Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis
January 12th, 2015
De transcriptionele heterogeniteit binnen humane adipogeen-afgeleide stromale cellen kan op enkelcellig niveau worden gedefinieerd met behulp van celoppervlaktemarkers en osteogene genen. We beschrijven een protocol dat flowcytometrie gebruikt voor de isolatie van celsubpopulaties met verhoogd osteogeen potentieel, die kunnen worden gebruikt om craniofaciale skeletreconstructie te verbeteren.
Het algemene doel van deze procedure is om subpopulaties van humane adipogeen-afgeleide stamcellen te isoleren met verbeterd osteogeen potentieel met behulp van stromingsgeassisteerde cytometrie om dit te bereiken. Humane adipogeen-afgeleide stamcellen of ASC's worden geoogst uit menselijk lipo-aspiraat en 36 uur gekweekt. De cellen worden vervolgens gekleurd met antilichamen geselecteerd om pros osteogene populaties te labelen en de gewenste populaties worden geïsoleerd met behulp van stromingsgeassisteerde cytometrie.
Uiteindelijk onthullen alkalische fosfatase en azarinekleuring een verbeterd osteogeen potentieel van de geïsoleerde cellen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot regeneratieve geneeskunde en de ontwikkeling van nieuwe translationele therapieën omdat het beschrijft hoe een subpopulatie van ASC's met verbeterde osteogenese kan worden geïsoleerd. De volgende procedure wordt uitgevoerd met behulp van menselijk subcutaan vetweefsel van gezonde vrouwelijke patiënten die een electieve lipo-aspiratie van de buik, flank en/of dijregio hebben ondergaan onder lokale of algemene anesthesie.
Begin met 500 milliliter tot één liter weefsel in een zuigcanule rechtstreeks genomen uit de operatiekamer. Begin onmiddellijk na het verzamelen met de oogstprocedure. Dit zal de cellevensvatbaarheid maximaliseren om de stromale vasculaire fractie of SVF uit het lipo-geaspireerde vetweefsel te verkrijgen. Begin door steriel PBS toe te voegen in een verhouding van één op één.
Schakel vervolgens voorzichtig de canule om te mengen. Na het mengen. Laat de oplossing staan totdat deze in drie lagen scheidt.
De bovenste olie laag is helder en geel. De middelste vetlaag is een viskeuze, ondoorzichtige en gele, en de onderste bloedlaag is rood. Gebruik voorzichtig een serologische pipet om de onderste bloedlaag af te zuigen en weg te gooien, en de bovenste olie laag af te zuigen.
Herhaal dit vervolgens. Was nog twee keer. Na het bereiden van de collageenase-verteringsbuffer en faxbuffer zoals beschreven in het bijbehorende document, plaats ze in de kap samen met de rode bloedcel-lysebuffer zodat ze kunnen opwarmen tot kamertemperatuur.
Breng vervolgens het gewassen vetweefsel over in een grote kolf en verteer het bij een gelijk volume van collageenase-verteringsbuffer. Plaats de kolf stevig in een schuddend waterbad gedurende 60 minuten. Bij 37 graden Celsius.
Het is het beste om een groter volume verteringsvat te gebruiken dan vereist, omdat dit maximale vertering tijdens het schudden mogelijk maakt. Bijvoorbeeld, 250 ml collageenase-verteringsbuffer en 250 ml gewassen vetweefsel moeten in een steriele 1 liter kolf worden geplaatst. Neutraliseer na de incubatie de enzymatische activiteit door een gelijk volume faxbuffer toe te voegen en laat het weefsel vijf minuten op kamertemperatuur staan.
Breng vervolgens het gedigesteerde weefsel over naar een wegwerpbare conische centrifugeerbuis van 250 milliliter en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 233 Gs of 233 Gs gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Na het centrifugeren, zuig de supernatant op en resuspendeer het pellet door vijf tot 10 milliliter traditioneel groeimedium toe te voegen, afhankelijk van de grootte van het pellet.
Pipet vervolgens de suspensie door een 100 micrometer nylon celzeef in een 50 milliliter conische buis om eventueel cellulair puin te verwijderen. Na het weggooien van de supernatant zou het palet er zo uit moeten zien. Hier, resuspendeer het palet in 10 milliliter kamertemperatuur.
Rode lysebuffer. Laat de oplossing vijf minuten op kamertemperatuur staan en centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 233 Gs op kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 233 Gs op vier graden Celsius en gooi de snat weg zonder het pellet te verstoren.
Resuspendeer vervolgens het pellet in vijf tot tien milliliter traditioneel groeimedium, afhankelijk van de grootte van het pellet. Tel de cellen en plaats 2 miljoen cellen in een 10 centimeter standaard kweekschaal en stel primaire culturen over nacht op.
Bewaar de SVF-cellen op subconfluente niveaus om spontane differentiatie te voorkomen. 36 uur na het zaaien, lift de cellen op met Accutane volgens het protocol van de fabrikant. Was de cellen eenmaal met faxbuffer en centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 233 Gs op vier graden Celsius.
Na het centrifugeren, gooi de snat weg zonder het pellet te verstoren. Resuspendeer de cellen in 0,5 tot één milliliter effects.Buffer. Tel de cellen met behulp van een hemo cytometer.
Wijd 1,2 miljoen cellen toe aan een niet-gesorteerde groep die afzonderlijk wordt geplaatst als controle. Voor dit experiment, breng 100 microliter kwats over in één 1,5 milliliter einor buis. Bereid voor elk te analyseren monster één ongekleurd monster plus enkele kleurcontroles voor voor elk van de te gebruiken antilichamen en plaats ze op ijs.
Label vervolgens de osteogene subpopulatie door anti CD 90 of anti CD 1 0 5 te verdunnen in faxbuffer om de andere celpopulaties zoals hematopoëtische en endotheelcellen te labelen, verdun anti CD 45, anti CD 34 en/of anti CD 31 in faxbuffer. Na de incubatie, was de cellen tweemaal door de buizen te vullen met faxbuffer en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 233 Gs op vier graden Celsius. Na het centrifugeren, zuig de snat weg na de tweede wassing, resuspendeer de cellen in 400 tot 500 microliters van effects.
Buffer filter de monsters door een 70 micrometer nylon celzeef in een centrifugeerbuis om celklonten te verwijderen. Voer fluorescentiegeactiveerde celsortering uit zoals beschreven in het bijbehorende protocol. Gebruik fact software om analyseplots te ontwerpen om voorwaartse verstrooiing, zijwaartse verstrooiing, fico, eryn, Texas Red Pacific Blue fluoresceine isothiocyanaat, allof cyanide en elke andere Fluor vier te onderzoeken die wordt gebruikt om cellen te labelen.
Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat fact analyseplots correct worden getekend om niet per ongeluk de gewenste celpopulaties uit te sluiten. Sorteer de gelabelde celpopulaties naar
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie beschrijft een protocol voor het isoleren van subpopulaties van humane adipogeen afgeleide stamcellen (ASC's) met verbeterd osteogeen potentieel met behulp van flowcytometrie. De methode omvat het kleuren van cellen met specifieke antilichamen en het analyseren ervan om populaties te identificeren die geschikt zijn voor craniofaciale skeletreconstructie.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Regeneratieve geneeskunde
- Celbiologie
- Weefselengineering
Achtergrond
- Menselijke adipogeen afgeleide stamcellen (ASC's) zijn waardevol voor regeneratieve therapieën.
- Osteogeen potentieel is cruciaal voor toepassingen in craniofaciale reconstructie.
- Flowcytometrie maakt de isolatie van specifieke celpopulaties mogelijk.
- Begrip van transcriptionele heterogeniteit kan therapeutische resultaten verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om ASC's met verhoogd osteogeen potentieel te isoleren.
- Om flowcytometrie te gebruiken voor nauwkeurige identificatie van celpopulaties.
- Om bij te dragen aan vooruitgang in regeneratieve geneeskunde.
Gebruikte methoden
- Het verzamelen van ASC's uit menselijke lipo-aspiraat.
- Het kweken van cellen gedurende 36 uur voorafgaand aan analyse.
- Het kleuren van cellen met antilichamen die gericht zijn op osteogene markeringen.
- Het isoleren van gewenste celpopulaties met behulp van flowcytometrie.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van subpopulaties met verbeterd osteogeen potentieel.
- Succesvolle isolatie van cellen bevestigd door alkalische fosfatase en azarin kleuring.
- Gedemonstreerde implicaties voor craniofaciale skeletreconstructie.
- Mogelijke toepassingen in de ontwikkeling van nieuwe translationele therapieën.
Conclusies
- Het protocol isoleert effectief ASC's met verbeterde osteogene capaciteiten.
- Deze techniek kan regeneratieve geneeskundepraktijken bevorderen.
- Toekomstig onderzoek kan bredere toepassingen van geïsoleerde celpopulaties verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolating adipose-derived stromal cell subpopulations with enhanced osteogenic capacity addresses a key bottleneck in regenerative medicine: the need for reliable, scalable cell sources for bone tissue engineering. By enriching for CD90+/CD105low phenotypes using flow cytometry, this method improves predictive confidence in osteogenic differentiation outcomes, supporting preclinical de-risking for craniofacial and skeletal defect therapies. The approach enables translational continuity from cell source to functional validation, reducing reliance on bone marrow-derived MSCs and mitigating donor morbidity concerns in allogeneic and autologous therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stromal heterogeneity to identify osteoprogenitor-enriched subpopulations within adipose-derived stromal cells.
- Operational Value: Provides a reproducible flow cytometry-based strategy to isolate functionally validated cell subsets for mechanistic studies.
- Scientific Value: Supports target validation by linking surface marker expression (CD90+/CD105low) to enhanced osteogenic potential, clarifying biomarker relevance in MSC populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified, phenotype-defined ASC subpopulations suitable for standardized osteogenic differentiation assays.
- Operational Value: Enables assay standardization through consistent cell input, reducing variability in alkaline phosphatase and Alizarin red readouts.
- Scientific Value: Supports assay development by providing a defined biological system with quantifiable mineralization outputs for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through enhanced extracellular matrix mineralization in calvarial defect models, supporting preclinical efficacy evaluation.
- Operational Value: Enables continuity from isolation to functional validation, facilitating translational biomarker alignment via osteogenic readouts.
- Scientific Value: Contributes to mechanistic de-risking by isolating cells with proven osteogenic capacity, reducing uncertainty in regenerative therapy outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling early isolation of functionally validated stromal cells, supporting lead identification in regenerative medicine programs through predictive osteogenic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling prospective isolation of osteoprogenitor-enriched ASC subpopulations based on surface marker profiles.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized cell populations with reproducible differentiation capacity for compound or biomaterial screening.
- Analytics: Provides quantitative, image-based readouts (alkaline phosphatase, Alizarin red) that enable objective comparison of osteogenic potential across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through demonstrated mineralization in osteogenic media, supporting continuity to in vivo defect models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cell isolation and validation platform applicable across multiple adipose-derived therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in osteogenic differentiation by enriching for functional subpopulations, reducing false-negative outcomes in preclinical screening.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized isolation, staining, and sorting workflows using flow cytometry.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, quantitative assessment of osteogenic capacity, reducing late-stage biological risk in tissue engineering programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ASC-based therapies by identifying donors or processing conditions with superior osteogenic yield.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, antibody staining, and sterile primary cell culture techniques.
- Dependent on access to flow cytometers with appropriate fluorescence compensation and sorting capabilities.
- Necessitates standardized protocols for adipose tissue processing, enzymatic digestion, and red blood cell lysis to ensure consistent SVF yield.
- Requires adaptation considerations when applying to different adipose sources (e.g., visceral vs. subcutaneous) or cryopreserved samples.
- Limited by donor variability in ASC frequency and osteogenic potential, necessitating pre-screening or functional validation post-isolation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:06
Cell Isolation and Culture
4:52
Staining and Cell Sorting
8:37
Isolation of Human Adipose-derived Stromal Cells with Increased Osteogenic Potential
8:37
Results: Isolation of Human Adipose-derived Stromal Cells with Increased Osteogenic Potential
10:30
Conclusion
