De Mesenteriale Lymfe Duct gecanuleerde Rat Model: Toepassing op de beoordeling van Intestinal Lymfatische Drug Transport

Het algemene doel van deze procedure is om de snelheid en omvang van het transport van lipiden en geneesmiddelen naar het intestinale lymfestelsel na intestinale toediening te evalueren. Dit wordt bereikt door eerst de mesenteric lymph duct te isoleren en te cannuleren voor de lymfeopvang. In de tweede stap wordt het duodenum gecannuleerd om infusie in de darm mogelijk te maken, waarna de arteria carotis wordt gecannuleerd om de afname van bloedmonsters mogelijk te maken.

In de laatste stap wordt de experimentele behandeling in het duodenum toegediend en worden lymfe en bloed verzameld voor de kwantificering van systemische lipide- of drugspiegels. Uiteindelijk kan dit model worden gebruikt om de totale absorptie en het intestinale lymfatische transport van lipiden en drugs na intestinale toediening te evalueren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de canulatie van het ductus lymphaticus mesenteric direct mogelijk maakt en de verzameling van lymfe gedurende de gehele experimentele periode.

Dit maakt een schatting mogelijk van de absolute massa aan materiaal die in en door de mesenteriale lymfe stroomt. In vivo maakt dit model de evaluatie van het transport van geneesmiddelen en lipiden mogelijk. Het kan ook worden gebruikt om het intestinale lymfatische transport van elke gewenste factor te meten, evenals de verandering in het lymfatische transport van dergelijke factoren als reactie op verschillende prikkels of ziektebeelden.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de canulatie van het mesenteriale lymfegaat gecompliceerd en moeilijk is vanwege het feit dat het vat klein en fragiel is in nuchtere dieren. De procedure zal worden gedemonstreerd door mijn collega en medewerker van de faculteit hier aan de Monash University, Dr. Natalie cus, en een senior postdoc in de groep, Dr. LJ Hugh. Snijd de dag voor de operatie de canules op de juiste lengte en gebruik een steriel chirurgisch mesje om een schuine afsnijding aan het uiteinde van elk stukje slang te maken. Bereid vervolgens de intraduodenale canule voor door de canule terug over zichzelf te lussen en de canule daarna te verhitten om een ankerpunt in de slang te creëren.

Scheren op de dag van de operatie de vacht van de rechterzijde van de buik en nek en de linkerclavicula-regio van een geanestheseerde volwassen rat, en reinig vervolgens de chirurgische gebieden aseptisch met drie opeenvolgende scrubs van povidonjodiumoplossing en 70% ethanol om de lymfegang te cannuleren. Plaats het dier met de rechterzijde naar boven en gebruik een steriel scalpelmes om de bovenste laag van de buikspierwand te openen met een rechte incisie van vier centimeter, uitstrekkend van het xiphoïdeusproces tot aan de rechterflank, ongeveer twee centimeter onder de costale rand. Trek de dunne darm onder de linker buikwand terug en gebruik twee tot drie stukken steriel gaas verzadigd met normale saline om deze op zijn plaats te houden.

Plaats de rat vervolgens over een plastic spuit van 10 milliliter die horizontaal onder de rug van het dier is gepositioneerd op het niveau van de rechternier. Om de visualisatie van de mesenterische lymfegang te vergemakkelijken, dient men de superieure mesenterische lymfegang te lokaliseren; deze heeft een diameter van ongeveer 0,5 tot 1 millimeter, bevindt zich loodrecht op de rechternier en ligt direct rostraal en parallel aan de donkerrode, pulserende mesenteria artery. Let op dat bij niet-nuchtere ratten, zoals hier getoond, de superieure mesenterische lymfegang wit en opaak is en gemakkelijker te visualiseren is dan bij geïnfecteerde ratten.

Haal vervolgens een paar rechte pincetten door het perineale vetbed bij de onderste rand van de rechternier, parallel aan de superieure mesenteriale lymfegang en door de bindweefsellagen direct onder de vena cava. Trek vervolgens met de punt van de pincet de lymfecannule door het perineale vetbed, waarbij één uiteinde direct naast de mesenteriale lymfegang ligt en het andere uiteinde bij het dier naar buiten is gebracht op het niveau van de rechternier. Isoleer vervolgens met een chirurgische microscoop en precisie-pincetten de mesenteriale lymfegang via de bovenliggende lagen bind- en vetweefsel door middel van botte dissectie, beginnend bij het onderste uiteinde en zorgvuldig voerend om de lymfegang niet te beschadigen wanneer deze geïsoleerd is.

Gebruik de punt van de fijne pincet om een klein gaatje in het lymfevat te maken. Nadat is vastgesteld dat de lymfecannule volledig is gevuld met antistollingsoplossing en geen luchtbellen bevat, wordt een kleine pincet gebruikt om de lymfecannule via de punctie ongeveer twee tot vier millimeter in het mesenteriale lymfevat in te brengen. Als de canulatie is geslaagd, zal er een geleidelijke stroom darmlymfe waarneembaar zijn vanuit het vrije opvanguiteinde van de canule.

Wanneer dit gebeurt, breng dan een kleine druppel cyanoacrylaatlijm aan over het toegangsgat tot het lymfevat om de canule te fixeren, waarbij u er zorg voor draagt dat het vat niet wordt afgesloten met overtollige lijm om het duodenum te canuleren. Lokaliseer eerst het weefsel als het helderroze gedeelte van de dunne darm, waarbij bij een voorzichtig naar beneden trekken de maag zichtbaar wordt. Gebruik vervolgens een steriele naald van 23 gauge om een klein gaatje in het duodenum bij de pylori te prikken, ongeveer twee centimeter onder de overgang van de maag naar het duodenum.

Voer vervolgens het js-vormige haakuiteinde van de duodenale canule door de punctie en zet de canule vast met een druppel Sano acrylaatlijm. Gebruik daarna hechtingen om de incisie in de buikspierwand te sluiten. De canulatie van de arteria carotis kan vóór of na de canulatie van de mesenteriale lymfegang worden uitgevoerd. Wij geven er doorgaans de voorkeur aan om de arteria carotis te canuleren vóór de canulatie van de lymfegang, om de kans op het verschuiven van de lymfecanule bij het verplaatsen van het dier te verkleinen. Om de arteria carotis te canuleren, markeer dan eerst de canule voor de arteria carotis op 2,5 centimeter vanaf de schuine punt om het gedeelte van de slang te identificeren dat in de arterie moet worden ingebracht.

Verbind vervolgens het niet-geschaafde uiteinde van de canule met een naald van 25 gauge die is bevestigd aan een spuit gevuld met anticoagulantia-oplossing en vul de canule met de oplossing, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Maak vervolgens een longitudinale incisie van één tot 1,5 centimeter door de huidlaag links van de trachea in het sagittale vlak, en gebruik daarna stomp-punt forceps om het subcutane bindweefsel te dissekeren en de onderliggende gepaarde nekspieren bloot te leggen. Retracteer de nekspieren om de pulserende linker arteria carotis bloot te leggen, die zich ongeveer één centimeter onder het huidoppervlak bevindt.

Verwijder vervolgens het bovenliggende bindweefsel van de arterie door middel van botte dissectie en gebruik botte weefselpincetten om een sectie van de arterie van ongeveer één centimeter te isoleren. Gebruik daarna fijne pincetten om twee zijden hechtingsdraden onder de arteria carotis door te rijgen, waarbij deze aan beide uiteinden van het geïsoleerde arteriële segment worden geplaatst. Knoop vervolgens de hechting die het verste van het hart en het sleutelbeen van de rat ligt vast, en plaats een paar rechte fijne pincetten onder de arteria carotis om de bloedstroom door de arterie af te sluiten.

Maak nu met fijne iris-schaar een kleine incisie aan het bovenoppervlak van de arterie, ongeveer op een derde van de afstand vanaf de bovenkant van het geïsoleerde gebied. Voer de punt van de canule met een gebogen pincet in de arterie in. Zodra deze is ingevoerd, worden de rechte fijne pincetten verwijderd, waardoor de bloedstroom wordt afgesloten, en wordt de canule met twee pincetten 2,5 centimeter verder in de arterie geschoven.

Gebruik er één om de canule in de arterie te houden om te voorkomen dat er bloed teruglekt en de andere om de canule in te brengen. Gebruik vervolgens een kleine arterieklem om de canule in de arterie te fixeren. Injecteer antistollingsoplossing in de canule, gevolgd door het terugtrekken van een kleine hoeveelheid bloed om de doorgankelijkheid van de slang te bevestigen.

Spoel vervolgens de canule spoel met anticoagulerende oplossing en verzegel het uiteinde met de vlam van een aansteker. Gebruik daarna hechtingen om de canule op zijn plaats te fixeren en verwijder de arterieklem. Bevestig vervolgens een derde hechting rond de arterie en de canule, verkort de lengte van de hechtingen rond de arterie en sluit de wond in de nek met meer hechtingen. Na de herstelperiode wordt de betreffende formulering via de duodenumcanule in het dier geïnfuseerd.

Zoals geïllustreerd in de grafiek na toediening van het model, het lipofiele geneesmiddel halal fanene, lag de gemiddelde lymfestroomsnelheid voor succesvol gecannuleerde ratten tussen 0,4 en 1,3 milliliter per uur. Bij sommige dieren was de lymfestroomsnelheid gedurende de eerste één tot drie uur na de cannulatie iets lager voordat deze toenam, een veelvoorkomend fenomeen na een succesvolle lymfecannulatie; bij niet succesvol gecannuleerde ratten blijft de stroomsnelheid gedurende de gehele verzamelperiode echter aanzienlijk lager dan wat in de succesvolle experimenten werd waargenomen.

Op dezelfde wijze was in deze representatieve experimenten het cumulatieve lymfatische transport van triglyceride en halal RIN aanzienlijk lager bij de dieren waarbij de canulatie niet succesvol was. Terwijl in de succesvol gecanuleerde groepen het gemiddelde cumulatieve halalan-transport 15,1% van de dosis bedroeg en het cumulatieve triglyceride-transport 61 milligram over 10 uur was. In dit representatieve lipidentransportexperiment was het aandeel van de toegediende radiogemarkeerde exogene lipidedosis dat via de lymfe werd getransporteerd 54%. Deze waarden verschilden niet significant van de eerder waargenomen waarden.

Voor een vergelijkbare formulering bereikt de transportsnelheid van zowel triglyceriden als geneesmiddelen naar de lymfe een piek kort na toediening van de lipiden en het geneesmiddel, om vervolgens terug te keren naar de basiswaarden. Dit is kenmerkend voor experimenten naar het transport van lipiden en geneesmiddelen via de intestinale lymfe. De snelheid van het geneesmiddeltransport in de lymfe tijdens elke tijdsperiode weerspiegelt die van het triglyceridentransport, aangezien het geneesmiddel naar de lymfe wordt getransporteerd.

In verband met de triglyceriderijke lipoproteïnen kan de canulatie, eenmaal onder de knie gekregen, binnen 30 minuten worden voltooid als er geen complicaties optreden. Na deze procedure kunnen de componenten in de verzamelde lymfe worden geïsoleerd en gebruikt voor aanvullende experimenten, zoals re-infusie bij ontvangende dieren om hun functie, metabolisme, klaring of dispositiepatronen direct te evalueren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in de technieken voor het isoleren en canuleren van de mesenteriale lymfebuis, de halsslagader en het duodenum.

Met behulp van deze technieken moet u in staat zijn om het transport van zowel geneesmiddelen, lipiden als andere factoren vanuit de darm naar en in de mesenteriale lymfe in Viva te beoordelen.