir a meng de plaat door zachte vibratie bij kamertemperatuur, en verdeel na 10 minuten de resulterende 175 microliter in drie 50 microliter replica's per doelwit in een ondoorzichtige weefselkweek behandelde 96-well plaat met een transparante bodem.Spuit vervolgens 8.000 cellen per put in 150 microliter DMEM met 10%serum direct op de 50 microliter lipid irna complexen zonder te mengen. Verzegeld de plaat vervolgens met een steriele ademende membraan en plaats de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. 48 uur later aspireer het medium van de platen.Fixeer vervolgens de cellen in 100 microliter van 4% buffer formaldehyde in een afzuigkap bij kamertemperatuur Na 10 minuten aspireer het fixeermiddel en voer drie 100 microliter wasbeurten uit met PBS na de laatste wasbeurt. Verwijder de PBS en perforeer de cellen met drie cycli van 100 microliter permeabilisatie oplossing incubaties van 10 minuten elk bij kamertemperatuur zonder te schudden. Na de laatste incubatie, verwijder de permeabilisatie oplossing en voeg vervolgens 100 microliter van de blokoplossing per put toe gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Aspireer vervolgens de blokoplossing en probeer de cellen met 50 microliter van de primaire antilichaam van belang binnen twee weken na het labelen uc confocale microscoop met een 20 x objectief om afzonderlijke 16 bit grijstinten TIFF-beelden in drie kanalen te nemen die overeenkomen met de DNA kleurstof GFP en immunokleuring. Flora vieren vangen veel niet-overlappende beeldsets of frames om ongeveer 1000 tot 2000 cellen per put te beeld. Noem het beeldbestand systematisch met de metadata-informatie zodat elke bestandsnaam een unieke combinatie is van experimentnaam, putadres, framenummer en kanaalidentificator.Open vervolgens de cell profiler software en klik op bestand en importeer pijplijn. Selecteer vervolgens onder van bestand het bestand drie kanalen pijplijn CP pipe file, die de nodige instructies bevat voor de software om de metadata van het beeldbestand te interpreteren uit de opgeslagen bestandsnaam. Cell Profiler kan nu worden gebruikt om de afbeeldingen te relateren, de nucleaire DNA en antilichaam intensiteiten uit de bestanden te extraheren en het GFP-kanaal te gebruiken om de verhouding van de nucleaire versus cytoplasma intensiteit te berekenen. Voor elke gedetecteerde cel, klik op de knop weergave uitvoerinstellingen en klik vervolgens op de standaard invoer en standaard uitvoer mappen.Selecteer de locatie van de beeldbestanden voor analyse en de bestemming voor de geëxtraheerde gegevens respectievelijk. Klik vervolgens in het analysemodulesvenster op de juiste oogpictogrammen om de primaire objecten en tertiaire objecten te observeren en identificeren tijdens de analyse en klik op analyseer afbeeldingen wanneer de analyse is voltooid. Klik op oké in het berichtvenster en ga naar de standaard uitvoer map Locatie waar alle gegevensbestanden worden opgeslagen als door komma's gescheiden waarden.Om de gegevensextractie uit te voeren, vind het nieuwe nucleï CSV-bestand dat is opgenomen onder de output van cell profiler, dat de individuele celgegevens bevat voor de fluorescente nucleaire antilichaamintendintensiteit, nucleaire DNA-intensiteit en GFP CDK twee reporter verhoudingswaarden. Kopieer het opgegeven pulse script bestand naar gait classifier PL in dezelfde map als het nucleï CSV-gegevensbestand. Dubbelklik vervolgens op het pictogram voor Pearl Script.En wanneer gevraagd, typ de volledige naam van het gegevensbestand gevolgd door een DOT CSV-bestandsnaam voor het bestand waarin de cellen moeten worden gesorteerd en de poortwaarden voor de antilichaamfluorescentie en G FP CDK twee reporter gegevens. Bevestig dat het nieuw gemaakte bestand de ruwe individuele celassaywaarden van de originele celprofielgegevens combineert met de subpopulatielabels die laten zien hoe elke cel van elke put presteert ten opzichte van beide poorten. Open nu de R Studio software om de gegevens voor elke experimentele conditie te plotten met behulp van de individuele celasubpopulatielabels door op bestand en open bestand te klikken en vervolgens het opgegeven analyse dot r-bestand te selecteren.Typ het computeradres van de map met de gesorteerd gegevens, inclusief de stationsletter en de naam van het bestand zelf. Markeer vervolgens regels een tot en met 17 in het bovenste linkervenster van onze studio, en klik op de knop uitvoeren om de experimentele gegevensdrempelwaarden en putlocatiedetails in te voeren. Markeer ten slotte de individuele blokken van de resterende code onder lijn 17 en klik op de knop uitvoeren om de bijbehorende grafieken te maken.Bekijk de grafieken in het venster in de rechterbenedenhoek van onze studio, en klik vervolgens op de knop exporteren om deze op te slaan in verschillende formaten. De hier beschreven workflow analyseert de fluorescente microscoopbeelden om ruwe gegevens te produceren in de vorm van een lijst die elke geïdentificeerde cel en de bijbehorende

workflow-for-high-content-individual-cell-quantification-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit gevisualiseerd experiment is een gids voor het gebruik van een fluorescerende moleculaire kloon van HIV voor live confocale imaging experimenten.

Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie

Autofagie is een alomtegenwoordige proces waarmee cellen om eiwitten en organellen degraderen en te recyclen. We passen geavanceerde fluorescentie microscopie te visualiseren en kwantificeren van de kleine, maar essentiële, fysieke veranderingen geassocieerd met de inductie van autofagie, waaronder de vorming en verspreiding van autofagosomen en lysosomen, en hun fusie in autolysosomes.

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

Hier beschrijven we een workflow voor het snel analyseren en verkennen van collecties van fluorescentie microscopie beelden met behulp PhenoRipper, een recent ontwikkelde beeldanalyse platform.

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

We presenteren een open source hoog gehalte analyse (HCA) instrument gebruik te maken van geautomatiseerde fluorescentie lifetime imaging (FLIM) voor het testen van eiwit interacties met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) op basis van uitlezingen. Data-acquisitie voor deze openFLIM-HCA instrument wordt bestuurd door software geschreven in μManager en data-analyse wordt uitgevoerd in FLIMfit.

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We hebben een nieuw protocol ontwikkeld voor het bestuderen van heterocellulaire populatie dynamiek in reactie op verstoringen. Dit manuscript beschrijft een beeldvormend platform dat kwantitatieve datasets produceert voor gelijktijdige karakterisering van meerdere cellulaire fenotypen van heterocellulaire populaties op een robuuste manier.

Discriminatie en karakterisering van heterocellulaire populaties met behulp van kwantitatieve beeldvormingstechnieken

Dit manuscript beschrijft een methode om te visualiseren en te kwantificeren van gelokaliseerde vertaling gebeurtenissen in subcellular compartimenten. De in dit manuscript voorgestelde benadering is vereist van een basissysteem voor confocal beeldvorming en reagentia en snelle en kostenefficiënte.

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

Hier beschrijven we een protocol voor de automatische segmentatie van fluorescently geëtiketteerde weefsels op dia's met behulp van een widefield high-inhoudsanalyse systeem (WHCAS). Dit protocol heeft brede toepassingen op elk gebied waarbij de kwantificatie van fluorescente markeringen in biologische weefsels waaronder de biologische wetenschappen, medische techniek en Gezondheidswetenschappen.

Geautomatiseerde dia scannen en segmentatie in Fluorescently-geëtiketteerden weefsels met behulp van een analysesysteem Widefield High-inhoud

Vitale fluorescerende kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor Live-celbeeldvormings analyses in moderne schimmel celbiologie. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-/exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels.

Toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor het beeldvorming van filamenteuze schimmels in levende cellen

Dit artikel beschrijft stapsgewijze methoden om de kwantificering van beeldkernen te automatiseren met behulp van een open-source uitvoerbaar programma dat is gevalideerd voor een reeks celdichtheden. Dit programma biedt een alternatief dat barrières aanpakt met betrekking tot kosten, toegankelijkheid voor gebruikers met beperkte technologische vaardigheden en applicatiespecifieke validatie die de bruikbaarheid van bestaande technologieën kunnen beperken.

Computer vision-bibliotheken gebruiken om de kwantificering van kernen te stroomlijnen

Dit artikel beschrijft een nieuw protocol en reagensset ontworpen voor de gevoelige meting van de neurotoxische effecten van verbindingen en behandelingen op co-culturen van neuronen en astrocyten met behulp van hoge inhoudsanalyse. Resultaten tonen aan dat de hoge inhoudelijke analyse een spannende nieuwe technologie voor neurotoxiciteit assessment vertegenwoordigt.

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

Leer een informatica-workflow voor kwantificering van fluorescente merkers in individuele cellen met behulp van Cell Profiler en R Studio. Deze methode analyseert subcellulaire translocatie en genexpressie.

Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software (Video) | JoVE Journal

Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software

Meer video's verkennen