Name: A Guide to Modern Kwantitatieve TL Western Blotting met Troubleshooting Strategies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Leer kwantitatieve fluorescentie western blotting voor eiwitdetectie en -kwantificatie in biologische monsters. Deze methode biedt hogere gevoeligheid en precisie dan traditionele ECL-gebaseerde technieken voor betrouwbare resultaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag bedankt de volgende voor financiële steun: BBSRC Instituut Strategisch Programma Financiering - CF &amp; TMW; BBSRC Oosten Bio DTP financiering - LG; De Darwin Trust van Edinburgh - MLH. We willen ook graag Dr Barry McColl bedanken voor toestemming om de TREM2 optimalisatie in dit manuscript bevatten.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22Protein+Protocols+on+CD-ROM%22">Protein Protocols on CD-ROM</a>. , Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA. (1998).</li>
<li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblotting+and+immunodetection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Immunoblotting and immunodetection.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10(2008).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PLoS One. 8 (8), 72457(2013).</li>
<li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+Western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots.</a> Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).</li>
<li>Colella, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li>
<li>Zellner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).</li>
<li>Kielar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+correlates+of+axonal+and+synaptic+pathology+in+mouse+models+of+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease.</a> Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).</li>
<li>Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+proteomics+identifies+Calreticulin+and+GRP75%2FMortalin+as+peripherally+accessible+protein+biomarkers+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy.</a> Genome Med. 5 (10), 95(2013).</li>
<li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+ubiquitin+homeostasis+and+%CE%B2-catenin+signaling+promote+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy.</a> J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 Forthcoming.</li>
<li>Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+systems+for+westerns%3A+chemiluminescence+vs.+infrared+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection.</a> Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).</li>
<li>Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GalR1%2C+but+not+GalR2+or+GalR3%2C+levels+are+regulated+by+galanin+signalling+in+the+locus+coeruleus+through+a+cyclic+AMP-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism.</a> J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).</li>
<li>Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+signaling+events+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proceed+Online%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells.</a> Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).</li>
<li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteomics+analysis+of+synaptic+proteins+identifies+potential+cellular+targets+and+protein+mediators+of+synaptic+neuroprotection+conferred+by+the+slow+Wallerian+degeneration+%28Wlds%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).</li>
<li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fastest+western+in+town%3A+a+contemporary+twist+on+the+classic+western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis.</a> J. Vis. Exp. (84), 51149(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Inachtneming en planning essentieel voor experimenten en kan uiteindelijk het succes van de techniek bepaald. De vooruitgang in eiwitdetectie behulp WB kan een overvloed aan potentiële struikelblokken presenteren wanneer het proberen om te kiezen de juiste antilichamen, overdracht en visualisatie methoden te gebruiken. Gelukkig met een zorgvuldige checklist en geschikte voorzorgsmaatregelen QFWB routinematig worden gebruikt om de aanwezigheid eiwit en steeds subtiele verschillen tussen de expressie monsters te bepalen. Dit protocol biedt een uitgebreide gids voor fluorescerende kwantitatieve western blotting, evenals een paar strategieën voor probleemoplossing te voorkomen en / of te overwinnen enkele van de vele valkuilen die ermee verbonden zijn. De kritische stappen gebruikt om de gevoeligheid te behouden en verkrijgen echt kwantificeerbare en vergelijkbare metingen omvatten: 1) uitgebreide eiwit extractie uit weefselmonsters; 2) voorbereiding van het monster; 3) nauwkeurige eiwit loading, bepaald door de totale hoeveelheid eiwit analyse; 4) een optimale overdracht van eiwitten met behulp van I-Blot; 5) de voorbereiding van de primaire en secundaire antilichamen in het blokkeren van buffer die 0,1% Tween 20, en 6) de juiste visualisatie en analyse met behulp van een infrarood imager en bijbehorende software. Infrarood fluorescentiedetectie werkelijk kwantitatief en geeft grotere gevoeligheid tegenover traditionele ECL detectietechnieken 3,11. Dit detectiesysteem is met meerdere facetten, en als zodanig is niet beperkt tot QFWB. Dit systeem kan beeldvorming van immunohistochemisch etikettering gering vermogen zodat visualisatie en kwantificatie van hele weefselsecties 12. Dit is een gebied van potentiële toekomstige ontwikkeling in termen van resolutie, die veel rood imaging kon zien rivaliserende conventionele immunofluorescentie capturing met conventionele microscopen in termen van kwantitatieve beoordeling. Echter, met een grotere gevoeligheid voor subtiele veranderingen in pProtein expressie is het cruciaal om de variabiliteit te garanderen wordt tot een minimum beperkt en beheersmaatregelen zijn strenger met robuuste protocollen. Dit begint met rigoureuze eiwit extractie uit het weefselmonster gevolgd door de productie van totaal eiwit gekleurde gels om zekerheid te verschaffen dat monster laden is uniform, optimalisatie van de primaire en secundaire antilichamen om te bepalen of de detectie is echt en het testen van de richtlijnen van de fabrikant met betrekking tot de over te dragen keer om een ​​efficiënte eiwit overdracht te verkrijgen. Maar zelfs wanneer de omstandigheden voor WB geoptimaliseerd, kan er nog problemen die gepaard gaan met westerns die niet volledig zijn hier onderzocht. Deze omvatten maar zijn niet beperkt tot factoren zoals eiwitten oplosbaar en keuze extractiebuffer. Sommige buffers kunnen verstoren eiwitconcentratie assays en sommige weefsels zijn bijzonder moeilijk te lossen, die robuuster technieken zoals het gebruik van geautomatiseerde Macerating verzegelde containers zoals M buizen samen met een Macs dissociator. Daarnaast kunnen eenvoudige controlemaatregelen voor opslag van geëxtraheerde en niet-geëxtraheerde materiaal bij -80 ° C het verschil tussen het verkrijgen optimale labeling onmiddellijk na extractie en hebben slechte resultaten weken later. Moderne QFWB methoden zijn bewezen gevoeliger voor het vastleggen van subtiele verschillen in eiwit expressie te zijn en zijn veelzijdiger waardoor simultane dual labeling 3 in vergelijking met de oudere technieken zoals ECL. Het is essentieel dat western blotting protocollen zijn robuust en gemakkelijk herhaalbare voor nauwkeurige kwantificering en statistische analyse. Dit protocol is gevoelig en robuust genoeg om routinematig gebruikt voor de detectie van proteïnen in een verscheidenheid van verschillende weefselmonsters en soorten 3 en maakt kwantificering van hoge en lage abundantie proteïnen in dezelfde QFWB derhalve gebruik van verbruiksartikelen en tijd per experiment 1 verlagen. 1 Daarnaast is de verhoogde gevoeligheid van deze techniek maakt validatie van steeds populairder - sche studies 9,14 echter de nauwkeurigheid is van cruciaal belang en integratie van passende controlemaatregelen moeten worden nageleefd daardoor foutieve data-acquisitie vermijden.

Western blotting (WB) is een analytische techniek die oorspronkelijk ontwikkeld in de late jaren 1970 om de aanwezigheid of afwezigheid van een eiwit van interesse om een complex biologisch monster, zoals een weefsel homogenaat 1. Meestal aangeduid als eiwit immunoblot, Gezien de cruciale interactie van antilichaam-antigeen, de werkwijze bestaat uit 5 verschillende stappen: 1) de elektroforetische scheiding van eiwitten door hun iso-elektrisch punt; 2) de overdracht naar een nitrocellulose of polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan; 3) het labelen met een primair antilichaam dat specifiek is voor het eiwit van belang; 4) incubatie met een secundair antilichaam gericht tegen de primaire antilichaam; en 5) visualisatie. Visualisatie methodiek is geëvolueerd met de tijd om de veiligheid en de gevoeligheid te verbeteren. Enkele van de eerste WBS werden uitgevoerd met radioactief gemerkt labels die vervolgens ontwikkeld tot colorimetrische en vervolgens de meer algemeen gebruikte chemilluminescent (ECL) methoden. Radioactivity werd direct gemerkt op probes voor specifieke antigenen dat kleur- en ECL methodologieën indirecte labeling techniek met een reporter enzym zoals alkalische fosfatase of streptavidine horseradish peroxidase (HRP) 2. De intensiteit van etikettering van de chromageen of luminescerende product wordt gemeten met densitometrie waarbij de signaalsterkte, sterk of zwak, geeft min of meer de aanwezigheid van het eiwit van interesse in het monster. ECL is het gevoeliger en dus bevoordeeld methodologie 2 maar alle 3 de methoden werden in eerste instantie ontwikkeld op x-ray film met meer geavanceerde digitale imaging technieken later vastgesteld 3. De vooruitgang van digitale beelden van WB niet alleen toegestaan ​​onderzoeker om de aanwezigheid of afwezigheid van het eiwit van interesse te bepalen, maar ook toegestaan ​​een gevolgtrekking om het niveau van expressie van een gekozen eiwit in vergelijking met andere monsters en kunnen daarom worden aangeduid als &quot;semikwantitatieve &amp; #8221 ;. Onlangs heeft een echt kwantitatieve en gevoeliger western blotting techniek ontwikkeld waarbij de mate van fluorescentie gemeten direct gerelateerd aan de hoeveelheid en expressie van een eiwit in een monster: kwantitatief fluorescent western blotting (QFWB). Bij vergelijking QFWB met ECL etikettering, het gebruik van een fluorescerende secundair antilichaam genereert een lineair detectieprofiel 4. Dit in tegenstelling tot ECL technieken waar signaallineariteit gebeurt meestal met lage eiwit last van minder 5 ug en signaalverzadiging rechtstreeks verband houden met eiwitexpressie, dwz met alom tot expressie housekeeping genen 5,6. Dit verschil wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een groter aantal bindingsplaatsen beschikbaar tegen avidine ECL substraat te binden aan een gebiotinyleerd secundair, waardoor een grotere kans potentiële signaalverzadiging. Dit is een van de belangrijkste redenen voor ECL base immunoblotting wordt aangeduid als ONLy &quot;semi-kwantitatieve&quot; 7. Het verzadigingspunt van signaal van cruciaal belang bij het meten subtiele verschillen in expressieniveaus en kan leiden tot onnauwkeurige metingen. In de afgelopen jaren is de opkomst van grootschalige proteomics technieken detaillering steeds grotere gevoeligheid en identificatie van subtiele expressie verschillen heeft geleid tot een steeds grotere afhankelijkheid van werkelijk kwantitatieve western blotting voor validatie-experimenten 8,9. De toepassing van gevoelige, robuuste en echt kwantitatieve methodiek is daarom cruciaal. Veel &quot;geoptimaliseerd&quot; western blotting methodieken zijn gebruikt door onafhankelijke laboratoria, die vaak blijken moeilijk op te zetten of te repliceren vanwege subtiele methodologische aanpassingen die niet duidelijk in formele gedocumenteerde protocollen kunnen zijn. Dit is een gevestigde en robuust protocol voor QFWB en bovendien geeft waardevolle strategieën voor het oplossen van gemeenschappelijke problemen that zich kunnen voordoen tijdens de uitvoering. Dit protocol werd oorspronkelijk geoptimaliseerd voor murine hersenhomogenaten, maar is sindsdien effectief gebruikt in een breed scala van weefselmonsters en soorten 4,9,10. Potentiële protocol variaties nodig zijn voor specifieke kwesties oplossen van problemen zijn inbegrepen.

```html
<table><tbody><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10230544</td><td></td></tr><tr><td>M Tubes</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>iBlot Transfer Stack, PVDF Regular</td><td>Life Technologies, UK</td><td>IB401001</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5602</td><td>Gebruik in gel 1 voor Western blotting</td></tr><tr><td>SeeBlue Pre-stained protein standard</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5625&nbsp;</td><td>Gebruik in gel 2 Totaal eiwit gestaind gel</td></tr><tr><td>NuPAge LDS Sample buffer 4x</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (alleen voor Bis-Tris Gels) (20x)</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline tablet</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA, Protein Assay Kit</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10249133</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey blocking buffer</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>P/N 927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg&nbsp;</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32214</td><td></td></tr><tr><td>ODYSSEY CL Infra-red imager</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>Bel voor offerte</td></tr><tr><td>iBlot 7-Minute Blotting System</td><td>Life technologies, UK</td><td></td><td>Dit model is niet langer in productie</td></tr><tr><td>InstantBlue Protein stain</td><td>Expedeon, UK</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Revitablot western blot stripping buffer&nbsp;</td><td>Rockland Immunochemicals Inc.</td><td>MB-085-0050</td><td></td></tr></tbody></table>
```

a guide to modern kwantitatieve tl western blotting met troubleshooting strategies

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

De late jaren 1970 zag de eerste publiekelijk gemeld gebruik van de western blot, een techniek voor de beoordeling van de aanwezigheid en relatieve rijkdom van specifieke eiwitten in complexe biologische monsters. Sindsdien heeft western blotting methode uitgegroeid tot een gemeenschappelijke component van de moleculaire biologen experimentele repertoire. Een vluchtige zoektocht van PubMed gebruik van de term &quot;Western Blot&quot; suggereert dat meer dan 220.000 gepubliceerde manuscripten gebruik van deze techniek hebben gemaakt in het jaar 2014. Belangrijk is, hebben de afgelopen tien jaar technische imaging vooruitgang in combinatie met de ontwikkeling gezien van fluorescente labels die verbeterde gevoeligheid en nog meer reeksen van lineaire detectie opgeleverd. Het resultaat is een nu echt Kwantificeerbaar Fluorescentie gebaseerd Western Blot (QFWB) waarmee biologen om vergelijkende expressie analyse uit te voeren met een grotere gevoeligheid en nauwkeurigheid dan ooit tevoren. Veel &quot;geoptimaliseerd&quot; western blottingmethoden bestaan ​​en worden gebruikt in verschillende laboratoria. Deze blijken vaak moeilijk uit te voeren als gevolg van de eis van subtiele maar ongedocumenteerde procedurele wijzigingen. Dit protocol biedt een uitgebreide beschrijving van een gevestigde en robuuste QFWB methode, compleet met strategieën voor probleemoplossing.

Als QFWB gevoeligheid en het lineaire detectiegebied groter dan conventionele ECL detectie, zijn er een aantal beperkende maatregelen die van cruciaal belang dat nauwkeurige gegevens verzameld zijn, waardoor doeltreffende interpretatie helpen. Enerzijds de opname van positieve controlemonsters zoals getoond in figuur 1. Ten tweede optimalisering overdracht gelijkwaardige verkeer van hoog en laag molecuulgewicht eiwitten garanderen van de gel naar het membraan als getoond in figuur 2. Ten derde optimalisatie van antilichamen, vooral secondaire antilichamen waarvan optimalisatie wordt vaak vergeten, maar die kan produceren niet-specifieke verbinden staat zijn te interfereren met de juiste interpretatie van eiwit (ten) van belang. Zie figuur 3. Vierde kan het ook zo dat wanneer een eiwit wordt detecteerbare maar zal aanwezig zijn, kan ook een secundair antilichaam daar kan worden gecorrigeerd door simpelweg met een secundair rais zijned in een andere soort gastheer. Zie figuur 4. Ten vijfde, totaal eiwit labeling en analyse is veel robuuster en kwantificeerbare wijze in vergelijking met het gebruik van traditionele enkel eiwit (en) die alomtegenwoordig tot expressie worden gebracht voor interne referentienormen 3. Veel van deze enkele eiwitten bleken verschillend tot expressie modellen van neurodegeneratieve ziekten en verschillende weefselmonsters en de uniformiteit van expressie binnen hetzelfde weefsel 3 wijzigen. Daarom zal de productie van een gel loading controle de uniformiteit van het monster lading te bevestigen wanneer samen met volledige eiwitanalyse door vergelijking met kwantificering van eiwit lading in elke laan op verschillende molecuulgewichten varieert afgemeten elk monster standaardfout geven zoals getoond in figuur 6 . Belangrijk al deze technieken en controles oplossen zijn zo effectief als de gevoeligheid en coherentie van de analyse tools door de operator (figuur 5) aangebracht. Tenslotte deze techniek leent zich strippen en opnieuw sonderen membranen flexibeler dan ECL door factoren waaronder maar niet beperkt tot verhoogde gevoeligheid, verlaagd achtergrond, bicolor detectie en membraan stabiliteit bij langdurige opslag. Zie Figuur 7.

De vooruitgang van westerse blotting met behulp van fluorescentie heeft de detectie van subtiele veranderingen in eiwitexpressie mogelijk gemaakt, waardoor kwantitatieve analyses mogelijk zijn. Hier beschrijven we een robuuste methodologie voor de detectie van een reeks eiwitten in verschillende soorten en weefselsoorten. Er wordt ook een strategie geboden om veelvoorkomende technische problemen te overwinnen.

A Guide to Modern Kwantitatieve TL Western Blotting met Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Het doel van deze procedure is om de relatieve abundantie van specifieke eiwitten binnen een complex biologisch monster te detecteren en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van kwantitatief, fluorescerend twist en blotting. Dit wordt bereikt door eerst eiwitextracten elektro-fluorescent te scheiden met behulp van een voorgevormde gradiëntgel. In de tweede stap wordt de equivalente eiwitlading geverifieerd over alle monsterbanen door de toepassing van een totale eiwitkleur en vervolgens wordt het eye block semi-droog snelle overdrachtssysteem gebruikt om de monsters over te brengen naar A-P-V-D-F membraan.Ten slotte worden de eiwitten onderzocht met specifieke primaire antilichamen gevolgd door het juiste fluorescerend getagde secundaire antilichaam om hun gevoelige, robuuste en lineaire detectie bij infrarood en verre rood golflengten te vergemakkelijken. Uiteindelijk kan kwantitatief fluorescerend westers bloeien worden gebruikt om reproduceerbaar een groot aantal membraangebonden en oplosbare eiwitten over een breed scala aan weefselmonsters te detecteren, visualiseren en nauwkeurig te kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals ECL-gebaseerde beeldvorming, is dat het een grotere gevoeligheid mogelijk maakt met verbeterde precisie op een brede lineaire schaal voor een echt kwantitatief resultaat. Begin door het weefselmonster handmatig te macereren, gevolgd door homogenisatie in vers bereid extractiebuffer bij ongeveer één tot 10 weefselgewicht per buffervolume tot een glad consistent homogenaat is geproduceerd.Centrifugeer vervolgens het cellysaat gedurende 20 minuten bij 20.000 keer G bij vier graden Celsius. Breng vervolgens de sate met de gesolubiliseerde eiwitten over in een schone microcentrifugebuis en bewaar zowel de pellet als de S-supernatantfracties op minus 80 graden Celsius tot ze nodig zijn. Na het bepalen van de eiwitconcentratie van de supinate, breng 15 microgram eiwit per monster over in nieuwe microcentrifugebuizen.Breng vervolgens het eindvolume van elk monster op tot 10 microliter met gedestilleerd water en voeg vijf microliter Forex-ladingsbuffer toe. Roer de celoplossingen grondig door middel van vortexen en verhit de monsters gedurende twee minuten tot 98 graden Celsius om de eiwitten te denatureren. Voeg na denaturatie drie microliter van een geschikt molecuulgewichtsstandaard toe in de eerste put van elk van de experimentele en ladingscontrolegels.Laad vervolgens 10 microliter van elk monster in de volgende geschikte putten na elektroforese. Gebruik een gelmes om de gels van de cassette te verwijderen en verwijder de putten en de voet van de gel. Markeer de gel om latere oriëntatie te vergemakkelijken.Bepaal vervolgens de equivalente eiwitlading door ongeveer 30 milliliter eiwitkleur in een vierkante 12 bij 12 centimeter Petrischaal te decanteren en plaats de ladingscontrolegel in de kleur, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de oplossing de hele gel bedekt. Roer de gel minimaal één uur op kamertemperatuur en gooi vervolgens de eiwitkleur weg en was de gel drie keer in gedestilleerd water voor visualisatie voor de eye block. Twee semi-droge snelle eiwitoverdracht Na elektroforese bereidt u de onderste overdrachtsstack voor door de folieafdekking te verwijderen en het membraan direct vanuit de geltank met loopbuffer voor te bevochtigen.Bevochtig ook het filterpapier met gedestilleerd water op dit moment. Plaats vervolgens de experimentele gel op de voorbereide onderste overdrachtsstack en leg vervolgens het vooraf bewerkte filterpapier over de gel en rol ze allebei om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen tussen de lagen vastzitten. Leg de bovenste stack op de filterpapier en de onderste stack.Rol vervolgens de overdrachtsstacksandwich om eventuele luchtbellen te elimineren. Plaats het sponsje uit het overdrachtsstackkit op de absorberende pad en plaats de overdrachtsstacksandwich in de speciale ruimte. Sluit vervolgens het deksel stevig en start de I block twee, overbreng de eiwitten gedurende zeven minuten op programma drie.Wanneer het programma is voltooid, verwijdert u de overdrachtsstack van de eye block-machine en pel de bovenste overdrachtsstack en filterpapierlagen terug om de gel op de onderste overdrachtsstack bloot te leggen. Gebruik een scalpel om rond de gel te snijden en zorg ervoor dat u een driehoekige snede maakt voor oriëntatie op de membraan volgend op het trimmen van de membraan om de overdrachtsefficiëntie te controleren. Kleur de gel zoals net gedemonstreerd en verplaats vervolgens snel de membraan in een schone 50 milliliterbuis met vijf milliliter PBS voor de eerste van drie, vijf minuten wassen op een mechanische rol. Na de derde wassing, gooi de wasbuffer weg en incubeer de membraan in onverdunde blokkeerbuffer gedurende minimaal 30 minuten bij kamertemperatuur.Incubeer vervolgens de membraan in primaire antilichaam verdund in vijf milliliter blokkeerbuffer en 0,1 tussen 20 overnacht bij vier graden Celsius met constante agitatie. De volgende ochtend, na het weggooien van de primaire antilichaamoplossing, was de membraan zes keer gedurende vijf minuten in PBS zoals net gedemonstreerd. Incubeer vervolgens de membraan in het donker met fluorescerend getagd secundair antilichaam, verdund in vijf milliliter blokkeerbuffer en 0,1%tussen 20 met constante agitatie, gevolgd door zes vijf minuten PBS-wassen voor alle beeldvorming.Meld u eerst aan bij de computer en imager. Open vervolgens de beeldvormingssoftware om de westerse blot af te beelden. Open eerst het deksel van de imager en giet een kleine hoeveelheid PBS op het glas.Plaats in de linkeronderhoek van de imager het membraan op het PBS en zorg ervoor dat het vierkant is met de as op de imager en dat er een opening van een centimeter is tussen het membraan en de rasteras. Rol het membraan om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen tussen het glas en het membraan vastzitten en tel vervolgens het aantal vierkanten dat het membraan op de x- en y-as inneemt. Sluit vervolgens het deksel van de imager en voer het aantal vierkanten in de computersoftware in.Selecteer het juiste infrarode kanaal en de juiste intensiteit en start de scan om de totale eiwitkleur van de ladingscontrolegel te visualiseren. Reparatie van de gel en de imager zoals net gedemonstreerd voor

a-guide-to-modern-quantitative-fluorescent-western-blotting-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze technische artikel beschrijft een standaard western-blot procedure met behulp van de commercieel verkrijgbare NuPAGE elektroforese Mini-Gel systeem van Invitrogen.

Western blotting Met behulp van de Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels

Western blotting is een analytische techniek die gebruikt wordt om specifieke eiwitten te detecteren in een monster van weefsel homogenaat of het uittreksel.

Western Blotting: Monstervoorbereiding naar Detectie

The video demonstrates a total protein normalization-based western blotting technique for quantifying the target protein expression in a sample. By utilizing the total protein staining of the sample, a ratiometric analysis is performed to determine the relative expression level of the target protein.

Quantitative Western Blotting to Estimate Protein Expression Levels

This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

V3 workflow is een westerse vlek procedure met behulp van vlekvrije gels. De vlekvrije technologie stelt onderzoekers in staat om de kwaliteit van eiwitscheiding te visualiseren, de overdrachtsefficiëntie te verifiëren en vooral om de verandering in het eiwit van belang te valideren met behulp van totale eiwitkwantificering als een betrouwbare belastingscontrole.

V3 Vlekvrije workflow voor een praktische, handige en betrouwbare totale eiwitbelastingscontrole in Western Blotting

Dit protocol verkent de nieuwste ontwikkelingen in het uitvoeren van Western blot analyses. Deze nieuwe modificaties maken gebruik van een Bis-Tris gel systeem met een 35 min elektroforese looptijd, een 7 minuten droge blotting transfersysteem en infrarood fluorescerend eiwit en beeldvorming dat hogere resolutie, kwaliteit, gevoeligheid en verbeterde nauwkeurigheid van Western gegevens genereert.

De snelste West in de stad: Een eigentijdse variant op de klassieke Western Blot analyse

We beschrijven het gebruik van kwantitatieve immunoblotting te valideren immunofluorescentie histologie beeldanalyse wordt gekoppeld als een middel voor het kwantificeren van een proteïne van belang in formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE). Onze resultaten tonen aan dat het nut van immunofluorescentie histologie voor het vaststellen van de relatieve hoeveelheid biomerker eiwitten in routine biopsie monsters.

Kwantitatieve Immunoblotting van cellijnen als een standaard voor het valideren van de immunofluorescentietest voor het kwantificeren van Biomarker eiwitten in Routine weefselsteekproeven

Deze methode beschrijft een robuuste en reproduceerbare aanpak voor het vergelijken van eiwitniveaus in verschillende weefsels en bij verschillende ontwikkelings timepoints met behulp van een kwantitatieve westelijke bevlekkende standaardbenadering.

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Een ultrasnelle westerse blotting-techniek wordt ontwikkeld door de kinetiek van antigeen-antilichaambinding te verbeteren door middel van cyclische draining- en replenishing (CDR)-technologie in combinatie met een immunoreactieverhogend middel.

Ultra-High-Speed Western Blot met behulp van Immunoreaction Enhancing Technology

Met behulp van Luminex Corporation xMAP microsfeer technologie, hebben we de multiplexverzending fluorometrische immunoassay (MFIA) voor serologische tests van de verschillende proefdier. De MFIA een suspensie microarray waar antigen, weefselcontrole of immunoglobulinen covalent gekoppeld aan gekleurde polystyreen microsferen. De MFIA testmethode, evenals verschillende onderwerpen voor problemen oplossen is gericht.

Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen

Leer kwantitatieve fluorescentie western blotting voor eiwitdetectie en -kwantificatie in biologische monsters. Deze methode biedt hogere gevoeligheid en precisie dan traditionele ECL-gebaseerde technieken voor betrouwbare resultaten.

A Guide to Modern Kwantitatieve TL Western Blotting met Troubleshooting Strategies

Meer video's verkennen