Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effectiviteit van kankerdrugssensibilisatie te evalueren door veranderingen in celmetabolisme in vitro en de frequentie van metastasen in vivo te meten. Dit wordt bereikt door eerst kankercellen in vitro te transfecteren met antisense-moleculen om het doelwit van belang neer te halen. Vervolgens worden de getransfecteerde cellen op biosensorchips geplaatst en geladen in een metingsysteem voor metabolisme om veranderingen in verzuring, ademhaling en adhesie tijdens de medicijnbehandeling te tellen.

Afzonderlijk worden getransfecteerde cellen behandeld met een medicijn en geïnjecteerd in de veneuze circulatie van een kippenembryo om effecten op de frequentie van metastasen te evalueren. De resultaten tonen kankerdrugssensibilisatie, geïllustreerd door veranderingen in celmetabolisme en frequentie van metastasen. Deze techniek breidt de ontwikkeling van kankertherapie uit omdat het de gelijktijdige evaluatie van parameters mogelijk maakt die niet altijd worden overwogen tijdens conventionele preklinische testen van geneesmiddeldoelen of -stoffen.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in nieuwe geneesmiddeldoelen betrokken bij DNA-reparatie, kan het ook worden toegepast op doelwitvalidatie in andere systemen, zoals celcycluscontrole. Na het transfecteren van tumorcellen met antisense-oligonucleotiden, volgens het tekstprotocol in een steriele omgeving, gebruik 400 microliter PBS om zorgvuldig zes biosensorchips te wassen. Om de chips te steriliseren, verwijder de PBS en voeg 400 microliter 70% ethanol toe en incubeer gedurende 20 minuten voordat je de chips drie keer met PBS wast. Plaats drie chips in steriele kweekschalen, gelabeld controle en doelwit van belang, en label twee 50 milliliter buisjes op een vergelijkbare manier.

Gebruik vervolgens PBS om de getransfecteerde cellen te wassen voordat je een geschikt volume van 0,25% trypsin EDTA toevoegt, wacht tot de monolaag zich losmaakt en breng de celsuspensie over in de juiste buis. Na het tellen van de cellen, pas het volume aan om een eindconcentratie van 6,0 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter te bereiken door ofwel medium toe te voegen of de cellen te concentreren. Bereid één groep tegelijk voor, voeg 250 microliter celoplossing toe aan elke biosensorchip.

Plaats de steriele schalen met de chips in een vochtigheidskamer om verdamping te voorkomen en incubeer een nacht om metabolismemetingen uit te voeren volgens het experimentele schema dat in het tekstprotocol is beschreven. Label 1450 milliliter buisjes en voeg 50 milliliter groeimedium plus 0,2% FBS en een x penicilline en streptomycine toe. Of PS. Plaats zes buisjes in één metingsysteem voor metabolisme, zes buisjes in een ander en de resterende buis in een derde buisklem die ook buisjes met cisplatine bevat. Gebruik een luchtdoorlatende membraan om de eerste twee rekken af te sluiten om verdamping te voorkomen.

Bereid vervolgens een geschikt volume van zes micromolair cisplatine in medium met 0,2%FBS en een XPS. Verdeel het vereiste volume medium in vier gelabelde 50 milliliter buisjes en plaats ze terug in de vier slots van de derde metabolismemetingbuisklem. Gebruik een luchtdoorlatende membraan om de buisjes af te sluiten.

Label zes 50 milliliter buisjes en voeg 20 milliliter toe aan elk van 0,1% Triton X-oplossing. In medium zal de Triton X-oplossing eventuele resterende cellen doden en een nulwaarde voor elke chip bieden. Plaats de buisjes in een vierde buisklem en sluit ze af. Laad vervolgens de chips in de biomodules.

Laad de twee rekken in de twee rekkenhouders en start vervolgens het experiment. Na het voorbereiden van kippenembryo's zoals vermeld in het tekstprotocol op de tweede dag van celtransfectie, verdeel de controle- en doelwitgroep in twee flesjes voor voertuig en twee voor cisplatine. Aspireer het medium en gebruik ofwel drie milliliter vers medium of medium met zes micromolair cisplatine om aan te vullen.

De flesjes worden zes uur geïncubeerd. Na de incubatie aspireer het medium, was en probeer de cellen, breng de celsuspensie over in vier geschikt gelabelde 15 milliliter buisjes voordat je centrifugeert en PBS gebruikt om drie keer te wassen. Resuspens de cellen. En na het tellen, gebruik PBS om te verdunnen of centrifugeer om de cellen te concentreren tot een eindconcentratie van 1,0 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter.

Breng de celsuspensie over in vijf milliliter buisjes gelabeld voor injectie en plaats op ijs. Leg vervolgens 24 9 dagen oude kippenembryo's klaar voor injectie onder een stereomicroscoop en gebruik een glazen naald die is bevestigd aan een flexibele buis die is verbonden met een stelschroef van één milliliter met een langzame pulserende beweging. Injecteer 1,0 keer 10 tot de vijfde cellen in een volume van 100 microliter in de veneuze circulatie van de choaal toische membraan of cam met een zachte veeg.

Deuk voorzichtig op de injectieplaats om de bloedstroom te stoppen en absorbeer eventuele spil. Label elke embryocontainer na elke injectie onder een fluorescerende microscoop. Bevestig de aanwezigheid en verdeling van fluorescerende cellen in het vaatweefsel van de cam.

Let op eventuele embryo's waarbij het aantal tumorcellen laag lijkt of de verdeling slecht is. Plaats ten slotte de kippenembryo's in een vochtigheidskamer en incubeer ze zeven tot negen dagen voordat je de metastasefoci telt zoals beschreven in het tekstprotocol, zoals hierna te zien is na 24 uur. A 5 49 longkankercellen die werden behandeld met BRCA twee targeting een SO en cisplatine vertoonden een vroege en onomkeerbare afname van ademhaling vergeleken met cellen die controle a SO en alleen cisplatine kregen. De 39% afname vergeleken met de behandelde controlecellen begon ongeveer 10 uur voor een detecteerbare daling in celadhesie, wat suggereert dat het onafhankelijk van veranderingen in het aantal cellen plaatsvond en dat het een formatieve gebeurtenis kan zijn die voorafgaat aan celdood, zoals hier wordt aangetoond.

Er werd geen verschil in verzuring waargenomen tijdens het 72-uursexperiment, wat suggereert dat BRCA twee a