Name: Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Leer de isolatie van menselijke adipose-afgeleide stromale cellen met verhoogde osteogene potentie via flowcytometrie. Deze methode ondersteunt regeneratieve geneeskunde en craniale reconstructie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health Research subsidie ​​R01-DE021683-01 en de National Institutes of Health Research subsidie ​​R01-DE019434 aan MTL; Howard Hughes Medical Institute Research Fellowship aan MTCDCW werd gesteund door de ACS Franklin Martin Faculty Research Fellowship, De Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, en de Stanford University Child Health Research Institute Faculteit Scholar Award.

OPMERKING: Alle patiënten monsters werden verkregen met informed consent, en experimentele protocollen werden beoordeeld en door Stanford University Institutional Review Board (Protocol # 2188 en # 9999) goedgekeurd. 1. Cell Isolatie en Cultuur: <ol><li> Verkrijgen menselijk onderhuids vetweefsel van gezonde vrouwelijke patiënten die een electieve lipoaspiration de buik, flank, en / of de dij regio onder plaatselijke / algemene verdoving. Zorg ervoor dat Institutional Review Board (IRB) goedkeuring is verkregen voor het protocol van het isoleren van ASC&#39;s van menselijke weefsels en volg voorzorgsmaatregelen institutionele veiligheid tijdens het werken met deze stoffen. </li><li> De SVF uit de lipoaspirated vetweefsel verkrijgen wassen op de lipoaspirate driemaal met gelijke volumina 1x steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Zorgvuldig te zuigen en de onderste waterlaag weggooien. </li><li> Bereid de collagenase spijsvertering buffer: 0,075% type I collagenase in Hank&#39;sBalanced Salt Solution (HBSS). Bereid FACS-buffer: 2% FBS, 1% P188 en 1% Pen-Strep in PBS. Filter beide oplossingen met behulp van een in de handel verkrijgbaar 0,22 pm poriegrootte snelle doorstroming polyethersulfone filter. </li><li> De gewassen vetweefsel verteren, voeg een gelijk volume van collagenase digestie buffer en plaats ontsluitvat stevig in een schuddend waterbad gedurende 60 minuten bij 37 ° C (ongeveer 180 shakes / min). LET OP: Het beste is om een groter volume ontsluitvat gebruiken dan nodig is, omdat dit zorgt voor maximale vertering tijdens het schudden (dat wil zeggen, 250 ml collagenase spijsvertering buffer, 250 ml gewassen vetweefsel in een 1L steriele kolf). </li><li> Neutraliseer enzymatische activiteit door toevoeging van een gelijk volume FACS buffer en waardoor zitten bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Vervolgens centrifuge bij 233 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. </li><li> Zorgvuldig aspireren en gooi het supernatant, het verzorgen van de high-density SVF pellet niet te verstoren. </li><li> Resuspendeer de pellet in 5-10 ml RT roodcellysis buffer basis van korrelgrootte. Laat oplossing zitten bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en centrifugeer bij 233 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig supernatant en resuspendeer de pellet door het toevoegen van 5-10 ml van de traditionele groeimedia, gebaseerd op korrelgrootte (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% penicilline-streptomycine oplossing [pen-strep]). </li><li> Filter de suspensie door een 100 um nylon cel zeef om cellulaire vuil te verwijderen. </li><li> Centrifugeer bij 233 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren. </li><li> Resuspendeer de pellet in 5-10 ml traditionele groeimedia basis van korrelgrootte. </li><li> Plaats 2 x 10 6 cellen in een 15 cm kweekschaal standaard en primaire kweken O / N vast bij 37 ° C / 21% O2, 5% CO2. Handhaaf op sub-samenvloeiende niveaus spontane differentiatie bij 37 ° C / 21% O2, 5% CO2 in groeimedia voorkomen. OPMERKING: Celdichtheid in een volledigsamenvloeiende 15 cm plaat is ongeveer 4-6 x 10 6 cellen. </li></ol> 2. kleuring <ol><li> Cultuur ASC in traditionele groeimedium bij 37 ° C / 21% O2, 5% CO2 gedurende 36 uur voor kleuring / sortering. </li><li> Lift ASC uit selkweekplaten behulp Accutase (volgens het protocol van de fabrikant). </li><li> Was de cellen eenmaal met FACS buffer (PBS met 2% FBS en 1% pen-strep). </li><li> Centrifugeer bij 233 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Giet het supernatans zonder verstoring van de pellet. Resuspendeer de cellen in 0.5-1 ml FACS buffer (afhankelijk van het aantal cellen en de hoeveelheid antilichaam gewenst). Opmerking: Het volume van de celsuspensie, overeenkomstig aanbevelingen van de fabrikant FACS antilichaam bepaalt antilichaamconcentratie. Echter, titratie van antilichaamconcentratie, met een beginconcentratie van 1: 100 wordt gewoonlijk aangeraden als het de eerste keer een antilichaam te gebruiken. </li><li> Tel het aantalcellen met een hemocytometer. </li><li> Reserve 100 ul aliquots in 1,5 ml centrifugebuizen worden gebruikt voor een ongekleurde monster en eenkleurige controles (afhankelijk van het aantal fluorescente antilichamen gebruikt). </li><li> Voeg de juiste fluorescent gemerkte monoklonale antilichamen (met vooraf bepaalde concentraties instructies van de fabrikant) en incubeer gedurende 20-30 minuten op ijs, afgeschermd van licht. <ol><li> Osteogene subpopulatie labelen: Verdun anti-CD90 (APC anti-humaan CD90 (Thy1)) of anti-CD105 (FITC anti-humaan CD105 (endoglin)) in FACS-buffer tot een concentratie van 1:50. </li><li> Voor andere celpopulaties (bijvoorbeeld hematopoietische en endotheelcellen) label: Verdun anti-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (anti-menselijk CD34 APC), en / of anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) in FACS buffer tot een concentratie van 1:50. </li><li> Als u geen direct geconjugeerde antilichamen, gebruik dan een gebiotinyleerd primair antilichaam met een passende streptavidine- geconjugeerde tweedeary antilichaam, zoals Streptavidine PE-Cy7, bij een verdunning van 1: 100. </li></ol></li><li> Na incubatie was de cellen tweemaal: vul buizen met FACS buffer en centrifugeer bij 233 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, bovenstaande vloeistof opzuigen. </li><li> Resuspendeer de cellen in 400-500 pi FACS buffer en filter monsters door een 70 micrometer nylon zeef cel naar cel klonten te verwijderen. </li><li> Overdracht gelabelde cellen in FACS buisjes met filter dak en houdt monsters op ijs voor de duur van de analyse. </li></ol> 3. fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting OPMERKING: De volgende stappen mandaat voorkennis in fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) of de hulp van een vakman. <ol><li> Met behulp van de juiste FACS software, ontwerp analyse percelen aan voorwaartse verstrooiing (FSC), zijwaartse verstrooiing (SSC) te onderzoeken, fycoerythrine (PE) -Texas Rood, Pacific Blue, fluoresceïneisothiocyanaat (FITC), allophycocyanine (APC) en eventuele andere fluorofoor gebruikd om cellen te labelen. </li><li> Voorafgaand aan het laden in de cel sorter, kort vortex elk monster om de cellen opnieuw in suspensie. </li><li> Beginnen met een analyse van de niet-gekleurde monster om poorten te stellen voor de totale celpopulatie, cellulaire puin uit te sluiten, en de uitgangswaarde autofluorescentie bepalen. </li><li> Voeg propidium jodide (PI) aan de ongekleurde monster en analyseren om de populatie van levende cellen te visualiseren in de totale celpopulatie. De bouw van een hek rondom deze populatie. </li><li> Analyseer een eenkleurige controlemonster voor elke fluorochroom om fluorescentie schadevergoeding in te stellen. </li><li> Analyseer de gekleurde monster om de positie van de poorten voor het sorteren. </li><li> PI toe te voegen aan het gekleurde monster om dode cellen te kleuren. </li><li> Sorteer de gelabelde cel populaties. Sorteren op hetzij 1,5 ml centrifugebuizen of conisch (15 ml) kweekmedium. </li><li> Handmatig ophouden sorteren zodra de benodigde hoeveelheid cellen is verkregen. </li><li> Onsing FACS, voeren een zuiverheid controle door het analyseren van een kleine fractie (bijv., 500 cellen) van de overgenomen celpopulatie. OPMERKING: Deze stap bevestigt de zuiverheid van de gesorteerde celpopulaties. Idealiter zuiverheid van meer dan 90-95%. </li><li> Centrifugeer cellen bij 233 g gedurende 5 min bij 4 ° C onmiddellijk na de voltooiing van sorteren en resuspendeer in 1 ml vers medium bevattende 10% FBS. OPMERKING: De hoeveelheid gebruikte medium kan worden verhoogd op basis van de grootte van de cel pellet. </li><li> Plaat gelatine beklede platen om cellevensvatbaarheid te verbeteren. Afhankelijk eindcelconcentratie opbrengst plaat 300.000 cellen per putje in een 6-wells plaat, 100.000 cellen per putje in een 12-wells plaat. </li></ol>

<ol><li>Narsinh, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).</li>
<li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298, 580-584 (2002).</li>
<li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+profiling+in+individual+hematopoietic+progenitors+by+digital+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).</li>
<li>Warren, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+instability+is+not+a+universal+attribute+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional instability is not a universal attribute of aging.</a> Aging Cell. 6, 775-782 (2007).</li>
<li>Aalami, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+mouse+model+of+calvarial+healing%3A+differences+in+regenerative+abilities+of+juveniles+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults.</a> Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD105+protein+depletion+enhances+human+adipose-derived+stromal+cell+osteogenesis+through+reduction+of+transforming+growth+factor+beta1+%28TGF-beta1%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).</li>
<li>Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+antigen+expression+by+cells+in+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage.</a> J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).</li>
<li>Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+vitamin+D%2C+retinoic+acid%2C+and+dexamethasone+in+mouse+adipose-derived+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells.</a> Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depot-specific+variation+in+the+osteogenic+and+adipogenic+potential+of+human+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells.</a> Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).</li>
<li>James, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen%2Festrogen+receptor+alpha+signaling+in+mouse+posterofrontal+cranial+suture+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion.</a> PloS one. 4, e1720(2009).</li>
<li>Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+human+adipose-derived+stem+cells%3A+separating+promise+from+clinical+need%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need.</a> Stem Cells. 29, 404-411 (2011).</li>
<li>Glotzbach, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Information+Theoretic%2C+Microfluidic-Based+Single+Cell+Analysis+Permits+Identification+of+Subpopulations+among+Putatively+Homogeneous+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells.</a> PLoS One. 6, e21211(2011).</li>
<li>Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+isolation+of+adipose-derived+stem+cells+from+human+lipoaspirates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates.</a> J. Vis. Exp. , e50585(2013).</li>
<li>Mitchell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24, 376-385 (2006).</li>
<li>McMurray, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surfaces+for+the+long-term+maintenance+of+mesenchymal+stem+cell+phenotype+and+multipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency.</a> Nat Mater. 10, 637-644 (2011).</li>
<li>Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+and+transcriptional+characterization+of+human+adipose-derived+adherent+stromal+%28hADAS%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells.</a> Stem Cells. 23, 412-423 (2005).</li>
<li>McIntosh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunogenicity+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro.</a> Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).</li>
<li>Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age+negatively+impacts+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation.</a> Journal of translational medicine. 12, 8(2014).</li>
<li>Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem%2Fprogenitor+cells%3A+roles+in+adipose+tissue+remodeling+and+potential+use+for+soft+tissue+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation.</a> Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).</li>
<li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90+%28Thy-1%29+Positive+Selection+Enhances+Osteogenic+Capacity+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells.</a> Tissue Eng Part A. , (2012).</li>
</ol>

Geen van de auteurs een financieel belang in elk van de producten, inrichtingen, of dit manuscript vermelde geneesmiddelen. Geen van de auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te melden.

Momenteel is de isolatie van homogene subpopulaties van ASC&#39;s uit de SVF van menselijk vetweefsel blijft een uitdagende wel wenselijk doel. Isolatie van pro-osteogene ASC subpopulaties is bijzonder wenselijk, omdat dergelijke cellen kunnen worden gebruikt om de vorming en homeostase van skeletale weefsels te bestuderen. De SVF van vetweefsel herbergt opmerkelijke heterogeniteit wat celcapaciteit en differentiatie potentieel stam. 11 De moleculaire basis voor deze heterogeniteit is niet begrepen worden uit...

De heterogene aard van stamcelpopulaties is nog niet volledig begrepen en blijft een grote belemmering voor de ontwikkeling van klinisch effectieve stamcel-gebaseerde therapeutische toepassingen. Een van de meest gebruikelijke manieren om een heterogene populatie van stamcellen te karakteriseren, is door een celsorteermethode te gebruiken, zoals fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), om cellen te scheiden op basis van hun profielen van oppervlaktemarkerexpressie. Naarmate sorteermethoden complexer worden, wordt het mogelijk om meer verschillende functionele subpopulaties van cellen te identificeren. Microfluidische technologieën worden steeds vaker gebruikt bij de analyse van genexpressie op het niveau van één enkele cel. Multiplexed kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) binnen een microfluïdische chip maakt effectieve en betrouwbare hoog-resolutie, transcriptionele analyse op celniveau mogelijk.1-5
In een eerdere studie met behulp van transcriptionele profilering van 48 genen op celniveau, werd aanzienlijke transcriptionele heterogeniteit waargenomen onder ASC's.6 De verdeling van de genen MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 vertoonde echter een sterke associatie met een cluster van cellen met zeer osteogene transcriptionele profielen. Om cellen te isoleren volgens dit osteogene genexpressieprofiel, werden oppervlakte-antigeenexpressiepatronen gecorreleerd met transcriptiepatronen en werd vervolgens ontdekt dat de expressie van het oppervlaktemerker endogline (CD105) nauw correleerde met een verbeterd osteogeen differentiatiepotentieel van ASC's. Onafhankelijk van CD105-expressie, werd ook de expressie van het oppervlaktereceptor Thy-1 (CD90), een glycosyl-fosfatidylinositol-gekoppeld membraaneiwit dat eerder door Chen et al. werd geassocieerd met osteoprogénitorcellen, gecorreleerd met osteogene genexpressie.6,7 Deze bevindingen bieden de mogelijkheid om prospectief subpopulaties te isoleren binnen de grotere heterogene pool van ASC's met verhoogde osteogene capaciteit voor cel-gebaseerde botweefsel engineering toepassingen.

<table><tbody><tr><td>Disposable 250 ml Conical Tubes</td><td>Corning (Thomas Scientific)</td><td>2602A43</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution</td><td>Purdue&nbsp;</td><td>PFC-67618015017</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution, 1X</td><td>Cellgro</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from&nbsp;Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-5G</td><td></td></tr><tr><td>ACCUTASE Cell Detachment Solution</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>48-9459-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD34 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0349-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II instrument</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en verrijking van human adipose-afgeleide stromale cellen voor enhanced osteogenesis

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Mesenchymale stromale cellen afkomstig uit beenmerg (BM-MSC's) worden beschouwd als de gouden standaard voor op stamcellen gebaseerde toepassingen in weefselengineering. Echter, het proces waardoor ze moeten worden geoogst, kan gepaard gaan met aanzienlijke morbiditeit op de donorplaats. In tegenstelling daarmee zijn vetafgeleide stromale cellen (ASC's) gemakkelijker beschikbaar en gemakkelijker te oogsten, waardoor ze een aantrekkelijke alternatief voor BM-MSC's vormen. Net als BM-MSC's kunnen ASC's differentiëren in osteogene lijncellen en kunnen worden gebruikt in weefselengineering toepassingen, zoals het zaaien op skeletten voor gebruik bij craniofaciale skeletdefecten. ASC's worden verkregen uit de stromale vasculaire fractie (SVF) van verteerd vetweefsel, wat een heterogene mix is van ASC's, vasculaire endotheel- en muurcellen, gladde spiercellen, pericyten, fibroblasten en circulerende cellen. Flowcytometrische analyse heeft aangetoond dat het oppervlaktemarkerprofiel voor ASC's vergelijkbaar is met dat voor BM-MSC's. Ondanks verschillende gepubliceerde rapporten die markers voor het ASC-fenotype vaststellen, is er nog steeds gebrek aan consensus over profielen die osteoprogenitorcellen identificeren in deze heterogene populatie. Dit protocol beschrijft hoe een subpopulatie van ASC's met verhoogde osteogene capaciteit kan worden geïsoleerd en gebruikt om kritisch-grootte calvariale defecten te repareren.

Met CD90 als een merker voor cellen met verhoogde osteogenesis leidt tot isolatie van een sterk verrijkte populaties van humane ASC (Figuur 1A, 1B). ASC werden gekleurd met Pacific Blue-geconjugeerd anti-humaan CD45 FITC-geconjugeerd anti-humaan CD105 en APC-geconjugeerd anti-humaan CD90. Na het sorteren, de zuiverheid groter dan 98%, zoals gekwantificeerd door post-sort analyse. Het definiëren van groepen van cellen op basis van transcriptionele profielen toegestaan ​​voor ...

De transcriptionele heterogeniteit binnen humane adipogeen-afgeleide stromale cellen kan op enkelcellig niveau worden gedefinieerd met behulp van celoppervlaktemarkers en osteogene genen. We beschrijven een protocol dat flowcytometrie gebruikt voor de isolatie van celsubpopulaties met verhoogd osteogeen potentieel, die kunnen worden gebruikt om craniofaciale skeletreconstructie te verbeteren.

Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Het algemene doel van deze procedure is om subpopulaties van humane adipogeen-afgeleide stamcellen te isoleren met verbeterd osteogeen potentieel met behulp van stromingsgeassisteerde cytometrie om dit te bereiken. Humane adipogeen-afgeleide stamcellen of ASC's worden geoogst uit menselijk lipo-aspiraat en 36 uur gekweekt. De cellen worden vervolgens gekleurd met antilichamen geselecteerd om pros osteogene populaties te labelen en de gewenste populaties worden geïsoleerd met behulp van stromingsgeassisteerde cytometrie.Uiteindelijk onthullen alkalische fosfatase en azarinekleuring een verbeterd osteogeen potentieel van de geïsoleerde cellen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot regeneratieve geneeskunde en de ontwikkeling van nieuwe translationele therapieën omdat het beschrijft hoe een subpopulatie van ASC's met verbeterde osteogenese kan worden geïsoleerd. De volgende procedure wordt uitgevoerd met behulp van menselijk subcutaan vetweefsel van gezonde vrouwelijke patiënten die een electieve lipo-aspiratie van de buik, flank en/of dijregio hebben ondergaan onder lokale of algemene anesthesie.Begin met 500 milliliter tot één liter weefsel in een zuigcanule rechtstreeks genomen uit de operatiekamer. Begin onmiddellijk na het verzamelen met de oogstprocedure. Dit zal de cellevensvatbaarheid maximaliseren om de stromale vasculaire fractie of SVF uit het lipo-geaspireerde vetweefsel te verkrijgen. Begin door steriel PBS toe te voegen in een verhouding van één op één.Schakel vervolgens voorzichtig de canule om te mengen. Na het mengen. Laat de oplossing staan totdat deze in drie lagen scheidt.De bovenste olie laag is helder en geel. De middelste vetlaag is een viskeuze, ondoorzichtige en gele, en de onderste bloedlaag is rood. Gebruik voorzichtig een serologische pipet om de onderste bloedlaag af te zuigen en weg te gooien, en de bovenste olie laag af te zuigen.Herhaal dit vervolgens. Was nog twee keer. Na het bereiden van de collageenase-verteringsbuffer en faxbuffer zoals beschreven in het bijbehorende document, plaats ze in de kap samen met de rode bloedcel-lysebuffer zodat ze kunnen opwarmen tot kamertemperatuur.Breng vervolgens het gewassen vetweefsel over in een grote kolf en verteer het bij een gelijk volume van collageenase-verteringsbuffer. Plaats de kolf stevig in een schuddend waterbad gedurende 60 minuten. Bij 37 graden Celsius.Het is het beste om een groter volume verteringsvat te gebruiken dan vereist, omdat dit maximale vertering tijdens het schudden mogelijk maakt. Bijvoorbeeld, 250 ml collageenase-verteringsbuffer en 250 ml gewassen vetweefsel moeten in een steriele 1 liter kolf worden geplaatst. Neutraliseer na de incubatie de enzymatische activiteit door een gelijk volume faxbuffer toe te voegen en laat het weefsel vijf minuten op kamertemperatuur staan.Breng vervolgens het gedigesteerde weefsel over naar een wegwerpbare conische centrifugeerbuis van 250 milliliter en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 233 Gs of 233 Gs gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Na het centrifugeren, zuig de supernatant op en resuspendeer het pellet door vijf tot 10 milliliter traditioneel groeimedium toe te voegen, afhankelijk van de grootte van het pellet.Pipet vervolgens de suspensie door een 100 micrometer nylon celzeef in een 50 milliliter conische buis om eventueel cellulair puin te verwijderen. Na het weggooien van de supernatant zou het palet er zo uit moeten zien. Hier, resuspendeer het palet in 10 milliliter kamertemperatuur.Rode lysebuffer. Laat de oplossing vijf minuten op kamertemperatuur staan en centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 233 Gs op kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 233 Gs op vier graden Celsius en gooi de snat weg zonder het pellet te verstoren.Resuspendeer vervolgens het pellet in vijf tot tien milliliter traditioneel groeimedium, afhankelijk van de grootte van het pellet. Tel de cellen en plaats 2 miljoen cellen in een 10 centimeter standaard kweekschaal en stel primaire culturen over nacht op.Bewaar de SVF-cellen op subconfluente niveaus om spontane differentiatie te voorkomen. 36 uur na het zaaien, lift de cellen op met Accutane volgens het protocol van de fabrikant. Was de cellen eenmaal met faxbuffer en centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 233 Gs op vier graden Celsius.Na het centrifugeren, gooi de snat weg zonder het pellet te verstoren. Resuspendeer de cellen in 0,5 tot één milliliter effects.Buffer. Tel de cellen met behulp van een hemo cytometer.Wijd 1,2 miljoen cellen toe aan een niet-gesorteerde groep die afzonderlijk wordt geplaatst als controle. Voor dit experiment, breng 100 microliter kwats over in één 1,5 milliliter einor buis. Bereid voor elk te analyseren monster één ongekleurd monster plus enkele kleurcontroles voor voor elk van de te gebruiken antilichamen en plaats ze op ijs.Label vervolgens de osteogene subpopulatie door anti CD 90 of anti CD 1 0 5 te verdunnen in faxbuffer om de andere celpopulaties zoals hematopoëtische en endotheelcellen te labelen, verdun anti CD 45, anti CD 34 en/of anti CD 31 in faxbuffer. Na de incubatie, was de cellen tweemaal door de buizen te vullen met faxbuffer en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 233 Gs op vier graden Celsius. Na het centrifugeren, zuig de snat weg na de tweede wassing, resuspendeer de cellen in 400 tot 500 microliters van effects.Buffer filter de monsters door een 70 micrometer nylon celzeef in een centrifugeerbuis om celklonten te verwijderen. Voer fluorescentiegeactiveerde celsortering uit zoals beschreven in het bijbehorende protocol. Gebruik fact software om analyseplots te ontwerpen om voorwaartse verstrooiing, zijwaartse verstrooiing, fico, eryn, Texas Red Pacific Blue fluoresceine isothiocyanaat, allof cyanide en elke andere Fluor vier te onderzoeken die wordt gebruikt om cellen te labelen.Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat fact analyseplots correct worden getekend om niet per ongeluk de gewenste celpopulaties uit te sluiten. Sorteer de gelabelde celpopulaties naar

isolation-enrichment-human-adipose-derived-stromal-cells-for-enhanced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft de isolatie van vet-afgeleide stromale cellen van lipoaspirate en de oprichting van een 4 mm kritische grootte calvarial defect aan het skelet regeneratie te evalueren.

Reparatie van een kritische grootte Calvarial Defect Model Met behulp van Adipose-afgeleide stromale cellen geoogst uit Lipoaspirate

In 2001, onderzoekers van UCLA beschreef de isolatie van een populatie van volwassen stamcellen, genaamd vet-afgeleide stamcellen of ASC, uit vetweefsel. Dit artikel schetst de isolatie van ASC uit lipoaspirates behulp van een handleiding, enzymatische afbraak protocol met behulp van collagenase.

Handmatig Isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke Lipoaspirates

Dit protocol beschrijft de isolatie van varkens-vetafkomstige stamcellen (pADSC) uit subcutaan vetweefsel met onderzoek van multipotentie. De multipotente pADSC worden gebruikt om processen van adipocytendifferentiatie te bepalen en transdifferentiatie in meerdere cellijnen van mesodermaal mesenchym of verdere lijnen van ectoderm en endoderm te bestuderen voor regeneratieve onderzoeken.

Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel

Adipositas-afgeleide stromale cellen kunnen nuttig zijn voor het ontwerpen van nieuw weefsel uit de eigen cellen van een patiënt. We presenteren een protocol voor de isolatie van een subpopulatie van humane adipositas-afgeleide stromale cellen (ASC's) met een verhoogd osteogeen potentieel, gevolgd door toepassing van de cellen in een in vivo calvariaal genezingsassay.

Rapid Isolatie van BMPR-IB + Adipose-afgeleide stromacellen voor gebruik in een calvarial Defect Healing Model

We presenteren een protocol om te onderzoeken het mRNA uitdrukking biomarkers voor beenvlies-afgeleide cellen (PDC's) geïnduceerd door vitamine C (vitamine C) en 1,25-dihydroxy vitamine D [1,25-(OH)2D3]. Daarnaast evalueren we het vermogen van PDC's te differentiëren in osteocytes, chondrocyten en adipocytes.

Isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijke alveolaire beenvlies en effecten van vitamine D op Osteogenic activiteit van beenvlies-afgeleide cellen

De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

Dit protocol biedt een enzym vrije methode voor het isoleren van mesenchymale stamcellen uit correctie-en lipoaspirate-monsters met behulp van een explant methode. De afwezigheid van harde enzymen of centrifugeer stappen voorziet in klinisch relevante stamcellen die kunnen worden gebruikt voor studies in vitro of teruggeplaatst naar de kliniek.

Een enzym vrije methode voor isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen van menselijke adipeus

Xenogene (chemische of dierlijke afgeleide) producten die worden geïntroduceerd in de voorbereidings-/manipulatiestappen voor celtherapie zijn geassocieerd met een verhoogd risico op immuunreactiviteit en pathogene overdracht bij gastheerpatiënten. Hier wordt een volledig xenogeneïsche vrije methode beschreven voor de isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen.

Isolatie en kweek van menselijke vetstamcellen met een innovatieve xenogene-vrije methode voor menselijke therapie

Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

Het vetweefsel is een uitstekende bron van mesenchymale stamcellen. Hier brengen we de stapsgewijze extractie, cultivatie en karakterisering van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) uit epididymaal vetweefsel van Zwitserse muizen.

Isolatie, in-vitro-expansie en karakterisering van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen

Hier presenteren we een standaardmethode om effectief stamcellen en adipocyten van vetweefsel te isoleren, gekenmerkt door &gt;90% vermindering van verwerkingstijd, hoge cellevensvatbaarheid en brede compatibiliteit.

Efficiënte isolatie van vetweefselstamcellen en adipocyten uit varkensvet vetweefsel

Leer de isolatie van menselijke adipose-afgeleide stromale cellen met verhoogde osteogene potentie via flowcytometrie. Deze methode ondersteunt regeneratieve geneeskunde en craniale reconstructie.

Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Meer video's verkennen