Twee-foton Imaging van Cellular Dynamics in de Muis Spinal Cord
February 22nd, 2015
Een nieuw ex vivo voorbereiding voor het afbeelden van de muis ruggenmerg. Dit protocol maakt twee-foton beeldvorming van levende cellulaire interacties gehele ruggenmerg.
Het algemene doel van het volgende experiment is om fluorescent gelabelde getransplanteerde, neurale voorlopercel- of NPC-interacties met fluorescente axonen in het muizenruggenmerg in realtime te beeldvormen. Dit wordt bereikt door het ruggenmerg voorzichtig te verwijderen en in te bedden van muizen getransplanteerd met NPC's in 5%aros en het aan een dekglas te hechten. De oriëntatie van het ruggenmerg kan worden gewijzigd om fluoresctie in elk gebied van het ruggenmerg te bekijken.
In de tweede stap wordt de ruggenmergpreparatie op de tweefoton-beeldvormingsfase geplaatst voor beeldvorming van levensvatbare NPC's terwijl deze worden gesuperfundeerd met warm, geoxygeneerd RPMI-medium gedurende maximaal 10 uur. Een geschikte enkele rand diic-beam splitter wordt gebruikt om de YFP- en GFP-emissies te scheiden. Uiteindelijk maakt tweefoton-beeldvorming visualisatie van de interacties van de GFP-expresserende NPC's met de YFP-expresserende axonen in het beschadigde ruggenmerg in realtime mogelijk.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurogeneratie, zoals wat zijn de moleculaire en cellulaire signaalcues nodig voor getransplanteerde NPC-remyelinisatie van beschadigde axonen, en wat zijn de kinetica van deze remyelinisatie-evenementen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals intertidale tweefoton-beeldvorming, die alleen kan worden gebruikt om het dorsale ruggenmerg te beeldvormen, is dat deze methode beeldvorming van getransplanteerde NPC's mogelijk maakt die diep zijn gemigreerd binnen het ventrale gebied van het ruggenmerg. Na bevestiging van euthanasie door spinale transectie, bevochtigt u de muis met 70%ethanol, gebruik vervolgens scherpe fijne scharen om het haar en de huid van de achterkant van het dier te verwijderen en legt u de wervelkolom bloot van ongeveer de cervicale lamina een of C een tot de sacrale lamina vier of S vier.
Gebruik vervolgens een scalpel met een nummer 10-mes om incisies te maken aan de linker- en rechterkant van de wervelkolom om deze te scheiden van het omringende spier- en vetweefsel en snijd ook overtollig weefsel rond en bovenop de wervelkolom weg. Dit maakt het gemakkelijker om de wervels te verwijderen. Houd vervolgens het bovenste deel van de wervelkolom met gekartelde grijze pincetten vast, steek titanium gebogen van scharen met de gebogen kant omhoog in de blootgestelde wervelkolom bij C een, zorg ervoor dat u het ruggenmerg niet aanraakt.
Schuif de scharen helemaal naar rechts en maak een kleine snede. Er zou een klein knarsend geluid moeten worden gehoord en gevoeld als de scharen de wervels snijden. Herhaal deze snede aan de verre linkerkant van het koord, zorg ervoor dat u niet te snel werkt of te groot snijdt, omdat dit het risico op beschadiging van het koord met zich meebrengt.
Zodra de zijden van de wervels zijn gesneden, zou de enkele lamini met de pincetten moeten kunnen worden opgetild. Herhaal de linker- en rechtersneden voor elke lamina tot S vier is bereikt. Blijf de wervelkolom vasthouden en trek de ruggenmergwervels terug.
De wervels boven het transplantaat kunnen loskomen zodra zijn ruggengraat tot het transplantaat is gesneden. Zodra de wervels zijn gesneden tot S vier, legt u de wervels neer om te helpen visualiseren waar de transplantatieplaats is en snijdt u ongeveer 20 millimeter rostraal en coddle naar de transplantatieplaats. Gebruik vervolgens een scalpel met een nummer 11-mes om voorzichtig de ganglia aan de rechter- en linkerkant van de ventrale kant van het ruggenmerg te snijden, beginnend aan het rostrale uiteinde.
Keer vervolgens het dier om en houd het zodat het ruggenmerg naar beneden wijst en gebruik gesloten gekartelde grave-forceps om voorzichtig het ruggenmerg uit het coddle-uiteinde te pellen. Snijd vervolgens, zonder het ruggenmerg te snijden, voorzichtig alle resterende ganglia door om het ruggenmerg in één intact stuk te kunnen tillen en plaats het koord in medium op ijs om het ruggenmerg voor te bereiden op beeldvorming. Breng het zenuwweefsel over naar een param-blad met de ventrale kant omhoog.
Pipetteer vervolgens ongeveer vijf milliliter vers bereide 37 graden Celsius, 5%agro-oplossing over het koord en laat het op kamertemperatuur stollen. Na ongeveer vijf minuten brengt u een lichte laag weefselkleefstof aan op een 22 millimeter vierkante dekglas en keert u het ingebedde ruggenmerg met de ventrale kant naar beneden om op een nieuw stuk perfil. Bevestig het dekglas aan de blootgestelde dorsale kant en dompel de hele voorbereiding in vers medium om de kleefstof te laten stollen.
Gebruik vervolgens een scheermes om het overtollige gestolde aga-roos te verwijderen. Plaats vervolgens de slang die is aangesloten op de slangenpomp in een mediafles, gehouden in een waterbad om 37 graden Celsius te superfunderen. Voer warm gemaakt medium door een op maat gebouwde beeldvormingsput op de microscoopfase bij drie milliliter per minuut.
Plaats vervolgens de ruggenmergpreparatie in de put met de ventrale kant omhoog naar het 25 x dompelobject. Gebruik voor beeldvorming van het ventrale ruggenmerg door middel van tweefoton-microscopie een ultra titanium-saffierlaser afgestemd op 900 nanometer met de laservermogen verminderd bij het specimen tot minder dan 5% om minimale fototoxiciteit te garanderen. Gebruik vervolgens het oculaire en een fel veldlichtbron om het dompelobject te focussen op de ventrale rand van het ruggenmerg.
Om een referentiepunt in te stellen, zorg ervoor dat de omgevingslichtbron is uitgeschakeld. Open vervolgens de lasersluiter om de tweefotonencitatie te schakelen indien beschikbaar. Wanneer u het weefsel doorzoekt naar gebieden van belang, gebruikt u een lagere resolutie-instelling met een hoger volume zonder digitaal zoomen en een hogere scanfrequentie dan wanneer u de laatste afbeeldingen verwerft.
Om de cellen te vinden, is het het beste om zich onder fel veldver
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe ex vivo bereiding voor beeldvorming van het muizenruggenmerg, waardoor twee-foton beeldvorming van interacties tussen levende cellen mogelijk wordt. Het protocol maakt real-time observatie mogelijk van fluorescentie gelabelde neurale voorlopercellen (NPC's) die interageren met axonen in het ruggenmerg.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van cellulaire interacties in het ruggenmerg is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Twee-foton beeldvorming biedt hoog-resolutie visualisatie van levende cellen.
- Neurale voorlopercellen (NPC's) zijn belangrijk voor het bestuderen van herstelmechanismen van het ruggenmerg.
- Fluorescentie labelen maakt het mogelijk om specifieke celtypen tijdens beeldvorming te volgen.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het beeldvormen van NPC interacties in het ruggenmerg.
- Om real-time interacties tussen NPC's en axonen te visualiseren.
- Om het begrip van cellulaire dynamica in modellen van ruggenmergletsel te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Ex vivo bereiding van het muizenruggenmerg.
- Inbedding van ruggenmergweefsel in 5% agarose.
- Twee-foton beeldvormingsopstelling met een geschikte beam splitter voor fluorescentie detectie.
- Superfusie met warm, geoxygeneerd RPMI medium tijdens de beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van NPC's en axonen in real time.
- Gedemonstreerde interacties tussen GFP-uitdrukkende NPC's en YFP-uitdrukkende axonen.
- Instandhouding van de levensvatbaarheid van NPC's gedurende maximaal 10 uur tijdens de beeldvorming.
- Inzichten verschaft in cellulair gedrag in een beschadigde ruggenmergomgeving.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is effectief voor het bestuderen van cellulaire interacties in het ruggenmerg.
- Twee-foton beeldvorming is een waardevol hulpmiddel voor real-time observatie van levende cellen.
- Deze methode kan helpen bij het begrijpen van herstel- en regeneratieprocessen van het ruggenmerg.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Two-photon imaging of live neural precursor cell (NPC) dynamics in the mouse spinal cord enables direct visualization of cellular migration, differentiation, and interaction with damaged axons. This capability provides mechanistic insight into remyelination processes relevant to neuroinflammatory demyelinating disorders, supporting predictive confidence in early-stage therapeutic hypotheses. The method addresses a critical gap in real-time, deep-tissue imaging for translational neuroscience and regenerative medicine portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of NPC migration and differentiation in disease-relevant tissue environments.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing cellular responses to axonal damage in real time.
- Facilitates functional target validation for cell-based therapies addressing demyelination.
- Provides quantitative data on NPC-axon interactions to inform portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Establishes validated ex vivo spinal cord systems for reproducible imaging workflows.
- Delivers quantitative outputs such as migration kinetics and remyelination events.
- Enables assay standardization for evaluating candidate cell populations or interventions.
- Supports reliable compound or cell therapy evaluation in a controlled environment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant models of neuroinflammation and demyelination.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of cell therapies.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on real-time cellular behavior in intact tissue.
- Supports translational biomarker identification through dynamic imaging of cellular processes.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative assessment of cell-based interventions in the spinal cord.
- Discovery Biology: Supports interrogation of NPC behavior and remyelination mechanisms in situ.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of interventions.
- Analytics: Delivers high-resolution, time-lapse data on cell migration and interaction dynamics.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models of neurodegeneration and repair.
- Enterprise Reuse: Offers a platform for diverse studies of transplanted or endogenous cell populations in the spinal cord.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell therapy mechanisms and target engagement.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing real-time evidence of therapeutic cell function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of regenerative medicine and neurorepair programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced microscopy and ex vivo tissue preparation.
- Demands access to two-photon imaging systems and fluorescence detection infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptable to various fluorescently labeled cell types and spinal cord regions.
- Limited by tissue viability and imaging duration constraints (up to 10 hours ex vivo).
