Name: Twee-foton Imaging van Cellular Dynamics in de Muis Spinal Cord (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Leer twee-foton imaging van fluorescerende neurale voorloper cellen en axonen in de muis ruggenmerg. Deze methode maakt real-time observatie van celinteracties mogelijk voor onderzoek naar ruggenmergherstel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (aan M.D.C.), R39 GM-048071 (aan I.P.), en R01 NS-074987 (aan T.E.L.) en de National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (aan C.M.W., T.E.L. en M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (aan M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (aan J.G.W.), en financiering van de George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).

OPMERKING: Ethiek Verklaring: Het protocol voor de behandeling van dieren werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Californië, Irvine, protocol # 2010-2943. 1. verwijderen van het ruggenmerg <ol><li> Leg papieren handdoeken bevochtigd met ~ 100% vloeibare isofluraan, USP in euthanizing kamer en plaats droog papieren handdoeken op de top. Plaats de muis in de kamer op de top van de droge papieren handdoeken, zodat de muis niet de isofluraan is het aanraken en zorg ervoor dat de kamer wordt gedekt. Wacht ten minste één minuut na ademstilstand zodat de muis gedood. </li><li> Voer een spinale doorsnijding van de nek te zorgen voor de muis gedood. Heeft een cervicale dislocatie niet uitvoeren, omdat dit het ruggenmerg kunnen beschadigen. </li><li> Spuit de muis met 70% ethanol aan het haar nat. </li><li> Gebruik scherpe Fine schaar om het haar en de huid van de rug van de muis te verwijderen om de wervelkolom van ongeveer cervicale lamina 1 bloot (C1) Naar sacrale lamina 4 (S4). </li><li> Met behulp van een scalpel met een # 10 blad maken incisies links en rechts van de wervelkolom te scheiden van spieren en vet. Dit zal verwijderen van het ruggenmerg veel gemakkelijker. </li><li> optioneel: een gebogen Luer rongeurs kan worden om weg te scheppen extra vlees. </li><li> Houd de bovenkant van de wervelkolom wervels met gekartelde Graefe tang, plaatst titanium gebogen Vannas schaar met de gebogen kant naar boven in de blootgestelde wervelkolom bij C1, zorg dat het ruggenmerg niet aan te raken. </li><li> Schuif de titanium gebogen Vannas schaar helemaal naar rechts en maak een kleine snede. Een kleine crunch geluid te horen en voelde als de schaar knippen de wervels. Herhaal deze bezuiniging op de uiterst linkse kant van het snoer. Wees voorzichtig niet te snel te gaan of te groot van een cut, omdat dit zal het risico schade aan het snoer met de schaar te maken. </li><li> De single laminaat moet kunnen worden opgeheven met de tang als de zijkanten van de wervels worden gesneden. Repeat, herhaal deze stap voor elk lamina tot S4, blijft vasthouden en trek het ruggenmerg wervels. OPMERKING: de wervels boven de transplantatie plaats zal waarschijnlijk komen uit wanneer het naar beneden wordt gesneden om de transplantatie plaats. Ga door met de procedure voor het starten van net onder de transplantatie plaats. </li><li> optioneel: leg de wervels naar beneden om te zien waar de transplantatie site is en meet en zaag ~ 20 mm rostraal en caudaal van de transplantatie plaats. OPMERKING: Wanneer het transplanteren van NPC&#39;s meer zal niet nodig zijn als de getransplanteerde NPC&#39;s in het algemeen niet verder migreren dan 15 mm. De hoeveelheid ruggenmerg nodig zullen afhankelijk experiment en migratie karakteristieken van celtype getransplanteerd zijn. Maken rostrale en caudale bezuinigingen die op gelijke afstand zijn de transplantatie site zal de transplantatie site om meer eenvoudig worden opgezocht tijdens de beeldvorming mogelijk te maken. </li><li> Met behulp van een scalpel met een # 11 blad knip de ganglia rechts en links van de buikzijde van het ruggenmerg vanaf de rostrale einde. Dit wziek maken het ruggenmerg gemakkelijker uit de ventrale wervels worden verwijderd. OPMERKING: snel gedaan (stappen 1,7-1,11), zal het ruggenmerg niet uitdrogen. Echter, 1x PBS toegediend aan het snoer om het vochtig te houden. </li><li> Keer de muis en houd de muis omhoog, zodat het ruggenmerg naar beneden is gericht. Trek voorzichtig uit het ruggenmerg met behulp van gesloten getande Graefe pincet. Zonder knikken het ruggenmerg, knip de resterende ganglia om het ruggenmerg te worden opgeheven in een enkele intacte stuk. </li><li> Zorg ervoor dat het ruggenmerg is in RPMI-1640 en plaats het op het ijs voor transport naar de 2P microscoop. </li></ol> 2. Voorbereiding van Spinal Cord for Imaging <ol><li> Inbedding ruggenmerg in agarose <ol><li> Houd de geïsoleerde ruggenmerg in gekoeld RPMI- 1640 op ijs voorafgaand aan de beeldvorming. </li><li> Weeg agarose (laag geleringstemperatuur) en bereiden een 5% oplossing in 5 ml 1x PBS. De magnetron van de 5% agarose oplossing voor 15 sec naar de ag ontbindenstond op en laat de oplossing afkoelen tot 37 ° C. </li><li> Bereid het ruggenmerg door het op een vel Parafilm met de ventrale zijde naar boven. </li><li> Pipet ongeveer 5 ml 5% agarose oplossing over de buikzijde van het ruggenmerg. Laat de agarose stollen door afkoelen tot kamertemperatuur. Volledige stolling duurt ongeveer 5 minuten. </li><li> Breng een dun laagje weefsel lijm op een 22 mm vierkante dekglas. </li><li> Keer de ingebedde ruggenmerg, het plaatsen van de buikzijde op Parafilm. De dorsale zijde wordt nu naar boven. Houden het deksel slip aan de dorsale zijde, en dompel de agarose ingebed ruggenmerg / dekglas voorbereiding in RMPI om de lijm stollen. Verwijder het teveel aan gestolde agarose met een scheermesje. </li></ol></li><li> Montage van het ruggenmerg op de microscooptafel <ol><li> Breng vaseline aan de onderkant van het dekglas. Hierdoor wordt het preparaat tijdens perfusie stabiliseren. </li><li> Plaats het ruggenmerg bereiding in eenbeeldvorming goed op de microscoop podium met de ventrale zijde naar boven in de richting van de 25X dompelen doelstelling. De custom-built beeldvorming en is ongeveer 20 mm diep, 50 mm lang en 50 mm breed. </li><li> Afbeelding superfusing terwijl het preparaat met de verwarmde (37 ° C), geoxygeneerde (95: 5 zuurstof: koolstof dioxide-carbogen) RPMI-1640 medium zonder serum. <ol><li> Pre-warm media tot 37 ° C in het waterbad en sluit deze aan op de slang pomp door het invoegen van de slang in de media fles. </li><li> Bewaar de mediumtemperatuur bij 37 ° C een verwarmingsinrichting op de aansluiting van de slang aan de kamer. Superfuse media door middel van goed op 3 ml / min met behulp van slangen aangesloten op de slang pomp (Figuur 1B). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 2P beeldvorming van ventrale Spinal Cord <ol><li> Microscoop Setup <ol><li> Acquire beelden van Thy1-eYFP ruggenmerg met behulp van een Chameleon Ultra Ti: Sapphire laser afgestemd op 900 nm. Verzwakken laservermogen op despecimen tot &lt;5% tot minimale fototoxiciteit 16 te verzekeren. Handhaaf de temperatuur te doorstromen zuurstof geperfundeerd RPMI-1640 bij een constante 37 ° C met een oplossing inline heater stabiele beeldweergave en weefsel drift en cellulaire schade voorkomen. </li><li> Om eGFP en eYFP fluorescent signaal te scheiden, plaats een 520 nm single-edge dichroic en een 560 nm single-edge dichroïsch straalsplitser in serie te 2P emissie scheiden in drie kanalen, met opzet het splitsen van de groene emissie om de zichtbaarheid te verbeteren. Opmerking: Deze kanalen worden aangeduid als blauwgroene (emissie &lt;520 nm), groen-geel (520-560 nm) en rood (emissie&gt; 560 nm). Fotomultiplicatorbuizen detecteren uitgestraalde licht in elk kanaal. </li></ol></li><li> Lokaliseren beeldvorming aandachtsgebieden <ol><li> Met behulp van het oculair en een helder veld lichtbron, richten de dompelen doel aan de ventrale rand van het ruggenmerg naar een referentiepunt in te stellen. </li><li> Zorg ervoor dat het omgevingslicht bron uit is en swjeuk 2P excitatie door het openen van de laser sluiter. </li><li> Indien beschikbaar, bij het zoeken weefsel voor gebieden van belang, gebruik dan een lagere resolutie, hoger volume zonder digitale zoom, en een hogere scansnelheid dan bij het verwerven van de uiteindelijke afbeeldingen. Typische instellingen met dit systeem bij het zoeken weefsel voor een regio van belang zijn: resolutie: 256 pixels; volume: x = 600 pm, y = 600 pm, z = 0-300 urn. </li><li> Let op de eYFP axonen in de buurt van de ventrale rand van het ruggenmerg. Tweede harmonische signaal van collageen (blauw) zal helderste zijn op de ruggenmergweefsel rand. Zoek de eYFP axonen net dorsale om de tweede harmonische signaal van de collageen en eYFP signaal wordt gevisualiseerd in de groen-geel-kanaal. </li><li> Zoek de transplantatie site in het longitudinale midden van het ruggenmerg bereiding 14. Voor muizen 1 dag na eGFP-NPC transplantatie, zoek de transplantatie plaats door zich te richten de bundel pad in het Z-vlak diep in het weefsel. De transplantatie plaats will enigszins variëren tussen de dieren, maar is over het algemeen gelegen ~ 200 micrometer uit de ventrale rand. Let op de clusters van eGFP-NPC&#39;s in de witte stof traktaten, dichter bij de ventrale en laterale randen bij muizen na dag 1 na de transplantatie. </li></ol></li><li> Verwerven laatste beelden <ol><li> Verwerven beeldresolutie van 512 pixels; volume: x = 270 um, y = 212 urn, en z = 100 pm gebruikt Slidebook 6 software. Compileren z-stacks door het verwerven van sequentiële brandpuntsvlakken in stappen van 2,5 micrometer. </li><li> Voer een bidirectionele scannen met goede interlace offset snelle kwantificering van mogelijke migratie voorwerpen waarborgen in het ruggenmerg. Zorg ervoor dat de ideale overname framerate om cellulaire snelheid te bepalen binnen het ruggenmerg is ongeveer 1 beeld / sec. OPMERKING: Imaging instellingen kunnen worden gewijzigd om individuele voorkeuren van de gebruiker, zoals de overname frame rate, beeldvorming resolutie en imaging volumes. Grotere beeldvorming volumes zullen over het algemeen langer duren om te verwerven tegen een given resolutie. </li><li> Analyseren, gewas, glad en pseudocolor afbeelding Slidebook bestanden met beeldanalyse software zoals Bitplane Imaris 7.7. Produceren laatste time-lapse video&#39;s door te kammen opeenvolgende beeldvorming volumes met behulp van een geautomatiseerd proces in Slidebook en Imaris. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+model+of+MS%3A+utility+for+understanding+disease+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment.</a> Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).</li>
<li>Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+repair+in+multiple+sclerosis%3A+the+role+of+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation.</a> Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).</li>
<li>Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+remyelination+is+induced+by+transplant+rejection+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis.</a> J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).</li>
<li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination%2C+axonal+sparing%2C+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).</li>
<li>Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+replacement+therapies+to+promote+remyelination+in+a+viral+model+of+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination.</a> J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).</li>
<li>Greenberg, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+remyelination+of+spinal+cord+axons+by+engrafted+neural+precursor+cells+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).</li>
<li>Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig1+function+is+required+for+remyelination+potential+of+transplanted+neural+progenitor+cells+in+a+model+of+viral-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination.</a> Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li>
<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+mismatch+results+in+neural+progenitor+cell+rejection+following+spinal+cord+transplantation+in+a+model+of+viral-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination.</a> Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).</li>
<li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+inflammatory+multiple+sclerosis+lesions+have+an+intermediate+activation+status%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status.</a> J Neuroinflammation. 10, 35(2013).</li>
<li>Coyle, P. K. Ch. 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoyle%2C+PK+%22Clinical+Neuroimmunology%3A+Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22">Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders</a>. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).</li>
<li>McManus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCP-1%2C+MCP-2+and+MCP-3+expression+in+multiple+sclerosis+lesions%3A+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).</li>
<li>Calderon, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+CXCL12+%28SDF-1alpha%29+in+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis%3A+regulation+of+CXCL12+expression+in+astrocytes+by+soluble+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein.</a> J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).</li>
<li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+transplantation+of+mouse+neural+stem+cells+into+the+spinal+cords+of+mice+infected+with+neurotropic+mouse+hepatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus.</a> J Vis Exp. 53, e2834(2011).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+two-photon+microscope+for+video-rate+Ca%282%2B%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging.</a> Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).</li>
<li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Vis Exp. 82, e50826(2013).</li>
<li>Farrar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li>
<li>Pakan, J. M., McDermott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+investigate+radial+glia+cell+behavior+using+two-photon+time-lapse+microscopy+in+an+ex+vivo+model+of+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development.</a> Front Neuroanat. 8, 22(2014).</li>
<li>Fenrich, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336, 1676-1681 (2012).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).</li>
<li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4-activated+B+cells+out-compete+Toll-like+receptor+9-activated+B+cells+to+establish+peripheral+immunological+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).</li>
<li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+phases+of+CD8+T+cell+response+in+the+lung+following+H1N1+influenza+infection+and+sphingosine+1+phosphate+agonist+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy.</a> PLoS One. 8 (3), e58033(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende belangen.

Real-time 2P beeldvorming van intact weefsel is nodig om NPC kinetiek en interacties na transplantatie in de gedemyeliniseerde muis ruggenmerg te onderzoeken. Intravitaal 2P beeldvorming wordt algemeen gebruikt om cellulaire dynamiek op de dorsale zijde van het ruggenmerg bepaald in levende muizen, en is gebruikt om dorsale demyelinisatie bestuderen demyeliniserende ziekte 17-19. Omdat getransplanteerde NPC migreren naar de ventrale witte stof, die te diep ligt ten afbeelding in situ middels 2P microscopie, e...

Muismodellen van demyelinisatie, met inbegrip van experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) en intracraniële infectie met neuroadapted muis hepatitis virus (MHV), zijn uitstekende tools waarmee moleculaire pathways en cellulaire interacties geassocieerd met de ziekte te bestuderen. Ze hebben geleid tot en ondersteunde de doeltreffendheid van FDA goedgekeurde farmaceutische therapieën, vooral gericht op beëindiging van auto-immuniteit en ontsteking 1. Echter, zodra endogene remyelinisatie is mislukt, de momenteel goedgekeurde behandelingen geen effectief herstellen lesies in het centrale zenuwstelsel. Derhalve-reparatie gerichte therapieën in dit stadium van de ziekte zijn cruciaal voor de verlichting van chronische symptomen en verbetering van de levenskwaliteit. Onlangs hebben neurale precursoren (NPC) op de voorgrond treden als een potentiële therapeutische en genezende modaliteit naar gebieden van ontsteking en demyelinisatie richten. Verschillende studies hebben het vermogen van NPCs om endogeno induceren gemarkeerdons remyelination en rechtstreeks deelnemen aan remyelination 2-8. Omdat NPC betrokken zijn bij directe remyelinisatie, is het noodzakelijk om hun kinetiek en interacties begrijpen met endogene cellen na transplantatie. Na transplantatie, NPC&#39;s migreren ventraal naar gebieden van witte stof schade, dan rostraal en caudaal ten opzichte van de transplantatie plaats van 5,9. De kinetiek van migratie verschillen in reactie op omgevingsfactoren; NPC getransplanteerd in een niet beschadigde ruggenmerg een grotere snelheden dan NPC getransplanteerd in een beschadigde ruggenmerg 6. Na een trekkende periode overgedragen NPC prolifereren schaal, met een hogere snelheid in een beschadigde ruggenmerg opzichte van een intacte ruggenmerg 6. Tenslotte, de meeste NPC differentiëren tot oligodendrocyten en start direct remyelinisatie 4,6,9. De gedemyeliniseerde laesie is complex en kan een diverse populatie van cellen in verschillende fasen van eenctivation. Zo kan een werkzame multiple sclerose (MS) laesie, zoals een aanzienlijke populatie van geactiveerde T-cellen, M1 microglia en macrofagen M1, maar een chronische stille MS laesie kan bestaan ​​voornamelijk reactieve astrocyten met weinig ontstekingscellen 10-13. Door de diversiteit van effector cellen, twee-foton (2P) beeldvorming in muismodellen van demyelinisatie is een uiterst nuttig hulpmiddel om te helpen begrijpen lokale cellulaire interacties binnen de laesie. Bij MS en vele schaal gebruikt MS onderzoeksmodellen, de meeste laesies zijn gelegen aan de buikzijde van het ruggenmerg, een gebied ontoegankelijk voor intravitale 2P beeldvorming door laesiediepte en het hoge vetgehalte van het ruggenmerg. Om deze problemen en de studie van cel-cel interacties binnen laesies te omzeilen langs de ventrale ruggenmerg hebben we ontwikkelden een eenvoudige ex vivo 2P beeldvorming voorbereiding 6. Deze studie volgt op een eerdere methoden publicatie, waaruit bleekde procedure verplanten versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) -expressie NPC in het ruggenmerg van muizen na JHMV stam van MHV-geïnduceerde demyelinisatie 14. Vijf weken oude muizen besmet met JHMV en getransplanteerd met eGFP-NPC&#39;s op thoracaal niveau 9 op dag 14 na de infectie. De hier gepresenteerde protocol voorziet in gedetailleerde stappen over hoe het ruggenmerg te extraheren, maken een ex vivo agarose voorbereiding, en het beeld getransplanteerde eGFP-NPC interacties met verbeterde geel fluorescerend eiwit (eYFP) -expressie axonen. Muizen die eYFP onder neuronale specifieke Thy1 promoter werden in deze procedure 15. Slechts een deel van de axonen uiten eYFP, waardoor het nuttig voor de beeldvorming van de individuele axonen. Hier laten we ruggenmerg verwijderd na 7 dagen na de transplantatie; kan echter ruggenmerg op elk tijdstip na de transplantatie worden gewonnen. Terwijl tonen wij interacties van NPC met beschadigde axonen kunnen ons protocol worden gebruikt in combinatie met genetische fluorescente merkersandere celtypen een veelheid van cellulaire interacties die zich gedurende de muis ruggenmerg onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal Critical Care, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>sharp</td></tr><tr><td>scalpel blade #10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Luer rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15615-08</td><td></td></tr><tr><td>scalpel blade #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>12-115F</td><td></td></tr><tr><td>agarose, low gelling temperature</td><td>Sigma</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (tissue adhesive)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>22 mm square cover slip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td></td></tr><tr><td>25X dipping objective, 1.1 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW</td><td></td></tr><tr><td>Single inline solution heater</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>520 nm single-edge dichroic beam splitter</td><td>Semrock</td><td>FF520-Di02-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>560 nm single-edge dichroic beam splitter</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>photomultiplier tubes</td><td>Hamamatsu</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>C/L variable-speed tubing pump</td><td>Masterflex</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>digital thermometer</td><td>Comar Instruments</td><td>3501</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser&nbsp;</td><td>Coherent</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6 software</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.7 software</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

twee-foton imaging van cellular dynamics in de muis spinal cord

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Twee-foton (2P) microscopie wordt gebruikt om cellulaire dynamica en interacties diep in levende, intacte weefsels te onthullen. Hier presenteren we een methode voor live-celbeeldvorming in het muizenruggenmerg. Deze techniek is uniek geschikt om neurale voorloperceldynamica (NPC) te analyseren na transplantatie in ruggenmergen met neuroinflammatoire demyeliniserende aandoeningen. NPCs migreren naar locaties van axonaal letsel, prolifereren, differentiëren in oligodendrocyten en nemen deel aan directe remyelinisatie. NPCs zijn daardoor een veelbelovende therapeutische behandeling om chronische demyeliniserende ziekten te verlichten. Omdat getransplanteerde NPCs naar de beschadigde gebieden aan de ventrale kant van het ruggenmerg migreren, is traditionele intravitale 2P-beeldvorming onmogelijk en was er eerder alleen informatie over statische interacties beschikbaar met behulp van histochemische kleuringsbenaderingen. Hoewel deze methode werd ontwikkeld om getransplanteerde NPCs in het ventrale ruggenmerg te beeldvormen, kan deze worden toegepast op tal van onderzoeken naar getransplanteerde en endogene cellen in het gehele ruggenmerg. In dit artikel demonstreren we de voorbereiding en beeldvorming van een ruggenmerg met axenen die geverbeterd geel fluorescent eiwit tot expressie brengen en getransplanteerde NPCs die geverbeterd groen fluorescent eiwit tot expressie brengen.

<html> Terwijl de geëxplanteerde ruggenmerg beeldvorming protocol kan worden gebruikt om fluorescentie binnen het ruggenmerg visualiseren, onze representatieve resultaten tonen eGFP-NPC interacties met eYFP-axonen. Eerst geven we de ingebedde ventrale ruggenmerg preparaat in figuur 1A. Vervolgens laten we de 2P microscoop setup en belangrijke onderdelen in figuur 1B. Figuur 2 toont eGFP en eYFP fluorescentie in één z-stack binnen de ventrale ruggenmerg. Overname van opeenvolgende z-stack...

Een nieuw ex vivo voorbereiding voor het afbeelden van de muis ruggenmerg. Dit protocol maakt twee-foton beeldvorming van levende cellulaire interacties gehele ruggenmerg.

Twee-foton Imaging van Cellular Dynamics in de Muis Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om interacties tussen fluorescent gelabelde getransplanteerde neurale precursorcellen (NPC's) en fluorescerende axonen in het ruggenmerg van de muis in real-time in beeld te brengen. Dit wordt bereikt door het ruggenmerg van muizen waarin NPC's zijn getransplanteerd zorgvuldig te verwijderen, in te bedden in 5% aros en aan een dekglas te bevestigen. De oriëntatie van het ruggenmerg kan worden aangepast om fluorescentie in elk gebied van het ruggenmerg te kunnen bekijken.In de tweede stap wordt het ruggenmergpreparaat op de tweefoton-beeldvormingstafel geplaatst voor de beeldvorming van levensvatbare NPC's, terwijl deze tot 10 uur lang worden geperfuseerd met warm, oxygenated RPMI-medium. Een geschikte single-edge dichroïsche straalsplitser wordt gebruikt om de YFP- en GFP-emissies te scheiden. Uiteindelijk maakt tweefoton-beeldvorming de real-time visualisatie mogelijk van de interacties tussen de GFP-expresserende NPC's en de YFP-expresserende axonen in het beschadigde ruggenmerg.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van neurodegeneratie, zoals wat de moleculaire en cellulaire signaleringsfactoren

two-photon-imaging-of-cellular-dynamics-in-the-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een minimaal invasieve protocol om de muis te wervelkolom te stabiliseren en uit te voeren...

In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton Microscopie

Source: Maruoka, H., et. al. Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice. J. Vis. Exp. (2022)     This video shows a two-photon microscopy procedure for imaging neuronal activity and microglial dynamics in an awake mouse during visual stimulation, highlighting calcium transients and cellular interactions.

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse

Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

In deze video, beschrijven we een werkwijze voor het implanteren van een chronische optische beeldvorming kamer via dorsale ruggenmerg van een levende muis. De kamer, chirurgische ingreep, en chronische beeldvorming worden beoordeeld en aangetoond.

Een procedure voor het implanteren van een Spinal Kamer voor Longitudinaal In Vivo Beeldvorming van de Muis Spinal Cord

Twee-foton intravital beeldvorming kan worden gebruikt om interacties tussen verschillende celtypen in het ruggenmerg in hun oorspronkelijke weefselomgeving in een botmerg chimerisch dier met een traumatische ruggenmergverplettering in de dorsale kolom te onderzoeken.

Intravitale Imaging van Axonale Interacties met Microglia en macrofagen in een muis Dorsale Column Crush Injury

We voeren een in vivo imaging methode met behulp van twee verschillende fluorescente kleurstoffen om dynamische spinale vasculaire wijzigingen na een contusive dwarslaesie bij volwassen Sprague-Dawley ratten te houden.

Een In Vivo Duo-kleur methode voor Imaging-vasculaire Dynamics na Contusive dwarslaesie

Dit protocol beschrijft implantatie van een glas venster op het ruggenmerg van een muis om visualisatie te vergemakkelijken door intravital microscopie.

Implantatie van de laminectomie en het ruggenmerg in de muis

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Leer twee-foton imaging van fluorescerende neurale voorloper cellen en axonen in de muis ruggenmerg. Deze methode maakt real-time observatie van celinteracties mogelijk voor onderzoek naar ruggenmergherstel.

Twee-foton Imaging van Cellular Dynamics in de Muis Spinal Cord

Meer video's verkennen