Een colorimetrische test waarmee specifiek Granzyme B proteolytische activiteit: Hydrolyse van Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
28 november 2014
We beschrijven een eenvoudige, kwantitatieve colorimetrische test die specifiek de proteolytische activiteit van humane, muis- of ratten-Granzyme B (GzmB) meet. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast voor het bepalen van de protease-activiteit van andere granuulserineproteasen door de hydrolyse van andere synthetische peptide-substraten met een geschikte herkenningssequentie.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de proteolytische activiteit van het protease granzyme B te meten. Dit wordt bereikt door eerst een lysaat van de betreffende cellen te bereiden en vervolgens snel substraat aan de monsters toe te voegen. De granzyme B-activiteit wordt daarna gemeten via een colorimetrische reactie. Uiteindelijk kan de zeer specifieke splitsing van alla alla as s benzo door granzyme B worden beoordeeld op basis van de unieke substraatspecificiteit voor a spart-zuurresidu's.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de detectie van granzym B-expressie met behulp van PCR of Western blot, is dat de hydrolyse van benzyl specifiek is voor granzym B en bovendien aangeeft dat het protease actief is. Om de cellysaten te bereiden, worden eerst primaire NK-cellen geïsoleerd uit enkelcellsuspensies van milten van wild-type C57BL/6-muizen of controlegranzym B-gene-null-muizen door middel van negatieve selectie met commercieel verkrijgbare kits volgens de instructies van de fabrikant, nadat de cellen zijn geactiveerd. Was de cultuur drie keer in PBS op maximale snelheid gedurende twee tot drie seconden en resuspendeer het pellet, dat minimaal 5 miljoen NK-cellen bevat, vervolgens in 100 µL NP-40 lysisbuffer op ijs gedurende 20 minuten.
Centrifuge vervolgens het lysaat 10 minuten bij 15.000 Gs in een microcentrifuge en breng het supernatant over naar een nieuwe buis. Nadat de proteïneconcentratie is bepaald aan de hand van het bijbehorende commercieel beschikbare protocol, wordt het supernatant bewaard bij een minimale concentratie van ongeveer twee milligram per milliliter bij -20 °C om een granzyme B-activiteitsassay uit te voeren. Verdun vervolgens minimaal 100 microgram proteïnelysaat per monster in vers bereide HEPS-buffer tot een eindvolume van 160 µL.
Gebruik vervolgens een meerkanaalpipet om per well 50 µL monster in triplo in een 96-well vinylle U-bodemplaat te laden. Voeg aan elke well 100 µL verdunde DTNB toe, waarbij u erop let dat er drie controlewells met alleen buffer worden opgenomen. Voeg vervolgens snel 50 µL vers verduurd alala asks s benzoylsubstraat toe aan elk van de wells met alleen buffer, gevolgd door de negatieve controles, en eindig met de verwachte positieve monsters.
Meet de aase-activiteit door de hydrolyse van alala as benzyl in een microplaatlezer bij een optische dichtheid van 405 nanometer met behulp van een kinetisch assay-protocol waarbij elke 15 seconden 25 metingen worden verricht. Gebruik vervolgens de software van de plaatlezer om de maximale snelheid van substraatsplitsing voor elke put te berekenen, en transfer de ruwe gegevens vervolgens naar de passende statistische analyse-software met behulp van granzyme-gen-knockoutmuizen. Er is ontdekt dat het synthetische peptide-substraat alala as benzyl specifiek wordt gehydrolyseerd door granzyme B. Verdere robuuste splitsing van het synthetische substraat kan worden gemeten in cellysaten van wildtype primaire NK-cellen, maar niet in NK-cellen van granzyme B-knockoutdieren als controle.
In dit experiment was de proteolytische activiteit van granzym A, dat een trypsine-achtige substraatspecificiteit heeft en aanwezig is in lysaten van beide celtypen, gelijk zoals gemeten door de hydrolyse van BLT benzyl; I-E-P-D-P-N-A is generiek gebruikt om de granzym B-activiteit over verschillende soorten te testen. In deze representatieve experimentele analyse van de tetrapeptide-sequenties bleek dat menselijk, maar niet muis-granzym B, efficiënt kan splitsen na de sequentie IEPD, welke overeenkomt met de herkenningssequentie in zowel menselijk als muis-bid. In tegenstelling hiermee resulteert het verlagen van de hoeveelheid menselijk NK-leukemiecellysaat van 30 micrograms naar 10 micrograms nog steeds in voldoende granzym B om het I-E-P-D-P-N-A-substraat te hydrolyseren.
Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u het juiste substraat en de experimentele controles kiest voor de in vitro analyse van rood menselijk en muizenenzym B.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een kwantitatieve colorimetrische assay voor het meten van de proteolytische activiteit van Granzyme B (GzmB) in menselijke, muis- of ratmonsters. De methode kan worden aangepast voor andere granulaire serineproteasen door gebruik te maken van verschillende synthetische peptide-substraten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Protease-activiteit
- Celbiologie
Achtergrond
- Granzyme B is een serineprotease dat betrokken is bij immuunresponsen.
- Het meten van de activiteit ervan is essentieel voor het begrijpen van de rol bij celgemedieerde cytotoxiciteit.
- Bestaande methoden zoals PCR of Western blot meten de proteaseactiviteit niet direct.
- Deze assay biedt een specifieke en directe meting van GzmB-activiteit.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een eenvoudige assay voor het kwantificeren van GzmB-activiteit.
- Het bieden van een methode die kan worden aangepast voor andere proteasen.
- Het verbeteren van bestaande technieken door specificiteit voor GzmB-activiteit te bieden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van cellysaten uit primaire NK-cellen.
- Gebruik van een colorimetrische reactie om de GzmB-activiteit te meten.
- Isolatie van NK-cellen uit milten van wildtype en granzyme B-gen-deficiënte muizen.
- Substraathydrolyse om de protease-activiteit te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- De assay meet succesvol de GzmB-activiteit via specifieke substraatsplitsing.
- Het vertoont een hoge specificiteit voor GzmB in vergelijking met andere methoden.
- De resultaten geven aan dat de protease actief is op basis van substraathydrolyse.
- De methode is aanpasbaar voor andere granulaire serineproteasen.
Conclusies
- De ontwikkelde assay is een betrouwbaar instrument voor het meten van GzmB-activiteit.
- Het biedt voordelen ten opzichte van traditionele methoden door de proteasefunctie direct te beoordelen.
- Deze benadering kan het onderzoek naar immuunresponsen en proteasebiologie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Een nauwkeurige meting van de proteolytische activiteit van Granzyme B is essentieel voor de validatie van de functie van cytotoxische lymfocyten bij de ontwikkeling van immunotherapie. Deze colorimetrische assay biedt een directe, specifieke readout van de protease-activiteit, waardoor mechanistische risicoanalyse van target-interactie en pro-apoptotisch potentieel in preklinische modellen mogelijk wordt. De compatibiliteit tussen verschillende soorten ondersteunt de translationele continuïteit van knaagdierstudies naar menselijke toepassingen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar Granzyme B-afhankelijke apoptosepaden in cytotoxische lymfocyten.
- Operationele waarde: Maakt onderscheid tussen actieve protease en enkel expressie, waardoor fout-positieven bij targetvalidatie worden verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt functionele bevestiging van Granzyme B als mechanistische drijver bij immuun-gemedieerde tumorclearance.
Screening & assayontwikkeling
- Klaar voor analyse: Maakt gebruik van Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl substraat dat uitsluitend wordt gehydrolyseerd door Granzyme B in menselijke, muis- en ratsystemen.
- Kwantitatieve output: Meet de initiële hydrolysesnelheden via een DTNB-gekoppelde colorimetrische reactie bij 405 nm voor kinetische analyse.
- Specificiteitscontrole: Sluit interferentie door caspase en andere granzymen uit vanwege de unieke aspartaatvoorkeur.
- Reproduceerbaarheid: Compatibel met ongefractioneerde lysaten en recombinante proteasen wanneer de juiste controles zijn opgenomen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Toepasbaar op modellen van tumorimmuunbewaking, virale infecties en auto-immuunpathologie waarbij Granzyme B de dood van doelcellen medieert.
- Translationele continuïteit: Maakt consistente activiteitsmeting tussen soorten mogelijk, wat extrapolatie van muisgegevens naar humane gegevens ondersteunt.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Biedt een op activiteit gebaseerde biomarker om kandidaten met bevestigd cytotoxisch potentieel te prioriteren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadoptimalisatie, waarbij functionele proteaseactiviteit inzicht geeft in de biologische effectiviteit en het werkingsmechanisme.
- Ontdekkingsbiologie: Bevestigt de hypothese dat Granzyme B apoptose in effectorlymfocyten aanstuurt via substraatspecifieke splitsing.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve activiteitsmetingen voor het vergelijken van condities of genetische perturbaties.
- Analytiek: Genereert kinetische gegevens (Vmax) die vergelijking tussen monsters en statistische evaluatie van de proteolytische capaciteit mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt preklinische validatie door het verifiëren van geconserveerde activiteit in Granzyme B van mensen, muizen en ratten.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Platform is aanpasbaar voor andere granuleproteasen via substraatsubstitutie, wat de lange-termijn bruikbaarheid vergroot.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Directe meting van de proteolytische functie vermindert de afhankelijkheid van surrogaatmarkers zoals mRNA- of proteineniveaus.
- Operationele waarde: Eenvoudig, plaatgebaseerd formaat met minimale handmatige tijd en compatibiliteit met standaard microplaatlezers.
- Strategische waarde: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van functionele activiteit in plaats van alleen expressie, wat het voorspellend vertrouwen verbetert.
- Impact op portfolio: Faciliteert de risico-gecorrigeerde voortgang van immunotherapieën door mechanistische potentie in een vroeg stadium van de ontwikkeling te bevestigen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de isolatie en lyse van primaire immuuncellen onder gecontroleerde omstandigheden om de proteaseactiviteit te behouden.
- Afhankelijk van toegang tot een microplaatlezer die in staat is tot kinetische OD405-metingen en compatibele analysesoftware.
- Maakt de inclusie van Granzyme B-knockout-controles noodzakelijk om de specificiteit van de assay te bevestigen, zoals aangetoond in de bron.
- Aanpassing aan andere proteasen vereist validatie van alternatieve substraten om een gelijkwaardige specificiteit en signaalvenster te handhaven.
- Praktische beperking: de assay meet de totale activiteit van het lysaat en kan fractionering vereisen voor studies naar subcellulaire lokalisatie.
