Name: Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid In Vitro En In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Leer een methode voor het evalueren van kankerdruggevoeligheid door celmetabolisme en metastasefrequentie te meten met behulp van kippenembryo's. Deze aanpak ondersteunt de ontwikkeling van effectievere kankertherapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mogelijk gemaakt door subsidies aan JK uit de Ontario Centres of Excellence en het Fonds Ontario Research. We willen graag Siddika Pardhan en Dr. Peter Ferguson bedanken voor technische bijstand tijdens het filmen.

Opmerking: Het volgende protocol is ontworpen voor gebruik met hechtende cellen. Aanpassingen nodig zijn om de methode van toepassing op niet-hechtende cellen gekweekt in suspensie. De CAM experimenten in het protocol beschreven zijn ontworpen voor gebruik met cellen die een fluorescente merker (bijvoorbeeld GFP, RFP, enz.) Tot expressie. Negen dagen oude kippenembryo&#39;s zijn vereist op dag 2 van de experimentele protocol voor de CAM-experimenten. 1. Voorbereiding en transfectie van tumorcellen met antisense-oligonucleotiden (ASO) <ol><li> Zuig medium uit T75 fles (s) met cellen van belang, wassen met 1XPBS, en voeg 2 ml van 0,25% trypsine / EDTA. Voeg 10 ml compleet kweekmedium aan elke kolf en de cellen in oplossing in een 50 ml buis. Tel de cellen en het volume aan te passen, zodat de uiteindelijke concentratie is 1.0x10 5 cellen per ml. </li><li> Neem twee groepen T25 flessen: één groep acht kolven, gelabeld 1-8 bevatten, en u zal wordensed voor de real-time metabolisme meting experiment; en de tweede groep ook 8 kolven bevatten en zullen worden gebruikt voor het kippenembryo CAM experiment. Voeg 2 ml van cellen in oplossing aan elke kolf en plaats in de incubator (37 ° C, 5% CO 2 O / N). </li><li> De volgende ochtend (dag 0, Time 0), label drie 5 ml buisjes als volgt: controle (niet-targeting ASO of siRNA), &#39;target of interest&#39; (dat wil zeggen, gericht ASO of siRNA) en Lipofectamine 2000 (of een soortgelijke transfectie reagens). Verdun de voorraad ASO oplossingen voor geschikte concentratie serumvrij medium in de betreffende buis. <ol><li> Voeg de vereiste hoeveelheid transfectie reagens passende buis en incubeer in serumvrij medium gedurende 5 min. Voeg de transfectie reagens oplossing ASO buizen en incubeer gedurende 20 minuten. </li></ol></li><li> Voeg 250 ul van controle ASO transfectiereagens oplossing in elk van kolven 1-4 in elke groep, en 250gl &quot;doelwit van belang ASO transfectie reagens oplossing in elk van kolven 5-8 in elke groep. Incubeer gedurende 4 uur (37 ᵒC, 5% CO2). <ol><li> Tijdens de incubatie, het uitvoeren van de stappen in paragraaf 2.1 beschreven. Na de incubatie, 3 ml compleet medium aan elke kolf in de CAM experiment groep en terug naar de incubator O / N (37 ᵒC, 5% CO2). Verwerk de stofwisseling experiment groep volgens de beschrijving in paragraaf 2.2. Verwerk de CAM experiment ingesteld op basis van de beschrijving in punt 4. </li></ol></li></ol> 2. biosensorchip Voorbereiding en Cell Seeding <ol><li> In een steriele omgeving, zorgvuldig wassen zes biosensor chips met 400 ul PBS. Steriliseer de chips met 400 pl 70% ethanol gedurende 20 minuten. Was driemaal met 400 ul PBS. <ol><li> Leg de chips in steriele culture gerechten om besmetting te voorkomen. Plaats drie chips in een schotel met het label &#39;control&#39;, en drie in een schotel met het label &#39;doelwit van belang&#39;. </li></ol></li><li> Label twee 50 ml buisjes als &#39;controle&#39; en &#39;doelwit van belang&#39;. Was de cellen met PBS en voeg een geschikt volume van 0,25% trypsine / EDTA. Wacht tot de monolaag los en het verzamelen van de cellen van elke kolf. Storten de oplossing in het juiste buisje. <ol><li> Tel de cellen en het volume aan te passen, zodat de uiteindelijke concentratie is 6.0x10 5 cellen / ml. Centrifugeer en resuspendeer de cellen als de beginconcentratie te laag. </li></ol></li><li> Voeg 250 ul van de cel oplossing in elk biosensor chip in de juiste groep (in totaal 1.25x10 5 cellen per chip). Voer deze taak één groep tegelijk het risico van verwarring de chips minimaliseren. Plaats de steriele schalen met de chips in een vochtige kamer om verdamping te voorkomen, en plaats de vochtigheid chamber in de incubator O / N (37 ᵒC, 5% CO2). </li><li> De volgende dag (dag 1), voorzichtig Zuig het medium van elke chip en vervangen met 250 ul groeimedium aangevuld met 0,2% foetaal runderserum (FBS) en 1 x penicilline en streptomycine (P / S). Incubeer gedurende 4 uur (37 ᵒC, 5% CO2). </li></ol> 3. Metabolisme Measurement System Voorbereiding en oplossing Voorbereiding <ol><li> Tijdens de incubatie verzorgt de geneesmiddeloplossingen en het metabolisme meetsysteem voor de volgende test. OPMERKING: Het metabolisme meetsysteem bevat in totaal zes modules. Elke module is geschikt voor één chip per experiment. <ol><li> Verdeel de assay in de volgende experimentele groepen: één chip van elk van de &quot;controle&quot; en &quot;doelwit van belang&quot; groepen voertuig voor de duur van de test; twee chips uit elke groep om medicamenteuze behandeling ontvangen voor een bepaalde periode tijdens de eenssay, gevolgd door het voertuig tijdens de wash-out periode. </li><li> Voor drug sensibilisatie studies, wijzigt de lengte, timing en concentratie geneesmiddel behandeling voor het bepaalde geneesmiddel in kwestie passen. OPMERKING: Voor cisplatine, de volgende stappen werden empirisch bepaald met A549 cellen, en kunnen variëren afhankelijk van cellijn. Voer alle stadia met de standaard debiet van 4 pl / min. 6 uur groeimedium + 0,2% FBS en 1 x P / S 24 uur van 6 uM cisplatine in medium + 0,2% FBS 1x P / S 24 uur groeimedium + 0,2% FBS en 1 x P / S 18 uur groeimedium + 0,2% FBS en 1 x P / S 4 uur 0,1% Triton-X Opmerking Afwijkingen van deze stappen berekening vereisen om de benodigde hoeveelheid medium en geneesmiddeloplossingen basis van de gewenste stroomsnelheid en duur van het experiment bepaald. De volgende paragrafen zijn gebaseerd op de hierboven beschreven stappen. </li></ol></li><li> Label en vul veertien buizen van 50 ml met 50 ml kweekmedium + 0,2% FBS eend 1x P / S. Plaats zes in één metabolisme meetsysteem tube rack, zes andere, en de resterende twee in een derde buis rek waarin ook buizen met cisplatine. Verzegel de eerste twee rekken met een lucht doorlatend membraan om verdamping te voorkomen. </li><li> Bereid een oplossing van 6 uM cisplatine (van het juiste volume) in medium + 0,2% FBS met 1x P / S. Verdeel het vereiste volume cisplatine oplossing in vier gemerkte buizen van 50 ml. <ol><li> Plaats de buizen in de resterende vier sleuven in de derde metabolisme meetbuis rek. Zorg ervoor dat de buizen in de juiste sleuven die overeenkomen met de gewenste biomodules geplaatst. Verzegeling van de buizen met een lucht doorlatend membraan. </li></ol></li><li> Bereiden en label zes 50 ml buizen en vul ze met 20 ml elk van 0,1% Triton-X-oplossing in medium. De Triton-X oplossing zal alle resterende cellen te lyseren en zorgen voor een &#39;nul&#39; waarde voor elke chip. Plaats de buizen in een vierde metabolisme meeteenheid buis rek en verzegelen with een lucht permable membraan om overmatige verdamping te voorkomen. </li><li> Laad de chips in de biomodules en start het experiment. </li></ol> 4. CAM Experiment Drug Treatment en Injection OPMERKING: De stappen en de procedure voor het bereiden van kip embryo&#39;s voor een CAM-experiment worden elders beschreven 19 <ol><li> Beginnen met het verwerken van de CAM-experiment 48 uur na transfectie (Dag 2). Onderverdelen van de &#39;control&#39; en &#39;target of interest&#39; groepen in twee flesjes voor voertuig, en twee voor cisplatine. Zuig het medium uit de kolven en aan te vullen met ofwel 3 ml vers medium, of 6 uM cisplatine. Incubeer gedurende 6 uur (37 ᵒC, 5% CO2). </li><li> Zuig het medium, dan wassen en trypsinize de cellen; het verzamelen van de cellen getrypsiniseerd in oplossing in vier gemerkte buizen van 15 ml. <ol><li> Centrifugeer en was de cellen driemaal met PBS. Re-schorten de cel pellet in 5 ml PBS eend tel de cellen. </li><li> Stel het volume zo in dat de eindcelconcentratie is 1.0x10 6 cellen / ml. Breng de celoplossing in geëtiketteerde 5 ml buizen voor injectie en plaats op ijs. Inverteer de buizen voorzichtig vóór injectie te zorgen dat de cellen goed gemengd. </li></ol></li><li> Vernietiging van een totaal van 24 kippenembryo&#39;s (9 dagen oud) voor injectie (6 per groep). Voer de injectie met een glazen naald bevestigd aan een flexibele slang verbonden met een 1 ml spuit. De persoon van de injectie worden verblind de behandelingsgroep. <ol><li> Met behulp van een stereomicroscoop, injecteren 1.0x10 5 cellen in een volume van 100 ul in de veneuze circulatie van de CAM. Gebruik een langzame, pulserende techniek om het volledige volume van de cellen te injecteren. Zachtjes dep de injectieplaats met een zacht doekje om de doorstroming van het bloed stengel en absorberen elke morsen. Label elke embryo container op de juiste wijze na elke injectie. </li></ol></li><li> Bevestigen de aanwezigheid en distridrage van fluorescerende cellen in de vasculatuur van de CAM volgende injectie visualiseren ze met een fluorescentiemicroscoop. Dan ook de eventuele embryo&#39;s waarin het aantal tumorcellen lijkt laag, of de distributie is slecht. </li><li> Leg de kippen embryo in een vochtige kamer en opslaan in een incubator (37 ° C, 60% luchtvochtigheid). Wacht 7-9 dagen voor het opsommen van metastatische foci. </li></ol> 5. gemetastaseerde Focus Enumeratie <ol><li> Tijdens de 7-9 dag incubatietijd, toezicht houden op de embryo&#39;s en gooi geen doden. Zorg ervoor dat de vochtige kamer vochtig blijft te allen tijde tijdens de incubatieperiode. </li><li> Met behulp van een fluorescentie stereomicroscoop bij 20X vergroting scant het gehele bovenoppervlak van het embryo CAM in een regelmatige raster patroon. </li><li> Tel het aantal metastatische foci in elk gezichtsveld, dan strookt het nummer voor een eindtotaal per embryo. Te doen voor de zes embryo&#39;s in elke groep zal een gemiddeld aantal o biedenf metastatische foci per behandeling. </li></ol>

<ol><li>Bouwman, P., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+deregulated+DNA+damage+signalling+on+cancer+chemotherapy+response+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance.</a> Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).</li>
<li>Bozic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+dynamics+of+cancer+in+response+to+targeted+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy.</a> Elife. 2, e00747(2013).</li>
<li>Diaz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486, 537-540 (2012).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+BRCA2+and+Thymidylate+Synthase+Creates+Multidrug+Sensitive+Tumor+Cells+via+the+Induction+of+Combined+%27Complementary+Lethality%27%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined 'Complementary Lethality'.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78(2013).</li>
<li>Lord, C. J., Ashworth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response and cancer therapy.</a> Nature. 481, 287-294 (2012).</li>
<li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).</li>
<li>Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethality%3A+exploiting+the+addiction+of+cancer+to+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair.</a> Blood. 117, 6074-6082 (2011).</li>
<li>Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. Clinical trials in oncology. 28, CRC press. (2012).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483, 531-533 (2012).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+definitions+of+cell+death+subroutines%3A+recommendations+of+the+Nomenclature+Committee+on+Cell+Death+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012.</a> Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).</li>
<li>Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+disease%3A+pre-clinical+animal+models+of+cancer+and+their+applications+and+utility+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery.</a> Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).</li>
<li>Kwon, M. C., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for lung cancer.</a> Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).</li>
<li>Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+the+best+routes+to+effectively+model+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">What are the best routes to effectively model human colorectal cancer.</a> Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).</li>
<li>Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line-based+platforms+to+evaluate+the+therapeutic+efficacy+of+candidate+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents.</a> Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).</li>
<li>Garnett, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+genomic+markers+of+drug+sensitivity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells.</a> Nature. 483, 570-575 (2012).</li>
<li>Alborzinia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+cisplatin-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death.</a> PLoS One. 6, e19714(2011).</li>
<li>Cvetkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KISS1R+induces+invasiveness+of+estrogen+receptor-negative+human+mammary+epithelial+and+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells.</a> Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).</li>
<li>Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cancer+cell+migration+and+metastatic+growth+in+vivo+in+the+chick+embryo+using+fluorescence+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging.</a> Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).</li>
<li>Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cytosolic+NADH-NAD%28%2B%29+redox+state+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Cell Metab. 14, 545-554 (2011).</li>
<li>Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+pH+in+live+cells+with+a+genetically+encoded+red+fluorescent+protein+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor.</a> J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).</li>
<li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA2+inhibition+enhances+cisplatin-mediated+alterations+in+tumor+cell+proliferation%2C+metabolism%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Onc%22%5BJournal%5D)">BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis.</a> Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vanwege de inherente kosten en risico klinische studies is er behoefte aan betere en meer rigoureuze pre-klinische testmethoden om nieuwe anti-kanker behandelingen gedegen evaluatie ontwikkelen. Huidige veelgebruikte technieken al vertonen zwakke punten die hun vermogen om onderscheid te maken tussen potentieel veelbelovende therapeutische doelen / middelen kunnen beperken, en degenen die minder effectief kunnen zijn. Wij bedachten een protocol om nieuwe anti-kanker benaderingen die veel van de tekortkomingen van tradit...

Verworven resistentie tegen doelgerichte en / of cytotoxische behandeling van kanker is een belangrijk klinisch probleem dat kan leiden tot falen van de behandeling, terugval, en verhoogde patiënt mortaliteit 1. Gezien de hoge heterogeniteit in de meeste tumoren, is een wiskundige zekerheid dat een tumor voldoende groot aantal cellen een subset van cellen resistent of gecombineerde behandelingen die moleculaire mechanismen waarop deze cellen afhankelijk zijn voor overleving 2,3 bevat. Dergelijke tumorcellen positief geselecteerd tijdens de behandeling, leidt tot terugkeer van de ziekte. Ontwikkeling van nieuwe therapieën die gelijktijdig richten op verschillende kankercellijnen overleving mechanismen voor of nabehandeling gemedieerde selectie, dus klinisch belang. Een hoog genoom instabiliteit en mutaties in tumor genomen is een fundamenteel kenmerk dat kankercellen onderscheidt van niet-tumor- gastheercellen 4. Bijgevolg is een useful strategie om de doeltreffendheid van DNA-beschadigende chemotherapie te verhogen en om de ontwikkeling van resistentie te voorkomen is het actief remmen DNA herstel in tumorcellen 5. Dit is een actief gebied van onderzoek en een verscheidenheid van nieuwe DNA herstel doelstellingen worden onderzocht in een pre-klinische omgeving. Een aantal kleine molecuul of-antisense gebaseerde remmers van deze doelstellingen zijn ontwikkeld en ondergaan testen 6-8. Het doel is om de meest veelbelovende preklinische kandidaten hun veiligheid en de werkzaamheid in klinische studies te identificeren en te evalueren. De hoge kosten van klinische proeven en het risico van mislukking (om verschillende redenen, waaronder suboptimale pre-klinische evaluatie) zijn formidabele obstakels voor vooruitgang in de ontwikkeling van nieuwe therapieën 9. Het gebruik van geschikte en strenge pre-klinische modellen om adequaat nieuwe therapeutische targets en kandidaat-medicijnen te evalueren kan de hoge uitvalpercentage van klinische proeven 10 verlagen </sup&gt;. A) inhoudsmetingen tumorcel proliferatie te verminderen in vitro (celproliferatie assays), b) reductie-induceren capaciteit van tumorcellen: Sommige veelgebruikte preklinische methoden om de doeltreffendheid van nieuwe anti-kanker regimes evalueren vorm weefselkweek kolonies (kolonievorming assays), c) reductie-induceren in tumorcellen metabole activiteit in vitro (redox-kleurstof conversie), d) therapie geïnduceerde inductie in vitro tumor celdood (apoptose, necrotische, autofagocytische, geassocieerde met mitose en anderen) 11, en ​​e) in vivo therapie-geïnduceerde reductie van de groei of ablatie van mens en muis xenograften 12-14. Een belangrijke tekortkoming van het vermelde in vitro werkwijzen is dat geen van hen continue real-time evaluatie van het effect van kandidaat therapieën. Integendeel, zij geven informatie alleen bij geselecteerde, ver uiteenliggende tijdstippentijdens de behandeling. Dergelijke metingen zijn afgenomen vermogen om nauwkeurig de omvang en de timing van de tumor cel responsen. In vivo muis xenotransplantaatmodellen zijn ook beperkt door de hoge kosten, de lengte van de tijd in beslag, en het risico van sub-optimale dosering en behandeling timing (scheduling). Daarnaast zijn er aanwijzingen dat knaagdier xenotransplantaatmodellen beperkt voorspellers van klinische werkzaamheid bij de mens, in vergelijking met in vitro evaluatie van de reacties van primaire humane tumorcellen en gevestigde humane tumorcellijnen kandidaat therapeutische interventies 15,16. Wij bedachten een nieuwe combinatie protocol om nieuwe combinaties van geneesmiddelen preklinisch evalueren op een wijze die de tekortkomingen van de hierboven genoemde meer gemeenschappelijke procedures adressen. In plaats van proliferatie, kolonie vorming, of redox-dye conversie testen, hebben we gebruik gemaakt van een stofwisseling meeteenheid naar cel adhesie, ademhaling, en verzuring in real time te analyserenTijdens de gehele behandelingsperiode 17. Tegelijkertijd onderzochten we de effecten van de behandeling combinatie in vivo door een kippenembryo chorioallantoïsmembraan (CAM) model van invasie en metastase 18,19. We gebruikten deze werkwijzen het vermogen van een antisense oligonucleotide (ASO) gericht BRCA2 de doeltreffendheid van het gebruikte chemotherapeuticum cisplatin versterken evalueren.

<table><tbody><tr><td>A549 cellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx</td></tr><tr><td>AeraSeal film</td><td>Carl Roth GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMEM</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>210-011-QK</td><td></td></tr><tr><td>Antisense oligodeoxynucleotiden</td><td>Avecia</td><td></td><td>BRCA2 doelsequentie: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (basen 7241-7259 )</td></tr><tr><td>Axio Zoom V16 Microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html</td></tr><tr><td>Bionas Biosensor Chips</td><td>Bionas GmbH en Micronas GmbH</td><td>BIS8001D</td><td></td></tr><tr><td>Bionas Discovery 2500 Systeem&nbsp;</td><td>Bionas GmbH</td><td></td><td>http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>479306</td><td></td></tr><tr><td>Bevruchte kippen eieren</td><td>Plaatselijke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum&nbsp;</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen - Life Technologies&nbsp;</td><td>12566014</td><td>http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (0,25%)/EDTA</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr></tbody></table>

het evalueren van de effectiviteit van cancer drug overgevoeligheid<em&gt; in vitro</em&gt; en<em&gt; in vivo</em

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Vanwege de hoge heterogeniteit en mutaties inherent in menselijke kankers, enkel middel therapieën of combinatietherapieën die dezelfde route targeten waarschijnlijk mislukken. De nadruk moet op de remming van de routes die verantwoordelijk zijn voor intrinsieke en / of adaptieve weerstand tegen therapie worden geplaatst. Een actief gebied van onderzoek is de ontwikkeling en het testen van DNA-reparatie-remmers die de actie van te bevorderen, en weerstand te voorkomen, veelgebruikte chemotherapie en radiotherapie. We gebruikten een nieuw protocol voor de doeltreffendheid van BRCA2 inhibitie evalueren middel om tumorcellen gevoelig te maken het DNA beschadigende middel cisplatine. Tumorcel metabolisme (verzuring en ademhaling) werd gecontroleerd in real-time voor een periode van 72 uur tot doeltreffendheid van de behandeling af te bakenen op een van minuut tot minuut basis. In combinatie, we een evaluatie van metastatische frequentie uitgevoerd met behulp van een kippenembryo chorioallantoïsmembraan (CAM) model van extravasatie en invasie. Ditprotocol wordt een aantal van de tekortkomingen van de gebruikelijke in vitro en in vivo methoden om nieuwe kankertherapie regimes evalueren. Het kan worden gebruikt naast gewone werkwijzen zoals celproliferatie assays, celdood assays en in vivo muis xenograft studies nader discrimineren tussen kandidaatdoelwitten en middelen en selecteren alleen de meest veelbelovende kandidaten voor verdere ontwikkeling.

Resultaten en cijfers aangepast met toestemming van gepubliceerde werk 22. BRCA2 remming induceert een verlaging van de ademhaling van cisplatine behandelde tumorcellen Menselijke A549 longkankercellen behandeld met BRCA2-targeting ASO en cisplatine vertoonde een vroege en onomkeerbare afname ademhaling, vergeleken met cellen die controle ASO en cisplatine alleen kregen; na 24 uur van behandeling met cisplatine het verschil tussen ademhaling B...

Hier wordt real-time monitoring van het metabolisme van tumorcellen, gecombineerd met een in vivo kippenembryo chorio-allantoïsche membraan (CAM) model van metastase, gebruikt om nieuwe anti-kanker doelen/middelen te evalueren op hun vermogen om tumorcellen te sensitiviseren voor DNA-beschadigende chemotherapeutica.

Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effectiviteit van kankerdrugssensibilisatie te evalueren door veranderingen in celmetabolisme in vitro en de frequentie van metastasen in vivo te meten. Dit wordt bereikt door eerst kankercellen in vitro te transfecteren met antisense-moleculen om het doelwit van belang neer te halen. Vervolgens worden de getransfecteerde cellen op biosensorchips geplaatst en geladen in een metingsysteem voor metabolisme om veranderingen in verzuring, ademhaling en adhesie tijdens de medicijnbehandeling te tellen.Afzonderlijk worden getransfecteerde cellen behandeld met een medicijn en geïnjecteerd in de veneuze circulatie van een kippenembryo om effecten op de frequentie van metastasen te evalueren. De resultaten tonen kankerdrugssensibilisatie, geïllustreerd door veranderingen in celmetabolisme en frequentie van metastasen. Deze techniek breidt de ontwikkeling van kankertherapie uit omdat het de gelijktijdige evaluatie van parameters mogelijk maakt die niet altijd worden overwogen tijdens conventionele preklinische testen van geneesmiddeldoelen of -stoffen.Hoewel deze methode inzicht kan geven in nieuwe geneesmiddeldoelen betrokken bij DNA-reparatie, kan het ook worden toegepast op doelwitvalidatie in andere systemen, zoals celcycluscontrole. Na het transfecteren van tumorcellen met antisense-oligonucleotiden, volgens het tekstprotocol in een steriele omgeving, gebruik 400 microliter PBS om zorgvuldig zes biosensorchips te wassen. Om de chips te steriliseren, verwijder de PBS en voeg 400 microliter 70% ethanol toe en incubeer gedurende 20 minuten voordat je de chips drie keer met PBS wast. Plaats drie chips in steriele kweekschalen, gelabeld controle en doelwit van belang, en label twee 50 milliliter buisjes op een vergelijkbare manier.Gebruik vervolgens PBS om de getransfecteerde cellen te wassen voordat je een geschikt volume van 0,25% trypsin EDTA toevoegt, wacht tot de monolaag zich losmaakt en breng de celsuspensie over in de juiste buis. Na het tellen van de cellen, pas het volume aan om een eindconcentratie van 6,0 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter te bereiken door ofwel medium toe te voegen of de cellen te concentreren. Bereid één groep tegelijk voor, voeg 250 microliter celoplossing toe aan elke biosensorchip.Plaats de steriele schalen met de chips in een vochtigheidskamer om verdamping te voorkomen en incubeer een nacht om metabolismemetingen uit te voeren volgens het experimentele schema dat in het tekstprotocol is beschreven. Label 1450 milliliter buisjes en voeg 50 milliliter groeimedium plus 0,2% FBS en een x penicilline en streptomycine toe. Of PS. Plaats zes buisjes in één metingsysteem voor metabolisme, zes buisjes in een ander en de resterende buis in een derde buisklem die ook buisjes met cisplatine bevat. Gebruik een luchtdoorlatende membraan om de eerste twee rekken af te sluiten om verdamping te voorkomen.Bereid vervolgens een geschikt volume van zes micromolair cisplatine in medium met 0,2%FBS en een XPS. Verdeel het vereiste volume medium in vier gelabelde 50 milliliter buisjes en plaats ze terug in de vier slots van de derde metabolismemetingbuisklem. Gebruik een luchtdoorlatende membraan om de buisjes af te sluiten.Label zes 50 milliliter buisjes en voeg 20 milliliter toe aan elk van 0,1% Triton X-oplossing. In medium zal de Triton X-oplossing eventuele resterende cellen doden en een nulwaarde voor elke chip bieden. Plaats de buisjes in een vierde buisklem en sluit ze af. Laad vervolgens de chips in de biomodules.Laad de twee rekken in de twee rekkenhouders en start vervolgens het experiment. Na het voorbereiden van kippenembryo's zoals vermeld in het tekstprotocol op de tweede dag van celtransfectie, verdeel de controle- en doelwitgroep in twee flesjes voor voertuig en twee voor cisplatine. Aspireer het medium en gebruik ofwel drie milliliter vers medium of medium met zes micromolair cisplatine om aan te vullen.De flesjes worden zes uur geïncubeerd. Na de incubatie aspireer het medium, was en probeer de cellen, breng de celsuspensie over in vier geschikt gelabelde 15 milliliter buisjes voordat je centrifugeert en PBS gebruikt om drie keer te wassen. Resuspens de cellen. En na het tellen, gebruik PBS om te verdunnen of centrifugeer om de cellen te concentreren tot een eindconcentratie van 1,0 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter.Breng de celsuspensie over in vijf milliliter buisjes gelabeld voor injectie en plaats op ijs. Leg vervolgens 24 9 dagen oude kippenembryo's klaar voor injectie onder een stereomicroscoop en gebruik een glazen naald die is bevestigd aan een flexibele buis die is verbonden met een stelschroef van één milliliter met een langzame pulserende beweging. Injecteer 1,0 keer 10 tot de vijfde cellen in een volume van 100 microliter in de veneuze circulatie van de choaal toische membraan of cam met een zachte veeg.Deuk voorzichtig op de injectieplaats om de bloedstroom te stoppen en absorbeer eventuele spil. Label elke embryocontainer na elke injectie onder een fluorescerende microscoop. Bevestig de aanwezigheid en verdeling van fluorescerende cellen in het vaatweefsel van de cam.Let op eventuele embryo's waarbij het aantal tumorcellen laag lijkt of de verdeling slecht is. Plaats ten slotte de kippenembryo's in een vochtigheidskamer en incubeer ze zeven tot negen dagen voordat je de metastasefoci telt zoals beschreven in het tekstprotocol, zoals hierna te zien is na 24 uur. A 5 49 longkankercellen die werden behandeld met BRCA twee targeting een SO en cisplatine vertoonden een vroege en onomkeerbare afname van ademhaling vergeleken met cellen die controle a SO en alleen cisplatine kregen. De 39% afname vergeleken met de behandelde controlecellen begon ongeveer 10 uur voor een detecteerbare daling in celadhesie, wat suggereert dat het onafhankelijk van veranderingen in het aantal cellen plaatsvond en dat het een formatieve gebeurtenis kan zijn die voorafgaat aan celdood, zoals hier wordt aangetoond.Er werd geen verschil in verzuring waargenomen tijdens het 72-uursexperiment, wat suggereert dat BRCA twee a

evaluating-effectiveness-cancer-drug-sensitization-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Geneesmiddelresistentie voor gerichte therapeutica is wijdverbreid en de noodzaak om resistentiemechanismen te identificeren - voor of na de eerste klinische verschijnselen - is essentieel voor het geleiden alternatieve klinische strategieën. Hier presenteren we een protocol te koppelen afleiding van resistente lijnen in vitro sequentiebepaling ontdekking van deze mechanismen te bespoedigen.

Invoer van<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance Testen: maximaliseren van het potentieel voor het blootleggen van klinisch relevante resistentiemechanismen

We beschrijven een hoge-doorvoer geneesmiddelgevoeligheidstest voor primaire multiple myeloomcellen. Het bestaat uit een reconstructie van de beenmergomgeving (inclusief extracellulaire matrix en stroma) in platen met meerdere putjes, en een niet-invasieve methode voor longitudinale kwantificering van celviabiliteit.

Een Organotypische High Throughput systeem voor de karakterisering van de Drug gevoeligheid van Primary Multiple Myeloma cellen

Het huidige rapport vat een protocol samen dat kan worden gebruikt om de invloed van de beenmerg-micro-omgevingsniche op leukemiecellen te modelleren, met nadruk op de verrijking van de meest chemoresistente subpopulatie.

Modeling Chemotherapie Resistant Leukemie<em&gt; In Vitro</em

Het doel van dit protocol is om de specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker in vitro die gemengde kweken die zowel tumor- en non-tumorcellen beoordelen.

Het beoordelen van specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker<em&gt; In Vitro</em

We presenteren een driedimensionaal (3D) longkankermodel gebaseerd op een biologisch collageenscaffold om gevoeligheid voor op non-kleincellige-longkanker-(NSCLC)-gerichte therapieën te bestuderen. We demonstreren verschillende meettechnieken om de proliferatie-index, apoptose en epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) status te bepalen. Verzamelde gegevens worden geïntegreerd in een in silico model voor voorspelling van drugsgevoeligheid.

Een gecombineerde 3D Weefselmanipulatieproducten<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor Model voor het voorspellen van de Drug Effectiveness in Specifieke Mutatie Achtergronden

Een in vitro -methode voor de vaststelling van dubbele weerstand tegen een EGFR-TKI en een BMO-TKI in kankercellen wordt beschreven. Deze methode is handig voor het ontwikkelen van behandelingen voor patiënten met EGFR-mutaties, die de progressie van de ziekte ondanks EGFR-TKI behandeling met BMO-amplificatie vertonen. Het kan ook worden gewijzigd voor remmers gericht op andere moleculen.

Tot oprichting van dubbele weerstand tegen EGFR-TKI en ONTMOETTE-TKI in Lung adenocarcinoom cellen In Vitro met een 2-step dosis-escalatie-Procedure

Dit protocol wordt beschreven hoe synergie tussen een antikanker antilichaam en Antineoplastische drugs in preklinische modellen met behulp van de combinatie index vergelijking van Chou en Talalay beoordelen.

Potentiëring van antikanker antilichaam werkzaamheid door Antineoplastische Drugs: detectie van antilichaam-drug synergie met de combinatie Index vergelijking

Hier beschrijven we een in vitro co cultuur methode recursief uitdaging tumor-gerichte T-cellen, die het mogelijk voor fenotypische en functionele analyse van antitumorale T cel activiteit maakt.

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

Dit manuscript beschrijft hoe in vivo immunogeniciteit van tumorcel-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) kunnen worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie. EV's afgeleid van tumoren die door behandeling geïnduceerde immunogene celdood ondergaan, lijken bijzonder relevant in tumorimmunosurveillance. Dit protocol is een voorbeeld van de beoordeling van door oxaliplatine geïnduceerde immunostimulerende tumor-EV's, maar kan worden aangepast aan verschillende instellingen.

In vivo Immunogeniciteitsscreening van tumor-afgeleide extracellulaire blaasjes door flowcytometrie van milt-T-cellen

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde evaluatie van geneesmiddelgevoeligheden voor gerichte signaleringsremmers in NSCLC-patiënt-afgeleide organoïdemodellen.

Profileringsgevoeligheid voor gerichte therapieën in EGFR-mutante NSCLC-patiënt-afgeleide organoïden

Dit protocol presenteert een reeks experimenten die zijn aangenomen voor de evaluatie van fotoschakelbare antikankerpeptiden, die kunnen worden gebruikt bij de preklinische screening van dergelijke verbindingen. Dit omvat cytotoxiciteitsbeoordeling in 2D- en 3D-celculturen, de evaluatie van  ex vivo (modelweefsel) foto-isomerisatie-efficiëntie en in vivo werkzaamheid.

In vitro en in vivo evaluatie van fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen - potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor fotofarmacologie van kanker

Leer een methode voor het evalueren van kankerdruggevoeligheid door celmetabolisme en metastasefrequentie te meten met behulp van kippenembryo's. Deze aanpak ondersteunt de ontwikkeling van effectievere kankertherapieën.

Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid

Meer video's verkennen