A Guide to Modern Kwantitatieve TL Western Blotting met Troubleshooting Strategies

Het doel van deze procedure is om de relatieve abundantie van specifieke eiwitten binnen een complex biologisch monster te detecteren en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van kwantitatief, fluorescerend twist en blotting. Dit wordt bereikt door eerst eiwitextracten elektro-fluorescent te scheiden met behulp van een voorgevormde gradiëntgel. In de tweede stap wordt de equivalente eiwitlading geverifieerd over alle monsterbanen door de toepassing van een totale eiwitkleur en vervolgens wordt het eye block semi-droog snelle overdrachtssysteem gebruikt om de monsters over te brengen naar A-P-V-D-F membraan.

Ten slotte worden de eiwitten onderzocht met specifieke primaire antilichamen gevolgd door het juiste fluorescerend getagde secundaire antilichaam om hun gevoelige, robuuste en lineaire detectie bij infrarood en verre rood golflengten te vergemakkelijken. Uiteindelijk kan kwantitatief fluorescerend westers bloeien worden gebruikt om reproduceerbaar een groot aantal membraangebonden en oplosbare eiwitten over een breed scala aan weefselmonsters te detecteren, visualiseren en nauwkeurig te kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals ECL-gebaseerde beeldvorming, is dat het een grotere gevoeligheid mogelijk maakt met verbeterde precisie op een brede lineaire schaal voor een echt kwantitatief resultaat. Begin door het weefselmonster handmatig te macereren, gevolgd door homogenisatie in vers bereid extractiebuffer bij ongeveer één tot 10 weefselgewicht per buffervolume tot een glad consistent homogenaat is geproduceerd.

Centrifugeer vervolgens het cellysaat gedurende 20 minuten bij 20.000 keer G bij vier graden Celsius. Breng vervolgens de sate met de gesolubiliseerde eiwitten over in een schone microcentrifugebuis en bewaar zowel de pellet als de S-supernatantfracties op minus 80 graden Celsius tot ze nodig zijn. Na het bepalen van de eiwitconcentratie van de supinate, breng 15 microgram eiwit per monster over in nieuwe microcentrifugebuizen.

Breng vervolgens het eindvolume van elk monster op tot 10 microliter met gedestilleerd water en voeg vijf microliter Forex-ladingsbuffer toe. Roer de celoplossingen grondig door middel van vortexen en verhit de monsters gedurende twee minuten tot 98 graden Celsius om de eiwitten te denatureren. Voeg na denaturatie drie microliter van een geschikt molecuulgewichtsstandaard toe in de eerste put van elk van de experimentele en ladingscontrolegels.

Laad vervolgens 10 microliter van elk monster in de volgende geschikte putten na elektroforese. Gebruik een gelmes om de gels van de cassette te verwijderen en verwijder de putten en de voet van de gel. Markeer de gel om latere oriëntatie te vergemakkelijken.

Bepaal vervolgens de equivalente eiwitlading door ongeveer 30 milliliter eiwitkleur in een vierkante 12 bij 12 centimeter Petrischaal te decanteren en plaats de ladingscontrolegel in de kleur, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de oplossing de hele gel bedekt. Roer de gel minimaal één uur op kamertemperatuur en gooi vervolgens de eiwitkleur weg en was de gel drie keer in gedestilleerd water voor visualisatie voor de eye block. Twee semi-droge snelle eiwitoverdracht Na elektroforese bereidt u de onderste overdrachtsstack voor door de folieafdekking te verwijderen en het membraan direct vanuit de geltank met loopbuffer voor te bevochtigen.

Bevochtig ook het filterpapier met gedestilleerd water op dit moment. Plaats vervolgens de experimentele gel op de voorbereide onderste overdrachtsstack en leg vervolgens het vooraf bewerkte filterpapier over de gel en rol ze allebei om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen tussen de lagen vastzitten. Leg de bovenste stack op de filterpapier en de onderste stack.

Rol vervolgens de overdrachtsstacksandwich om eventuele luchtbellen te elimineren. Plaats het sponsje uit het overdrachtsstackkit op de absorberende pad en plaats de overdrachtsstacksandwich in de speciale ruimte. Sluit vervolgens het deksel stevig en start de I block twee, overbreng de eiwitten gedurende zeven minuten op programma drie.

Wanneer het programma is voltooid, verwijdert u de overdrachtsstack van de eye block-machine en pel de bovenste overdrachtsstack en filterpapierlagen terug om de gel op de onderste overdrachtsstack bloot te leggen. Gebruik een scalpel om rond de gel te snijden en zorg ervoor dat u een driehoekige snede maakt voor oriëntatie op de membraan volgend op het trimmen van de membraan om de overdrachtsefficiëntie te controleren. Kleur de gel zoals net gedemonstreerd en verplaats vervolgens snel de membraan in een schone 50 milliliterbuis met vijf milliliter PBS voor de eerste van drie, vijf minuten wassen op een mechanische rol. Na de derde wassing, gooi de wasbuffer weg en incubeer de membraan in onverdunde blokkeerbuffer gedurende minimaal 30 minuten bij kamertemperatuur.

Incubeer vervolgens de membraan in primaire antilichaam verdund in vijf milliliter blokkeerbuffer en 0,1 tussen 20 overnacht bij vier graden Celsius met constante agitatie. De volgende ochtend, na het weggooien van de primaire antilichaamoplossing, was de membraan zes keer gedurende vijf minuten in PBS zoals net gedemonstreerd. Incubeer vervolgens de membraan in het donker met fluorescerend getagd secundair antilichaam, verdund in vijf milliliter blokkeerbuffer en 0,1%tussen 20 met constante agitatie, gevolgd door zes vijf minuten PBS-wassen voor alle beeldvorming.

Meld u eerst aan bij de computer en imager. Open vervolgens de beeldvormingssoftware om de westerse blot af te beelden. Open eerst het deksel van de imager en giet een kleine hoeveelheid PBS op het glas.

Plaats in de linkeronderhoek van de imager het membraan op het PBS en zorg ervoor dat het vierkant is met de as op de imager en dat er een opening van een centimeter is tussen het membraan en de rasteras. Rol het membraan om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen tussen het glas en het membraan vastzitten en tel vervolgens het aantal vierkanten dat het membraan op de x- en y-as inneemt. Sluit vervolgens het deksel van de imager en voer het aantal vierkanten in de computersoftware in.

Selecteer het juiste infrarode kanaal en de juiste intensiteit en start de scan om de totale eiwitkleur van de ladingscontrolegel te visualiseren. Reparatie van de gel en de imager zoals net gedemonstreerd voor