Voorbereiding van de Single-cell Charms voor Cytofluorimetric Analyse van verschillende Mouse Skin Regio
20 april 2016
De huid is de thuisbasis van een complex netwerk van immuuncellen. We beschrijven een efficiënte methodologie voor het verteren van muizenhuid, uit verschillende delen van het lichaam van het dier, om een enkele celsuspensie te verkrijgen en de verschillende leukocytenpopulaties die in de huid aanwezig zijn te analyseren door middel van flowcytometrie.
Het algemene doel van deze procedure is om een enkele cel suspensie voor te bereiden van de muishuid om de verschillende populaties van residente immuuncellen te identificeren via cytofluorimetrische analyse. om de verschillende populaties van residente immuuncellen in de huid te identificeren en isoleren. Met behulp van deze techniek kunnen onderzoekers gemakkelijk de monsters uit verschillende regio's van de muishuid verteren zonder schade aan de oppervlakte markers van de immuuncellen van belang.
Om huidmonsters van het muisonoor af te halen, snijdt u de haarloze delen van de oren af en gebruikt u pincetten om de dorsale en ventrale kanten van de organen uit elkaar te trekken. Scheer vervolgens voorzichtig het binnenoor om eventueel overgebleven kraakbeen te verwijderen. Om huidmonsters in blokken te verkrijgen, scheer al het haar van het dier af met een schaar, gevolgd door het aanbrengen van ontharingslotion.
Na een paar minuten verwijdert u de lotion en maakt u een verticale snede in het midden van de rug van de muis en verlengt u de incisie langs de randen van de geschoren gebieden rond het lichaam van de muis. Gebruik pincetten om de huid op zijn plaats te houden terwijl u het monster scheidt met de gesloten, rondrandige uiteinden van een paar chirurgische schaar of een scalpel, scheidt u voorzichtig de huid van het peritoneum en de rugspieren. Dompel vervolgens de huid onder in een 100 mm celkweekplaat met 10 ml ijskoud PBS en gebruik pincetten om het onderhuidse vet weg te schrapen.
Om een staarthuidmonster te verkrijgen, snijdt u de staart af en gebruikt u chirurgische schaar om een verticale snede te maken vanaf de basis van de staart tot aan de punt. Gebruik pincetten om de rand van de incisie aan de basis van de staart vast te pakken, pak vervolgens het lichaam van de staart met een ander paar pincetten en trek de huid voorzichtig naar de punt. Verwijder eventueel overtollig vet door voorzichtig het huidmonster te schrapen.
De voet van de muis wordt doorgesneden en vervolgens, om een huidmonster van de voetkussen te verkrijgen, gebruikt u chirurgische schaar om de huid van de voet longitudinaal vanaf de enkel tot aan het begin van de tenen door te snijden, waarbij u ervoor zorgt dat u geen haar snijdt. Grijp vervolgens de enkelbeenderen met pincetten terwijl u de huid met de andere vastpakt en trek de huid naar de tenen als bij het verwijderen van een handschoen. Om de huidcellen te labelen, brengt u voor elk monster op zijn beurt het weefsel over in een 35 millimeter petrischaaltje met 2 milliliter vers bereide verteringscocktail.
Snijd het monster met schaar in kleine stukjes en incubeer de weefselfragmenten gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius met één tot twee zachte schudbewegingen tijdens de incubatieperiode. Giet vervolgens het verteerde huidweefsel op een 70 micron celzeef in een 66 millimeter petrischaaltje met 1 milliliter RPMI 1640 gesupplementeerd met FBS per schaaltje. Was de zeef met vijf milliliter vers medium en gebruik vervolgens een spuitplunger om de monsters door het gaas van de zeef te persen.
Spoel de plunjer, schaal en zeef af met 20 milliliter vers medium en breng het weefselslurry over in een 50 milliliter conische buis. Nadat alle monsters zijn verwerkt, centrifugeert u de cellen en suspendeert u de pellets opnieuw in 100 microliter per monster van twee microgram per milliliter anti CD16 CD32 blokkerende antilichaam in PBS plus 1%FBS. Voeg na 15 minuten bij vier graden Celsius 100 microliter antilichaam toe zoals aangegeven in de tabel aan de juiste monsters gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius beschermd tegen licht.
Aan het einde van de incubatie wast u de cellen in één milliliter PBS plus FBS en suspendeert u de pellets opnieuw in 300 microliter FBS PBS. Label vervolgens de cellen met 2 microgram per milliliter DAPI gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius beschermd tegen licht. Om de leukocyten te isoleren, stelt u eerst de DAPI-positieve populatie in om de dode cellen te elimineren.
Selecteer vervolgens de singlets in een voorwaartse verstrooiingsgebied door voorwaartse verstrooiingsbreedte plot en stel de cellen in op basis van de grootte en granulariteit van de geïnteresseerde leukocyten. Selecteer vervolgens de CD45-positieve cellen en identificeer vervolgens voor elk monster de huid dendritische celpopulaties op basis van hun CD11C en MHC klasse twee expressie. Identificeer de macrofagen op basis van hun CD64 en F480 expressie, de B-cellen op basis van hun CD19 en MHC klasse twee expressie en de T-cellen op basis van de CD4 of CD8 expressie.
De isolatie van huid immuuncellen zoals zojuist aangetoond, levert een populatie op van meer dan 50% levensvatbare cellen uit alle huidgebieden, tussen de 5.000 en 15.000 per vierkante centimeter waarvan CD45 positief is. Een voldoende aantal dendritische cellen, macrofagen, B-cellen en T-cellen is ook verkrijgbaar voor downstream-analyse van één vierkante centimeter muishuid, zoals aangegeven. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een niet-ontstoken huidweefsel kunt verteren en de leukocyten voor fax-analyse kunt isoleren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methodologie voor het bereiden van een single-cell suspensie van muishuid om residente immuuncelpopulaties te analyseren. De techniek maakt de digestie van huidmonsters uit verschillende regio's mogelijk zonder de oppervlaktemarkers van immuuncellen te beschadigen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Flowcytometrie
Achtergrond
- De huid bevat een divers netwerk van immuuncellen.
- Inzicht in deze populaties is cruciaal voor het bestuderen van de immuniteit van de huid.
- Flowcytometrie is een sleuteltechniek voor het analyseren van celpopulaties.
- Een efficiënte monsterpreparatie is essentieel voor accurate resultaten.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het isoleren van immuuncellen uit muishuid.
- Het vergemakkelijken van de identificatie van verschillende leukocytenpopulaties.
- Het verbeteren van de analyse van immuunresponsen in de huid.
Gebruikte methoden
- Monstername uit verschillende regio's van de muizenhuid.
- Gebruik van pincetten en schraaptechnieken voor monsterbereiding.
- Toepassing van depilatoire lotion voor ontharing.
- Flowcytometrische analyse om immuuncelpopulaties te identificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van enkelcel-suspensies uit muishuid.
- Identificatie van verschillende populaties residente immuuncellen.
- Behoud van oppervlaktemarkers tijdens het digestieproces.
- Verbeterd inzicht in de dynamiek van immuuncellen in de huid.
Conclusies
- De beschreven methodologie is effectief voor het bestuderen van de immuniteit van de huid.
- Flowcytometrie biedt waardevolle inzichten in immuuncelpopulaties.
- Deze benadering kan worden toegepast in diverse onderzoekcontexten binnen de immunologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Efficiënte bereiding van enkelcel-suspensies uit verschillende huidregio's van de muis maakt immuuncelprofilering met hoge getrouwheid mogelijk, wat essentieel is voor vroege ontdekking en doelwitvalidatie in dermatologisch en immunologisch onderzoek. Deze methodologie ondersteunt robuuste fenotypische screening en kwantitatieve analyse van huid-residenten leukocytenpopulaties, wat direct bijdraagt aan mechanische risicoreductie en voorspellende betrouwbaarheid bij cruciale beslismomenten in de ontwikkelingspijplijn. Betrouwbare celisolatie en behoud van markers vergemakkelijken grootschalige studies naar immuunresponsen op omgevings- en microbiële stimuli.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt analyse van de heterogeniteit van immuuncellen in verschillende huidregio's mogelijk voor validatie van targets.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door de expressie van oppervlakteantigenen tijdens celisolatie te behouden.
- Faciliteert kwantitatieve beoordeling van immuuncelsubsets voor voorspellende betrouwbaarheid in vroege stadia van programma's.
Screening & assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde single-cell suspensies die geschikt zijn voor downstream flowcytometrie en fenotypische screening.
- Garandeert reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over verschillende anatomische locaties, ter ondersteuning van pipelines voor assayontwikkeling.
- Biedt een hoge celviabiliteit en markerintegriteit, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen of biomarkers mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt immuuncelprofilering uit met ziekte-relevante huidmodellen voor translationele biomarkerstudies.
- Bewaart de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door consistente immuunmonitoring mogelijk te maken.
- Ondersteunt beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang op basis van robuuste kwantificering van immuuncellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door gestandaardiseerde isolatie van immuuncellen uit meerdere huidregio's mogelijk te maken voor flowcytometrische analyse.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door gedetailleerde analyse van immuuncel-subsets mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare single-cell suspensies met behouden oppervlaktemarkers voor reproduceerbare screening-workflows.
- Analytics: Levert kwantitatieve resultaten van leukocytenpopulaties, ter ondersteuning van vergelijkende analyses tussen verschillende condities en regio's.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert afstemming met ziekte-relevante modellen en biomarkerstrategieën bij het bestuderen van huidimmuniteit.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar, gestandaardiseerd protocol dat aanpasbaar is aan diverse huidregio's en experimentele contexten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en de targetvalidatie door nauwkeurige profilering van immuuncellen mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows voor celisolatie en kleuring voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium door middel van robuuste immuunmonitoring.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van dermatologische en immunologische programma's.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefseldissectie, enzymatische digestie en flowcytometrie-analyse.
- Toegang tot flowcytometers en gevalideerde antilichaampanels voor de identificatie van immuuncellen is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van monsterverwerking en gating-strategieën tussen teams.
- Aanpasbaar aan verschillende regio's van de muizenhuid, maar kan optimalisatie vereisen voor ontstoken of zieke weefsels.
- De celopbrengst en viabiliteit kunnen variëren per anatomische locatie en moeten empirisch worden bepaald.
