Voorbereiding van de Single-cell Charms voor Cytofluorimetric Analyse van verschillende Mouse Skin Regio

Het algemene doel van deze procedure is het bereiden van een suspensie van enkelvoudige cellen uit de muizenhuid om de verschillende populaties residentie immuuncellen te identificeren via cytofluorimetrische analyse, en om deze verschillende populaties van in de huid residente immuuncellen te identificeren en te isoleren. Met deze techniek kunnen onderzoekers monsters uit verschillende regio's van de muizenhuid eenvoudig verteren zonder de relevante oppervlaktemarkers van de immuuncellen te beschadigen.

Om huidmonsters van het muisoor te verkrijgen, knipt u de haarloze delen van de oren af en gebruikt u een pincet om de dorsale en ventrale zijden van de organen uit elkaar te trekken. Schraap vervolgens voorzichtig de binnenkant van het oor om eventueel resterend kraakbeen te verwijderen. Om grotere stukken huid te verkrijgen, scheert u al het haar van het dier met een tondeuse, gevolgd door het aanbrengen van een ontharingslotie.

Reinig na enkele minuten de lotion en maak een verticale incisie in het midden van de rug van de muis, waarbij de incisie wordt doorgezet langs de randen van de geschoren gebieden rond het lichaam van de muis. Houd de huid met een pincet op zijn plaats terwijl u het weefsel scheidt met de gesloten, afgeronde punten van een chirurgische schaar of een scalpel, en scheid voorzichtig de huid van het peritoneum en de rugspieren. Dompel de huid vervolgens onder in een 100mm celluulteelplaat met 10ml ijskoud PBS en gebruik een pincet om het subcutane vet weg te schrapen.

Om een staarthuidsample te verkrijgen, wordt de staart afgeknipt en wordt er met een chirurgische schaar een verticale incisie gemaakt vanaf de basis van de staart tot aan de punt. Pak met een pincet de rand van de incisie bij de basis van de staart vast en trek vervolgens de huid voorzichtig richting de punt terwijl de staart zelf met een tweede pincet wordt vastgehouden. Verwijder eventueel overtollig vet door het huidsample voorzichtig af te schrapen.

De poot van de muis wordt ingesneden; gebruik vervolgens een chirurgische schaar om de huid van het voetzoolkussen longitudinaal in te snijden vanaf de enkel tot het begin van de tenen, waarbij erop wordt gelet dat er geen haar wordt doorgesneden, om zo een huidmonster te verkrijgen. Pak vervolgens de enkelbeentjes vast met een pincet terwijl u de huid met de andere vastgrijpt en trek de huid richting de tenen, zoals bij het uittrekken van een handschoen. Om de huidcellen te labelen, wordt het weefsel van elk monster na elkaar overgebracht naar een petrischaal van 35 millimeter met 2 milliliters vers bereide digestiecocktail.

Knip het monster met een schaar in kleine stukjes en incubeer de weefselfragmenten gedurende 90 minuten bij 37 °C, waarbij tijdens de incubatieperiode één tot twee keer voorzichtig wordt geschud. Giet vervolgens het gedigesteerde huidweefsel door een cellzeef van 70 µm in een petrischaal van 66 mm die 1 mL RPMI 1640 bevat, aangevuld met FBS per schaal. Spoel de zeef met vijf milliliter vers medium en gebruik daarna de zuiger van een spuit om de monsters door het gaas van de zeef te persen.

Spoel de zuiger, de schaal en de zeef met 20 milliliters vers medium en overbreng de weefselsuspensie naar een 50 milliliter conische buis. Nadat alle monsters zijn verwerkt, worden de cellen gecentrifugeerd en de pellets opnieuw gesuspendeerd in 100 microliters per monster van twee micrograms per milliliter anti CD16 CD32 blockeringsantilichaam in PBS plus 1% FBS. Na 15 minuten bij vier degrees celsius worden 100 microliters van het antilichaam, zoals aangegeven in de tabel, aan de betreffende monsters toegevoegd voor 30 minuten bij vier degrees celsius, beschermd tegen licht.

Was na afloop van de incubatie de cellen in één milliliter PBS plus FBS en resuspendeer de pellets in 300 µL FBS PBS. Label de cellen vervolgens met 2 µg/mL DAPI gedurende 10 minuten bij 4 °C, beschermd tegen licht. Om de leukocyten te isoleren, moet eerst de DAPI-positieve populatie worden gegated om de dode cellen te elimineren.

Select vervolgens de singlets in een plot van forward scatter area tegenover forward scatter width en gate de cellen op basis van de grootte en granulariteit van de leukocyten van belang. Selecteer daarna de CD45-positieve cellen en identificeer vervolgens voor elk monster de huid-dendritische celpopulaties aan de hand van hun CD11C- en MHC-klasse II-expressie. Identificeer de macrofagen aan de hand van hun CD64- en F480-expressie, de B-cellen aan de hand van hun CD19- en MHC-klasse II-expressie en de T-cellen aan de hand van de CD4- of CD8-expressie.

De isolatie van immuuncellen uit de huid, zoals zojuist gedemonstreerd, levert een populatie op van meer dan 50% levensvatbare cellen uit alle regio's van de huid, waarvan er tussen de 5 000 en 15 000 per vierkante centimeter CD45-positief zijn. Een voldoende aantal dendritische cellen, macrofagen, B-cellen en T-cellen kan ook worden verkregen uit één vierkante centimeter muishuid voor verdere analyse, zoals aangegeven. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe een niet-ontstoken huidweefsel moet worden gedigesteerd en hoe de leukocyten voor FACS-analyse moeten worden geïsoleerd.