Functionele Het oplossen en Channel activiteit Metingen van gezuiverde wildtype en mutante CFTR eiwit

Het algemene doel van deze procedure is om de functie van een populatie CFTR-kanalen in een gereconstitueerd systeem te meten en de respons van de kanalen op de aanwezigheid van modulatormoleculen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst wild-type of mutant CFTR-eiwit uit SF nine-cellen te zuiveren met behulp van een snelle zuiveringsprocedure, wat resulteert in functioneel CFTR-eiwit in een detergentoplossing. De tweede stap is om het gezuiverde eiwit te reconstitueren in proteoliposomen van een door de experimentator gekozen gedefinieerde lipidensamenstelling.

Vervolgens wordt er over het membraan een chemische jodidegradiënt gecreëerd door het overtollige liposomale jodide te verwijderen, om zo een drijvende kracht te genereren voor ionbeweging via het CFTR-kanaal. De laatste stap is het activeren van het kanaal en het initiëren van de jodidevrijgave uit de proteoliposomen in aanwezigheid van het betreffende modulatormolecuul. Uiteindelijk wordt een jodide-selectieve elektrode gebruikt om de CFTR-kanaalfunctie in real-time te monitoren in dit gereconstitueerde systeem.

Deze methode maakt het mogelijk om de chloridekanaalactiviteit van een gezuiverde populatie CFTR-moleculen te bestuderen na reconstitutie in fosfolipide liposomen. Hoewel deze methode is ontwikkeld om inzicht te verschaffen in de functie van het CFTR-kanaal en het effect van kleine moleculaire modulatoren, kan deze methode ook worden toegepast op andere systemen, zoals de functionele karakterisering van andere membraaneiwitten. Om succesvol te zijn, moeten personen die nieuw zijn met deze methode ervoor zorgen dat zij de ratio's van eiwit ten opzichte van lipide voor hun systeem hebben geoptimaliseerd, dat zij niet werken met slecht functionerende of niet-functionerende eiwitten, en dat zij een voldoende jodidegradiënt over goed afgesloten blaasjes hebben gecreëerd.

Om de lipiden voor te bereiden, droog vijf milligram eigeel-fosfatidylcholine of egg PC eerst gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in een niet-borosilicaatglazen buis onder een stroom argongas. Bereken vervolgens het benodigde volume buffer zes zoals aangegeven in het tekstprotocol en voeg buffer zes vervolgens direct toe aan de lipiden. Sluit de glazen buis af met perfil en vortex de buis vervolgens twee minuten bij kamertemperatuur om de lipiden in de buffer te suspenderen.

Suspendeer vervolgens het lipide bij kamertemperatuur met een naald van 25 gauge bevestigd aan een spuit van één milliliter, totdat er geen zichtbare lipidelaag meer aan de zijkant van de buis aanwezig is. De buffer zal troebel zijn door het gesuspendeerde lipide. Sonicer het lipide in de buis voor een 22ste burst in een bad, een sonicator met ijs, en plaats de buis vervolgens één minuut op ijs om te laten rusten.

Voer deze cyclus drie keer uit. Voeg vervolgens het CFTR-eiwit toe aan het lipide, tot een eindvolume van één milliliter. Meng het eiwit 10 keer met een lipidesuspensie met behulp van een naald van 25 gauge.

Plaats het monster 30 minuten op ijs en draai de buis elke vijf minuten vijf keer rond om het monster tijdens de incubatie te mengen. Breek het onderste lipje van een wegwerp-spincolumn voor detergensbinding en centrifugeer de column twee minuten bij 2000 ×g. Om de bewaarbuffer te verwijderen, wordt de column gewassen met vijf milliliters buffer zeven en wordt de column vier minuten gecentrifugeerd bij 2000 ×g om de wasbuffer te elueren.

Was de kolom drie keer, breng het volledige eiwitlipide-monster van één milliliter over naar de bovenkant van de kolomhars en laat de kolom vervolgens twee minuten incuberen bij kamertemperatuur. Centrifugeer de kolom bij kamertemperatuur gedurende vier minuten bij 2000 ×g. Breng vervolgens het troebele protealiposoom-monster over naar een schoon microfugebuisje en plaats het buisje op ijs. Week vijf gram Cidex G 50-beads in 50 milliliter buffer negen gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur.

Vul vervolgens vier kleine screeningkolommen met de verzadigde kraaltjes totdat ze voor ten minste driekwart gevuld zijn. Centrifugeer de kolommen vier minuten bij 2000 ×g om overtollige buffer uit de hars te verwijderen. Na centrifugatie moeten er ongeveer 2,25 milliliters gepakte hars in de kolom aanwezig zijn.

Het is essentieel dat de hars adequaat gehydrateerd is voor elutie met de protea liposomen. Draag vervolgens 125 µL van het protea liposoommonster over naar de bovenkant van elke kolom en centrifugeer gedurende vier minuten bij 2000 ×g. Pool de EIT's voor gebruik in de iodide FLX-experimenten.

Plaats een kleine F-vlies roerstafje in één putje van een 96-well plaat en voeg vervolgens 150 µL VX seven 70 toe aan het putje in een concentratie van 20 µM in buffer nine. Gebruik een pipetpunt om eventuele luchtbellen te verwijderen. Voeg daarna 150 µL van het protea-liposoommonster toe aan het putje voor een totaalvolume van 300 µL.

Plaats de 96-wellplaat op een roerplaat bij 130 omwentelingen per minuut. Steek de punt van de jodide-gevoelige elektrode in de oplossing zonder de roerstaaf of de bodem van de well te raken. Om de registraties van het elektrodesignaal op te nemen, wordt het signaal gefilterd via een laagdoorlaatfilter met een bemonsteringssnelheid van twee hertz; neem vijf minuten lang registraties van het monster op om het monster te laten equilibreren.

Dit moet een stabiele, bijna vlakke basislijn opleveren. Voeg vervolgens drie µL van een 100 mM stockoplossing van magnesium ATP toe bij pH 7. Om de CFTR-kanalen te activeren, laat u het monster nog vijf minuten equilibreren om een nieuwe basislijn te bereiken.

Voeg vervolgens drie µL van een 2 µM stockoplossing van valinomycine toe om de elektrochemische gradiënt die door CFTR-activiteit wordt gegenereerd, te elimineren. Registreer de afname in voltage als gevolg van CFTR-gemedieerde iodide FLX-activiteit gedurende ten minste vijf minuten.

Voeg vervolgens drie µL van een 10% Triton X 100-oplossing toe aan het monster om jodide uit het lumen van het proteoliposoom vrij te maken als controle. Een significante vrijgave van jodide geeft aan dat het ingesloten jodide in de blaasjes niet beperkend was voor de CFTR-activiteit. Maak na het meten van het monster een verdunningsreeks van kaliumjodide, van micromolaire tot nanomolaire concentraties, in buffer negen.

Beginnend met de meest verdunde oplossing, noteer de respons van de elektrode in millivolts bij elke jodideconcentratie om een standaardcurve te genereren. Wild-type CFTR werd geanalyseerd op jodide. De F-fluxactiviteit werd gemeten in namol per seconde na reconstitutie.

De iodide-flux wordt significant gestimuleerd in de aanwezigheid van CFTR en ATP vergeleken met de controle zonder CFTR en door de toevoeging van ATP. Wanneer CFTR wordt gefosforyleerd door de cyclisch AMP-afhankelijke proteïnekinase, een katalytische subeenheid bekend als PKA, vermindert voorbehandeling met de potente remmer CFTR-remmer 172 omgekeerd de iodide-fluxsnelheid. Het vermogen van VX-770 om de iodide-flux van wildtype CFTR te potentiëren, werd getest zonder en met fosforylering door PKA; VX-770 verhoogde de relatieve iodide-flux alleen in de aanwezigheid van gefosforyleerd CFTR. De effectiviteit van VX-770 werd bepaald met een variant van CFTR genaamd Delta 508 CFTR; een inactieve analoog, V 09 1188, potencieert de activiteit van gefosforyleerd Delta 508 CFTR niet, terwijl VX-770 de relatieve iodide-flux verhoogt. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze, van zuivering tot de metingen van de CFTR-activiteit, worden voltooid binnen een typische werkdag van acht uur; de zuivering van CFTR duurt ongeveer vier uur en de reconstitutie kost nog een uur voordat de eFlex-assay wordt gestart.

Na deze procedure kunnen andere methoden, waaronder een T PS-assay en de single channel conduct a measurement in the para lipid S, worden uitgevoerd met behulp van dezelfde preparatie van het CFTR-eiwit om de interactie met de kleine moleculen verder te karakteriseren. Met behulp van deze methoden zal een onderzoeker op het gebied van cystische fibrose in staat zijn om kernvragen in het veld van CFTR-modulatoren te beantwoorden, namelijk: interacteert die modulator direct met het CFTR-eiwit en wat is het werkingsmechanisme van die modulator.