Normale en maligne Muscle Cell Transplantation in immuungecompromiteerde Adult zebravis

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van het prepareren en transplanteren van normaal en maligne spierweefsel van transgene donor-zebravissen naar rag2-immuundeficiënte zebravis-recipiënten. Spiertransplantatie begint met het isoleren van fluorescent gelabelde spieren door dissectie van de dorsale musculatuur.

Na homogenisatie worden de spiercellen van de zebravissen gefilterd en omgezet in een suspensie van enkelvoudige cellen. Vervolgens worden de cellen intramusculair getransplanteerd in rag2-mutante zebravissen. Met epiflorescentiemicroscopie wordt vervolgens de weefselingroei in de ontvangende dieren gevolgd, al vanaf 10 dagen na transplantatie. Op soortgelijke wijze kan een primair embryonaal rhabdomyosarcoom worden geoogst, omgezet in een suspensie en intraperitoneaal worden getransplanteerd in rag2-mutante zebravissen.

Vervolgens wordt microscopie gebruikt om de weefselingroei te volgen en de gepropageerde tumorcellen kunnen worden ingezet in downstream-applicaties. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van celtransplantatie in immuungecompromitteerde volwassen zebraviscellen is dat het een universeel platform biedt voor allograft-transplantatie van diverse weefsels en tumortypen. Weefsels kunnen worden getransplanteerd vanuit verschillende genetische donorachtergronden zonder dat immuunsuppressie bij de ontvangende vissen noodzakelijk is.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de stamcel- en regeneratieve biologie, zoals de zelfvernieuwingscapaciteit van progenitorcellen. We kunnen deze methoden ook gebruiken om tumoren te enten in rag2-mutante vissen, om vervolgens nieuwe chemicaliën te identificeren die bijvoorbeeld tumorgroei remmen. De preparatie en transplantatie van normale en maligne spiercellen zullen worden uitgevoerd door Chin, Tang en Anes, twee getalenteerde promovendi in het LAL-lab. Begin met het offeren van donor-zebravissen met fluorescent gelabelde spieren.

Typische volwassen alpha-acting RFP-donorvissen leveren tussen de 500.000 en 2 miljoen spiercellen op. In ons voorbeeldexperiment gebruiken we 30 donorvissen voor transplantatie in 20 ontvangersvissen met elk een miljoen cellen. Droog het dier na het euthanaseren van de donorvis door het op een wegwerppapieren handdoek te plaatsen.

Gebruik een scheermesje om de dorsale musculatuur te oogsten. De snede moet onder een hoek van 45 graden posterior van de anale regio worden gemaakt, inclusief botten en huidweefsel. Breng 10 geoogste dorsale musculatuurssecties over naar een schone Petrischaal. Voeg vervolgens 500 µL gekoelde 0.9 XPBS 5%FBS suspensiebuffer toe.

Hak het weefsel vervolgens fijn tot een uniforme suspensie is verkregen en homogeniseer het weefsel volledig met een serologische pipet van 5 mL. Voeg 2 mL suspensiebuffer toe aan het homogenaat en trek de suspensie vervolgens 20 keer door de pipet. Filter daarna de suspensie met een zeef van 40 micron en verzamel de cellen in een conische buis van 50 mL op ijs. Houd de cellen gedurende de rest van de procedure koud.

Was het resterende weefsel in de zeef met 2,5 milliliters suspensiebuffer en zeef dit in de 50 milliliter conische buis. Tel vervolgens het totaal aantal levensvatbare cellen met behulp van trypan blue en concentreer deze door centrifugatie bij 1000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer de cellen daarna in 0,9 XPBS met 5% FBS bij een concentratie van 333 000 cellen per microliter.

Als het aantal donorcellen beperkt is, kan zelfs 50 000 geïnjecteerde cellen al leiden tot een succesvolle transplantatie. Begin met het anesthetiseren van twee tot vier maanden oude rag2-deficiënte vissen in trica. Wanneer de kieuwbewegingen traag zijn en de vis stil ligt, verplaats de vis naar een vochtige handdoek met de linkerkant van de vis naar boven.

Gebruik nu een vooraf gereinigde microspuit van 10 µL met een naaldmaat van 26 gauge om drie µL van de bereide spiercel-suspensie te injecteren. De injecties moeten onder een hoek van 45 graden worden uitgevoerd en direct in de dorsolaterale musculatuur van de ontvangende vis worden geïnjecteerd. Het is belangrijk om er bij het uitvoeren van intramusculaire transplantatie op te letten dat er een totaal volume van minder dan drie µL in de ontvangende vis wordt geïnjecteerd. Plaats de ontvangende vis vervolgens voorzichtig in een herstelbak met schoon systeemwater voor vissen.

Zet voort met het injecteren van de resterende vissen en plaats deze in één herstelbak. Beoordeel vervolgens de graft-percentages op 10, 20 en 30 dagen na transplantatie met behulp van brightfield- en epifluorescentiemicroscopie. Verwerk elke tumor afzonderlijk.

Offer een vis met een embryonaal rhabdomyosarcoom. Plaats de vis in een schone Petrischaal en disseceer de tumor weg van de niet-maligne weefsels met behulp van een scheermesje en fijne pincetten. Een zorgvuldige dissectie rondom de tumor leidt tot een hogere zuiverheid van de verkregen celsuspensie met minimale contaminatie van het omringende spierweefsel. Draag de gedissecteerde tumor over naar een nieuwe schaal en voeg 100 µL vooraf gekoelde 0.9 XPBS 5%FBS suspensie-buffer toe.

Hak het weefsel vervolgens met een scheermesje fijn totdat een uniforme suspensie is verkregen. Voeg daarna met een pipette van 1 ml nog eens 900 µL buffer toe, gevolgd door tritureren. Trek de suspensie meerdere keren door de pipette om de cellen te dissociëren.

Filter de cellen nu door een cellenzeef van 40 micron. Spoel de plaat door nog eens twee tot vier milliliter suspensie en buffer toe te voegen en dit door dezelfde cellenzeef te filteren. Concentreer de cellen zoals voorheen.

Houd de cellen op ijs. Resuspendeer de cellen vervolgens in 100 µL buffer en tel de levensvatbare cellen met behulp van tryaanblauw. Pas de concentratie van de celsuspensie aan tot 5 000 cellen per µL.

Anestheseer vervolgens de twee immuungecompromitteerde ontvangende zebravissen en plaats deze op een schoon papieren handdoekje met de ventrale zijde naar boven. Injecteer met een gereinigde spuitnaald van 26 gauge het gewenste volume in de peritoneale holte van de ontvangende zebravissen hier.

Er worden 25 000 cellen geïnjecteerd in vijf microliters. Er kunnen echter tot 10 microliters met succes worden geïnjecteerd. Laat de geïnjecteerde vissen herstellen in een herstelbak voordat ze worden teruggeplaatst in het hoofdsysteem.

Volg later de ontvangervissen voor engraftment met behulp van epifluorescentiemicroscopie en oogst de cellen voor vervolgstudies. Met de beschreven procedure werden skeletspiercellen van alpha actin RFP transgene donoren getransplanteerd in immuungecompromitteerde homozygote rag twee mutante zebravisjes. Het skeletspierweefsel leverde een enkelcelсусpensie op die 84,3% levensvatbare cellen bevatte, zoals vastgesteld door DPI-exclusie.

Na flowcytometrie-analyse bleek dat RFP-positieve cellen 35,3% van deze donorcel-suspensie vormden. Transplantatie van cellen in de dorsale skeletspier van RAG2 homozygote mutante ontvanger-vissen leidde tot een consistente en sterke graftname. Dit werd bevestigd door de vorming van meerkernige fluorescerende spiervezels in de ontvanger-vissen; wildtype ontvanger-vissen vertoonden geen graftname van spiervezels.

Echter, 10 dagen na transplantatie bevatten negen van de 14 mutante zebravisse RFP-positieve spiervezels nabij de injectieplaats. Belangrijk is dat de gegraftede RFP-positieve spieren tot ten minste 30 dagen na transplantatie aanwezig bleven. Evenzo werd een robuuste grafting verkregen na transplantatie van RAG2-mutante vissen met embryonaal rhabdomyosarcoom of ERMS.

De getransplanteerde ERMS vertoonde histologische kenmerken die overeenkwamen met de primaire ERMS-tumor; de heterogeniteit van de tumorcellen bleef behouden, zoals vastgesteld via fluorescentieanalyse. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het uitvoeren van musculaire transplantatie en intraperitoneale transplantatie van normaal en maligne weefsel met behulp van immuungecompromitteerde volwassen vissen als recipienten. Vervolgens kunnen andere methoden, zoals fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS), limiteringsverdunning-transplantatieanalyse en real-time PCR, worden uitgevoerd om functionele en moleculaire verschillen tussen verschillende tumor-subpopulaties te beoordelen.

Over het algemeen maakt onze aanpak de robuuste en langdurige transplantatie van fluorescent spier- en maligne weefsel in immuungecompromitteerde RAG twee mutante vissen mogelijk. Het voordeel van deze aanpak is dat de transplantatie plaatsvindt zonder voorafgaande immunosuppressie van de ontvangende vis en dat immuunmatching tussen donor- en recipientdieren niet vereist is.