Name: Een hoog gehalte Imaging Assay voor Identificatie van botulineneurotoxine Remmers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Ontdek een fenotypische screeningsassay voor het identificeren van kleine moleculen die botulinumneurotoxine remmen in muismotoneuronen. Deze methode behoudt SNAP 25 en herstelt neurotransmitterafgifte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering werd verstrekt door het Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) onder sponsor projectnummer CCAR# CB3675 en National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 en 5 U01AI082051-05).

Plate 20.000 gedifferentieerde muis ES-cellen (MES) / putje in een 96 well Poly-D-lysine gecoate platen en in motor neuron terminale differentiatie media te behouden gedurende 5-7 dagen. 1. Compound Administratie en intoxicatie met BoNT / A Voer elk van de volgende werkzaamheden in een BSL2 behuizing om de naleving van CDC / NIH richtlijnen te houden. <ol><li> Bereid 10 mM voorraadoplossingen van elke bibliotheek verbinding in 100% DMSO in polypropyleen platen met 96 putjes. Gebruik de 10 mM voorraad naar een tussenliggende plaat verdunning die 10 maal hoger dan de gewenste concentratie screening bereiden. Bereid 100 uM tussenplaat door doseren 10 mM voorraad in 96-well plaat en verdunnen tot 100 uM behulp voedingsbodems. Pipetteer 10 ul van de verbindingen op 90 ul van media op de cellen 11. Test verbindingen bij 10 uM eindconcentratie en zorgen uiteindelijk percentage van DMSO ten hoogste 0,5%. </li><li> Voer alle studies dat levende cellen en actieve toxine te gebruiken onder bioveiligheid niveau 2 voorwaarden. Vervang het medium in de 96-well platen met 80 ul vers terminale differentiatie media met een 12 kanaals handmatige pipet. Voer aspiratie en breng stappen rijen blootstelling van de cellen te voorkomen zonder media aan de omgevingslucht. </li><li> Voorbehandelen cellen met verbindingen vóór toepassing van toxine door toevoeging van 10 pl van 10x verbindingen uit de bronplaat met een 12 kanaals pipet, gevolgd door mengen door afzuiging (tweemaal). Voor elke 96-well plaat, behandel twee kolommen 6 putjes met 10x DMSO verdund in de media zo hoog signaal en lage signaal controles dienen. De kolom zonder BoNT behandeling vertoont het hoogste niveau van de volledige lengte SNAP-25 (hoog signaal controle). Behandel de andere kolom met BoNT alleen (zonder verbindingen) als het lage signaal controle. Met lage controle om de efficiëntie van BoNT splitsing van SNAP-25 en de detectie met de BACS antilichaam waarnemen (Figuur 2). </li><li> Incubeer cellen met verbindingen gedurende 30 min bij 37 ° C en 6% CO2 in de celkweek incubator. </li><li> Bereid botulineneurotoxine Een uit een 1 mg / ml commerciële bron in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een uiteindelijke 10x werkvoorraad door verdunnen met terminale differentiatie media. </li><li> Initiëren intoxicatie door toevoeging van 10 pl 10x BoNT / A stock in putten aangewezen voor behandeling en lage signaal controles met een meerkanaalspipet (figuur 2). Behandel de aangewezen als high-controle met alleen media putten. </li><li> Ontsmet alle plastic waren en andere disposables die in contact komt met BoNT / A tijdens de studie door onderdompeling in 0,825% hypochloriet oplossing in water gedurende minstens 20 minuten. Voer alle procedures in bioveiligheid kasten en ontsmetten werkruimtes, zowel voor als na experimenten met 5% detergent desinfecterende reiniger zoals MicroChem oplossing. </li><li> Label de platen duidelijk te maken en incub toxine te duidenat platen behandeld met 1 nM / L BoNT / A gedurende 4 uur bij 37 ° C en 6% CO2 in een celkweek incubator. Toon passende bewegwijzering naar collega&#39;s die toxine in gebruik is in het laboratorium op de hoogte. </li><li> Stop BONT / A proteolytische splitsing door methanol fixatie. Verwijder media met toxine en verbindingen uit elk putje met een multichannel pipet en gooi in 10% bleekwater oplossing. Voeg ijskoude methanol (100 ui) rechtstreeks aan elk putje. </li><li> Incubeer de platen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) om fixatie te voorkomen. </li><li> Na fixatie, veilig omgaan met de afgedankte reagentia (beschouwd geneutraliseerd) met bioveiligheid niveau 1 protocollen en dienovereenkomstig weggooien. </li><li> Gooi methanol en gebruik 100 pl PBS om de cellen te wassen en ze te rehydrateren voor immunokleuring. Voer twee extra wassen met PBS. </li><li> Na de laatste wasbeurt, laat PBS in de putjes afdichting platen met microplaat kleeffolie en bewaar bij 4 ° C tot analyse. WINKEL platen bij 4 ° C for een aantal dagen. </li></ol> 2. Immunokleuring De immunostaining procedure is een arbeidsintensieve, multistep operatie die repetitieve reagens dispensesystemen / aspireren cycli en uitgebreide plaat wassen die kunnen leiden tot de mogelijke invoering van belangrijke intraplaat en Interplate variabiliteit omvat. Een semi-automatische benadering wordt toegepast op het tijdstip van het laboratoriumpersoneel besparen, throughput assay en minimaliseren immunokleuring variabiliteit. <ol><li> Gebruik een geautomatiseerd werkstation voorzien van een 96-well head kunnen overbrengen volumes tot 250 ul en geïntegreerd met een robot grijper arm laboratorium verplaatsen naar verschillende locaties op het modulaire dek (zie Materialen en uitrusting) voor dit protocol. <ol><li> De modulaire dek is ontworpen om verschillende typen laboratorium gastheer en kan tot 11 items ondersteunt tegelijkertijd. De geautomatiseerde microplaat handler is voorzien van een dubbel magazijn microplaat stacker teneinde houden enmanipuleren tot 50 platen per cyclus. </li><li> De geautomatiseerde werkstation bevindt zich in een klasse II bioveiligheid kast ontworpen voor laboratoriumautomatisering apparatuur steriliteit en veiligheid. Voor geautomatiseerde immunokleuring, wordt het dek opgesteld als aangegeven in figuur 3 om toegang reagens als nodig en zonder menselijke tussenkomst mogelijk. </li></ol></li><li> Pre-load platen met vaste cellen in de plaat magazine en transfer naar het dek als nodig is voor liquid handling operaties. Gebruik de 96 pipetkop uitgerust met 250 ul tips om te zuigen PBS uit de bronnen tot 10 pl. Permeabilize celmembranen antilichaam vergemakkelijken binding aan intracellulaire doelwitten met permeabilisatie buffer (0,1% Triton-X 100). Verdeel permeabilisatie buffer (100 ui) in elk putje, voordat de platen bij de tweede opslag magazijn van de microplaat stapelaar 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Verwijderen permeabilisatie buffer en perform plaat wassen met PBS (tweemaal) zoals eerder beschreven in stap 1.13. </li><li> Na de laatste wasstap, verwijder de PBS-buffer en afzien 100 ul van het blokkeren van een buffer met 1% paard serum en 0,1% Tween 20 in PBS in alle microplaten alvorens terug te keren ze naar de plaat magazine voor 1 uur incubatie bij kamertemperatuur. </li><li> Gebruik twee primaire antilichamen voor immunostaining: een konijn polyklonale anti-muis BACS antilichaam, voor de detectie van de volledige lengte van SNAP-25 en een muis monoklonaal anti-III tubuline antilichaam voor detectie van neuronen (zie materiaal en apparatuur). Na 60 min incubatie, verwijder blokkeerbuffer en breng 50 pl 4UG / ml BACS antilichaam en 0,5 ug / ml-III tubuline in blokkerende buffer in alle platen. </li><li> Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur verwijdert de primaire antilichamen en was 3 maal met 100 pi PBS dat 0,05% Tween (PBST). </li><li> Gebruik van een anti-muis IgG gelabeld met Alexa Fluor 647 de-III tubuline en anti-konijnen IgG gelabeld met Alexa F visualiserenluor 568 aan de BACS antilichaam visualiseren. Bereid zowel antilichamen als 2 ug / ml verdund in blokkeerbuffer en breng 50 pl van het mengsel in elk putje. OPMERKING: De secundaire antilichamen gekozen voor immunokleuring worden gelabeld met verschillende fluoroforen op detectie van de uitgestraalde fluorescerend licht laat bij verschillende golflengtes met verschillende kanalen binnen de detector van het hoge gehalte Imager. </li><li> Incubeer gedurende 1 uur bij KT. Zuig het secundaire antilichamen en was 3 maal met 100 pi PBST. </li><li> Na de laatste wasbeurt, voeg 100 ul PBS die Hoechst kleurstof (32 uM) aan het DNA voor kernen detectie vlek. </li><li> Dicht de platen met een licht ondoorlaatbare film naar de fluoroforen beschermen tegen fotobleken. Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 &#160; ° C gedurende weken zonder significant verlies van signaal. </li></ol> 3. Imaging OPMERKING: Voer beeldaanwinst behulp van High Content Imaging Systeem (zie materialen en apparatuur). <ol><li> Specificatie van High Content Imager definities: <ol><li> Selecteer type plaat, lay-out, het aantal velden, objectief: Greiner u duidelijke, 96 well formaat, 16, respectievelijk 20X water. </li><li> Kies kanalen: nucleus excitatie EX: 405 nm als kanaal 4; cytoplasma EX: 644 nm als kanaal 2; antigeen-specifieke antilichaam kanaal EX: 561 nm als kanaal 3 en Opzetten excitatie kracht van elke laser, Setup experiment als 2 belichtingen, Exposure 1 met een excitatie bij 644 nm, Belichting 2 met twee excitaties bij 405 nm en 561 nm. Selecteer binning als BIN2. </li><li> Gebruik hoge controle putten voor blootstelling optimalisatie met maximale intensiteit als SNAP-25 kanaal en lage controle putten voor een minimale intensiteit. </li><li> Pas de belichting, zodat de intensiteit van elk kanaal is ongeveer de helft van het verzadigingsniveau (2000-2500 relatieve eenheden). </li><li> Identificeer de optimale Z-vlak op mobiele masker kanaal met delta correctie script. Zie Figuur 5 voor resultaten na immunostaining en beeldvorming. Gegevens naar de server waar de software voor beeldanalyse verblijft export. </li></ol></li></ol> 4. beeldanalyse (figuur 6) OPMERKING: De volgende stappen beschrijven de toepassing van de Columbus software-algoritmen. <ol><li> Selecteer een geschikte algoritme om het segment van de primaire objecten (kernen). Indien nodig, aan te passen achtergrond drempel en contrast parameters. De Columbus-software biedt 4 kernen detectiemethoden. Kies de methode die het segment kernen nauwkeurig door visueel te inspecteren gesegmenteerd kernen (in F igure 6a methode M is geselecteerd). </li><li> Selecteer de neuriet algoritme (CSIRO Neuriet Analyse 2) naar het segment van de neurites Indien nodig, aan te passen achtergrond drempel en contrast parameters om de achtergrond te verwijderen. Zie Figuur 6b voor parameters die worden gebruikt om neurites detecteren. </li><li> Identificeer de neuriet regio (neuriet segmenten) based op secundaire objecten (neurieten) met een -3 pixel uitbreiding van de β-III tubuline kanaal (Alexa Flour 640) als masker (figuur 6c). </li><li> Bereken intensiteit van het signaal kanalen (SNAP-25, (Alexa Flour 568) voor de neurieten regio en β-III tubuline kanaal (figuur 6d en 6e). </li><li> Selecteer de gewenste parameters voor de export, zoals neuriet lengte, gemiddelde intensiteiten van SNAP-25, β-III tubuline, kernen nummer, neuriet segment nummer, enz. (Figuur 6f). </li><li> Transfer platen uit plaat stackers met behulp van de robot en de lading in de High Content Imager voor het acquisitie. </li></ol> 5. Data-analyse: Om de robuustheid van de ontworpen test beoordeelt Bereken de volgende parameters van de plaat experiment brengt. <ol><li> Signaal (S) naar de achtergrond (B): S / B = gemiddelde intensiteit van hoge signaal-controle) / gemiddelde intensiteit van lage signaal controle </li> &lt;li&gt; variatiecoëfficiënt (CV) van het signaal en de achtergrond (de uniformiteit van het signaal te meten): CV = (standaardafwijking (SD) / gemiddelde van monster) x 100 (%), om de variabiliteit te bepalen vloeistofverwerking, reagentia, etc. </li><li> Signal to Noise: S = (gemiddelde intensiteit van het signaal - gemiddelde intensiteit van lage signaal controle) / SD van lage controle <ol><li> Bereken de Z &#39;factor intoxicatie van één helft van een 96-well plaat en een mock intoxicatie van de andere helft. Z &#39;= 1-3 * (SD van hoge signaal control + SD van lage signaal controle) / (gemiddelde van hoge signaal control - gemiddelde van lage signaal controle). Voor de verdere analyse van de screening gegevens normaliseren enkele primaire grondstoffen parameters op een plaat basis om vergelijking tussen platen en tussen verschillende dagen experimenten. </li></ol></li><li> Percentage van splitsing, die de vermindering van het signaal geassocieerd met volledige lengte SNAP-25 gedetecteerd door specifieke antilichamen (BACS):% Splitsing = 100% * (mean intensiteit van hoge signaal-controle - intensiteit van het monster) / gemiddelde intensiteit van hoge signaal controle. </li><li> Procent van Remming van splitsing:% Remming = 100% * (intensiteit van het monster - gemiddelde intensiteit van lage signaal controle) / (gemiddelde intensiteit van hoge signaal control - gemiddelde intensiteit van lage signaal controle). </li></ol>

<ol><li>Lamanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+most+poisonous+poison%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The most poisonous poison.</a> Science. 130, 763-772 (1959).</li>
<li>Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Characterization+of+a+Novel+Botulinum+Neurotoxin+Type+H+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene.</a> J. Infect. Dis. , (2013).</li>
<li>Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+ground%3A+assays+for+therapeutics+against+botulinum+neurotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin.</a> Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).</li>
<li>Yersin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+synaptic+vesicle+fusion+proteins+explored+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).</li>
<li>Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+sensors+to+detect+botulinum+neurotoxin+activity+in+vitro+and+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).</li>
<li>Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+botulism+therapeutic+product+development+in+the+Department+of+Defense%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+Research%22%5BJournal%5D)">Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense.</a> Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).</li>
<li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-based+assays+to+measure+botulinum+neurotoxin+serotype+A+activity+using+cleavage-sensitive+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies.</a> Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).</li>
<li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemotype+that+inhibits+three+unrelated+pathogenic+targets%3A+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+light+chain%2C+P.+falciparum+malaria%2C+and+the+Ebola+filovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus.</a> Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).</li>
<li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+of+2%2C5-bis%284-amidinophenyl%29thiophene+derivatives+providing+submicromolar-range+inhibition+of+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+metalloprotease%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease.</a> European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).</li>
<li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacophore+Refinement+Guides+the+Rational+Design+of+Nanomolar-Range+Inhibitors+of+the+Botulinum+Neurotoxin+Serotype+A+Metalloprotease%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease.</a> ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).</li>
<li>Kiris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies%2C+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+research%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem cell research. 6, 195-205 (2011).</li>
<li>Pellett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+targeting%2C+internalization%2C+and+biological+activity+of+a+recombinant+atoxic+derivative+of+botulinum+neurotoxin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).</li>
<li>McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+neurons+are+a+novel%2C+highly+sensitive+tissue+culture+platform+for+botulinum+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).</li>
<li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimodal+modulation+of+the+botulinum+neurotoxin+protein-conducting+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).</li>
</ol>

Krishna P Kota is een medewerker van Perkin Elmer Inc. in Waltham, MA, dat instrumenten en software produceert die in dit manuscript worden gebruikt. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijk de opvattingen of beleidslijnen van het Amerikaanse Department of Health and Human Services, het Amerikaanse Department of Defense, het Amerikaanse Department of the Army, of de instellingen en bedrijven die aan de auteurs gelieerd zijn.

De hoge potentie van botulinum neurotoxinen en het relatieve gemak van hun bewapening heeft geresulteerd in hun indeling in categorie A (hoogste prioriteit) biothreat agenten door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention. Helaas zijn er geen FDA goedgekeurde therapieën voor BoNT intoxicatie tegen nadat het toxine wordt geïnternaliseerd door de motorneuronen. Elke druggable mechanisme neuronale herstel van BoNT intoxicatie bevordert leiden naar de ontwikkeling van een potentiële therapie voor zowel het l...

De bacterie Clostridium botulinum produceert Botulinum neurotoxine, een van de meest potente biologische toxinen die de mens 1. Er zijn 7 verschillende BoNT serotypen (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induceren verlamming bij de neuromusculaire junctie door SNARE complex proteolyse 2,3. SNARE proteolyse voorkomt neurotransmitter blaasje-membraan fusie en daardoor blokkeert de exocytose van neurotransmitters 4. De specifieke SNARE doel hangt af van de specifieke BoNT serotype betrokken bij de intoxicatie proces. BoNT / A en BoNT / E cleave SNAP-25 terwijl BoNT / C splitst zowel SNAP-25 en syntaxine 5. De overblijvende serotypen splitsen synaptobrevine (ook wel bolletjes geassocieerde membraaneiwit (VAMP). BoNT / A is gekozen assay ontwikkeling is verantwoordelijk voor een groot deel van natuurlijk voorkomende botulisme en de langste werkingsduur 6. Ontwikkeling van moleculen geneesmiddelen tegen BoNT / A is een belangrijk doel vooronze drug discovery programma en heeft traditioneel-target-gebaseerde methoden gebruikt om de actieve site proteolytische remmers 7 identificeren, 8-10. Echter, zal de oprichting van de actieve site inhibitoren met breed spectrum activiteit tegen verschillende serotypes en post-exposure werkzaamheid waarschijnlijk uitdagend. We hebben daarom werd een innovatieve, fenotypische drug discovery aanpak die BoNT SNAP-25 splitsing gebruikt als een functionele eindpunt aan kleine moleculen die BoNT-gemedieerde motor neuron intoxicatie kan blokkeren identificeren. SNAP-25 is nodig voor neurotransmitters, zoals afbraak van SNAP-25 is voorspellend verlamming en letaliteit in vivo. Bijvoorbeeld zou celgebaseerde screening tot ontdekking van nieuwe modulatoren van cellulaire factoren die verantwoordelijk zijn voor toxine inactivering of remming van toxine trajecten binnen doelcellen. Een belangrijke factor in fenotypische assay ontwikkeling is de selectie van fysiologisch relevante biologische modellen. We en anderen hebben muis embryonale stamcellen (ES) cellen afgeleide motorische neuronen die de immunologische karakter van de primaire motorische neuronen recapituleren en het uiten van Onverwacht-25 11- 13 beschreven. Belangrijk, deze cellulaire systemen zijn zeer gevoelig voor BoNT / A intoxicatie en tonen dosis-afhankelijke splitsing van SNAP-25 in reactie op toenemende concentraties van toxine 11,12. De gedifferentieerde neuronen worden ook geproduceerd in hoeveelheden die voldoende zijn voor high throughput plaat gebaseerde analyse en kon de vormgeving van een array van cellulaire assays. De fenotypische test is een immunofluorescentie methode gebruik te maken van twee verschillende antilichamen tegen splitsing van endogeen tot expressie volledige lengte SNAP-25 te kwantificeren tijdens BoNT / Een roes van muis motor neuron cultuur. Een carboxyleindstandige BoNT / A decollete-gevoelige (BACS) antilichaam dat alleen volledige lengte SNAP-25 herkent, worden nagegaan of BoNT / A gemedieerde proteolyse van SNAP-25uitdrukking in muismotorneuronen 10. Een schematisch diagram van de HCI assay is weergegeven in figuur 1.

<table><tbody><tr><td>Botulinum neurotoxin A&nbsp;</td><td>Metabiologics</td><td>NA</td><td>Geen catalogusnummer</td></tr><tr><td>Microtitre plates</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>655946</td><td>Poly-D-Lysine 96-well plates</td></tr><tr><td>BACs antibody</td><td>Lampire Biological</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microchem</td><td>National&nbsp;</td><td>0255</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>A412-20</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>PE JANUS MDT Mini Automated Workstation</td><td>Perkin Elmer</td><td>AJMDT01</td><td></td></tr><tr><td>Opera</td><td>Perkin Elmer</td><td>OP-QEHS-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>BIII tubulin antibody</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BAM1195</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342dye&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>3570</td><td></td></tr><tr><td>Antimouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Columbus Image analysis software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Spotfire</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Clorox bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-861-284</td><td></td></tr><tr><td>PlateStack</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een hoog gehalte imaging assay voor identificatie van botulineneurotoxine remmers

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Synaptosomal-associated eiwit-25 (SNAP-25) is een onderdeel van het oplosbare NSF-aanhechtingseiwitreceptor (SNARE) complex dat essentieel is voor de synaptische neurotransmitterafgifte. Botulinum neurotoxine serotype A (BoNT/A) is een zink-metalloprotease die de exocytose van neurotransmitter blokkeert door de SNAP-25-component van het SNARE-complex af te breken. Momenteel zijn er geen erkende geneesmiddelen om BoNT/A-vergiftiging te behandelen na internalisatie van de toxine door motorische neuronen. De ontwikkeling van effectieve therapeutische maatregelen om BoNT/A-intoxicatie tegen te gaan, is beperkt, deels vanwege het ontbreken van robuuste high-throughput-assays voor het screenen van kleine molecuulbibliotheken. Hier beschrijven we een hoogwaardige beeldvormings- (HCI) assay met nut voor de identificatie van BoNT/A-remmers. Initiële optimaliseringsinspanningen waren gericht op het verbeteren van de reproduceerbaarheid van inter-plaatresultaten over meerdere, onafhankelijke experimenten. Automatisering van immunokleuring, beeldverwerving en beeldanalyse bleek de consistentie van de assay te verhogen en de variabiliteit te minimaliseren, terwijl het de multiparameter evaluatie van experimentele verbindingen in een muis motorisch neuron systeem mogelijk maakte.

Gegevens van hoge en lage controle gecreëerd twee verschillende populaties met het verschil van twee medianen dan 3 standaardafwijkingen (figuur 7A). Het doel van de screening is om de verbindingen in het monster populatie vinden waarden dichter positieve controlegroep, uitgaande van een normale verdeling in het monster populatie (figuur 7B, (i)). Datapunten 3 standaardafwijkingen boven de gemiddelde worden geacht statistisch verschillend van het lawaai en geclassificeerd als een actief...

Botulinum neurotoxin is een van de krachtigste toxines onder categorie-A biobedreigingen, maar er is geen therapeutisch middel beschikbaar na blootstelling. De benadering van beeldvorming met hoge inhoud is een krachtige methodologie voor het identificeren van nieuwe remmers, omdat het multiparameter screening mogelijk maakt met behulp van biologisch relevante motorneuronen, het primaire doelwit van dit toxine.

Een hoog gehalte Imaging Assay voor Identificatie van botulineneurotoxine Remmers

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een fenotypisch screeningsassay te ontwikkelen dat IES botulinum-gemedieerde splitsing van zijn substraat SNAP 25 begeleidt met het oog op het identificeren van kleine moleculen die de toxinefunctie tijdens normale zenuwsignalering remmen. Het actiepotentiaal zorgt ervoor dat SNAP 25 de synaptische vesikel bindt aan het plasmamembraan van de motorische neuronterminal, wat resulteert in de afgifte van neurotransmitter. Wanneer botulinumneurotoxine echter aanwezig is, wordt het opgenomen door endocytose en vrijgegeven in de synaptische butoon waar het SNAP 25 splitst en zo de afgifte van neurotransmitter verstoort, wat verlamming veroorzaakt.Deze assay identificeert moleculen die de activiteit van botulinumtoxine kunnen remmen en dus de splitsing van SNAP 25 kunnen voorkomen in aanwezigheid van botulinumtoxine en zo de afgifte van neurotransmitter in de neuromusculaire junctie kunnen herstellen. Een hoogwaardige beeldvormingsassay uitgevoerd met muizenmotorneuronen wordt gebruikt om de behoud van SNAP 25 aan te tonen, wat resulteert in de identificatie van kleine moleculen die de metalloprotease-activiteit van botulinumneurotoxine kunnen remmen. A. Het belangrijkste voordeel van deze technologie of bestaande methoden zoals celvrij biochemische assay, is dat meerdere fenotyische eindpunten gelijktijdig kunnen worden vastgelegd vanuit een enkele put die motorneuronen bevat die zijn behandeld met screeningsverbindingen en toxine.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen die worden ondervonden tijdens bibliotheekscreening, zoals kwantificering van celgebaseerde activiteit en cytotoxiciteit. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar therapie voor botulinumvergiftiging omdat het remmers kan identificeren die rechtstreeks werken door de metaalprotease-activiteit te blokkeren of indirect door preventie van toxine-opnameverwerking, of mogelijk andere mechanismen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat de optimalisatie van immunokleuringsomstandigheden die nodig zijn voor SNAP 25-detectie uitdagend kan zijn.Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat de immunokleuringstap moeilijk te perfectioneren is omdat motor rond zichzelf vrij delicaat zijn. De stapsgewijze en wasstap zijn de sleutel tot het ontwikkelen van hoogwaardige beelden die vereist zijn voor downstream-analyse. Alle studies die gebruik maken van levende cellen en actieve toxine worden uitgevoerd onder bioveiligheidsniveau twee-omgevingen, decontaminatie van de werkgebieden zowel voor als na deze experimenten met een 5%detergens desinfecterende reiniger, zoals micro chem-oplossing.Nadat muizenembryonale stamcellen zijn gedifferentieerd in motorneuronen zoals beschreven in het tekstprotocol, gebruikt u een 12-kanaals handmatige pipet om het oude medium te vervangen. Breng in de 96-well platen 80 microliters vers terminal differentiatiemedium aan en voer de aspiratie- en doseringsstappen rij per rij uit om de blootstelling van de cellen aan de omgevingslucht te minimaliseren. Voeg vervolgens met een 12-kanaals pipet 10 microliters van 10 x van de testverbindingen uit de bronplaat toe, aspirieer vervolgens twee keer om te mengen x.Behandel twee kolommen van zes putten met 10 X-D-M-S-O verdund in het medium om als hoge signaal- en lage signaalcontroles te dienen. Incubeer de cellen met de verbindingen gedurende 30 minuten bij zeven graden Celsius en 6% koolstofdioxide. Verdun vervolgens de botulinumneurotoxine A in PBS met terminaal differentiatiemedium tot een eindconcentratie van 10 X werkstock met behulp van een multikanaals pipet, voeg 10 microliters van 10 x botulinumneurotoxine A stock toe aan de putten die zijn aangewezen voor behandeling en ook aan de lage signaalcontroleputten.Behandel de putten die zijn aangewezen als hoge controle met alleen medium, decontamineer alle plastic kleding en andere wegwerpartikelen die in contact komen met botulinumneurotoxine. A door onderdompeling in 0,825% hypochlorietoplossing in water gedurende ten minste 20 minuten. Label de platen duidelijk om toxinegebruik aan te geven en incubeer de platen gedurende vier uur bij 37 graden Celsius en 6% koolstofdioxide na incubatie.Gebruik een multikanaals pipet om het medium dat de toxine en verbindingen bevat uit elke put te verwijderen en gooi het weg in een 10% bleekoplossing. Voeg vervolgens 100 microliters ijskoud methanol direct toe aan elke put om de botulinumneurotoxine te stoppen. A proteolytische splitsing.Incubeer vervolgens de platen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om fixatie mogelijk te maken. Na fixatie, behandel de weggegooide geneutraliseerde reagentia volgens bioveiligheidsniveau één protocollen en gooi ze overeenkomstig weg. Na het weggegooien van de methanol, was de cellen drie keer met 100 microliters PBS om ze te rehydrateren voorafgaand aan immunokleuring.De immunokleuring die in een bioveiligheidskabinet van klasse twee wordt uitgevoerd, wordt uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerd werkstation dat is gerangschikt om toegang tot reagentia mogelijk te maken wanneer dat nodig is en zonder menselijke tussenkomst. Laad de platen met de gefixeerde cellen in de PLAAT-magazine en breng deze over naar het platform wanneer dat nodig is voor vloeistofhandelingsoperaties. Met behulp van de 96 pipetkop met 250 microliter tips, aspireert het werkstation PBS uit de putten tot 10 microliters.Het werkstation doseert 100 microliters blokkeringsbuffer die 1% paardenserum en 0,1% tween 20 in PBS bevat in alle microplaten. Breng vervolgens de platen terug naar de platenmagazine voor een incubatie van één uur bij kamertemperatuur. Verwijder na incubatie de blokkeringsbuffer en doseer 50 microliters van vier microgram per milliliter BS-antilichaam en 0,5 microgram per milliliter van bèta drie tubuline in blokkeringsbuffer in alle platen.Incubeer de platen gedurende één uur bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens de primaire antilichamen en was drie keer met 100 microliters PBST. Bereid twee microgram per milliliter verdunning van secundaire antilichamen gelabeld met verschillende fluoro fours zoals beschreven in het tekstprotocol. Doseer 50 microliters van het mengsel in elke put en incubeer gedur

a-high-content-imaging-assay-for-identification-botulinum-neurotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een protocol om trichothecenen (mycotoxinen van zorg voor de gezondheid van de mens) met behulp van een nieuw ontwikkelde screening methode gebaseerd op een competitief immunochemische methode en een laatste elektrochemische detectie te detecteren is aangetoond.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Methode voor Mycotoxine Detection

De lichte keten van het botulinum-neurotoxine type A (BoNT/A LC) is een metalloprotease die motorneuronen binnendringt, zijn substraat SNAP-25 splitst en de neurotransmissie verstoort, wat resulteert in slappe verlamming. Met behulp van een op hoog-doorvoer geschikte FRET-gebaseerde test, kunnen grote bibliotheken van kleine moleculen worden getest op hun impact op de enzymatische activiteit van BoNT/A LC.

Een High-throughput-compatibele FRET-gebaseerde platform voor identificatie en karakterisering van modulatoren van de lichte keten van botulinum-neurotoxine

De BoTest Matrix botulinum neurotoxine (BoNT) opsporingsanalyses snel te zuiveren en te kwantificeren BoNT uit een reeks van monstermatrices. Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van BoNT uit zowel vaste als vloeibare matrices en demonstreren van de test met BOTOX, tomaten en melk.

Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen

Een aangepast protocol wordt beschreven om muis ES-cellen te differentiëren in gedefinieerde populaties van zeer zuivere neuronen die functionerende synapsen en opkomend netwerkgedrag vertonen. Elektrofysiologische analyse toont het verlies van synaptische transmissie aan na blootstelling aan botulinum neurotoxine serotypen /A-/G en tetanus neurotoxine.

Functionele Evaluatie van Biologische Neurotoxines in Networked Cultures van stamcel-afgeleide centrale zenuwstelsel Neuronen

Dit artikel bevat een beschrijving van een eenvoudige eiwit microarray methode voor profilering humorale immuunreacties aan een 7-plex panel van sterk gezuiverd Clostridium difficile antigenen in menselijke sera. Het protocol kan worden uitgebreid voor de bepaling van specifieke antilichaam reacties in preparaten van polyklonale intraveneuze immunoglobuline.

Een eiwit Microarray Assay voor serologische bepaling van antigeen-specifieke antilichaam reacties volgende Clostridium difficile -infectie

Dit protocol presenteert een geautomatiseerde, op afbeeldingen gebaseerde high-throughput-techniek om verbindingen te identificeren die natural killer cel-gemedieerde borstkankerceldoding moduleren in de aanwezigheid van een therapeutisch anti-HER-2-antilichaam.

High-Content screening assay voor de identificatie van antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit modificerende verbindingen

We beschrijven het gebruik van dunne-laagchromatografie, directe bioautografie-assay en vloeistofchromatografie-massaspectrometrie om microbiële natuurlijke producten te identificeren die antagonisme vertonen tegen schimmelpathogenen, met behulp van de ziekteverwekker Sclerotinia sclerotiorum en biopesticide Bacil-isolaten als modelsysteem.

Bioassay-geleide identificatie van natuurlijke producten voor biologische bestrijding door dunnelaagchromatografie-directe bioautografie

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

Dit artikel beschrijft technieken om een ​​hoge resolutie van functionele magnetische resonantie beeldvorming uit te voeren met 1,2 mm bemonstering in de menselijke middenhersenen en subcorticale structuren met behulp van een 3T scanner. Het gebruik van deze technieken om topografische kaarten van visuele stimulatie in de menselijke superior colliculus (SC) op te lossen wordt als voorbeeld gegeven.

Hoge resolutie functionele magnetische resonantie imaging methoden voor Human middenhersenen

Functionele studies van het gehoorsysteem bij zoogdieren zijn traditioneel uitgevoerd met behulp van ruimtelijk gerichte technieken zoals elektrofysiologische opnames.  Het volgende protocol beschrijft een methode voor het visualiseren van grootschalige patronen van geïnduceerde hemodynamische activiteit in de gehoorschors van katten met behulp van functionele magnetische resonantie beeldvorming.

Functionele Beeldvorming van de auditieve cortex in volwassen katten met behulp van High-field fMRI

Ontdek een fenotypische screeningsassay voor het identificeren van kleine moleculen die botulinumneurotoxine remmen in muismotoneuronen. Deze methode behoudt SNAP 25 en herstelt neurotransmitterafgifte.

Een hoog gehalte Imaging Assay voor Identificatie van botulineneurotoxine Remmers

Meer video's verkennen