Name: Gebruik makend van Muriene Induceerbaar Telomerase Allelen in de Studies van weefseldegeneratie / Regeneration en Kanker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Leer hoe je inductibele telomerase-allelen in muizen genereert voor onderzoek naar weefseldegeneratie, regeneratie en kanker. Deze methode maakt reactivatie van telomerase mogelijk om veroudering en tumorgenese te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.H. wordt ondersteund door NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) en NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

OPMERKING: Alle stappen in dit protocol zijn door UT MD Anderson Cancer Center goedgekeurd. 1. Generatie van mTERT-ER Allele <ol><li> Introduceren knock-in targeting vector die het ERT2-LBD (ligandbindingsdomein) stroomopwaarts en in frame met de mTERT genomische sequentie (exon 1 tot intron 2) en een Lox - PGK - Neo - Lox fragment (figuur 1A) in muizen ES cellen met elektroporatie. </li><li> De cultuur van de ES-cellen in neomycine voor 6-10 dagen. Pick neomycine-resistente klonen en uit te breiden in 48 well platen. Pak het genomische DNA met behulp van een commerciële kit en bevestig de knock-in allel door Southern blot. </li><li> Injecteren twee ES lijnen met meer dan 95% normaal karyotypes in C57BL / 6 blastocysten met een Micromanipulatie kit onder een omgekeerde microscoop. Implanteren de blastocysten in de baarmoeder van de draagmoeder 23. Mate de hoogwaardige mannelijke chimaeras (70-90%) tot C57BL / 6 femannetjes. </li><li> Bevestig de genotypering van heterozygote mTERT-ERneo dieren door Southern blot. </li><li> Mate de heterozygote mTERT-ERneo dieren en Èííà-Cre dieren naar de NeoR cassette te verwijderen. Mate de heterozygote dieren C57BL / 6 dieren ten minste drie maal, en andere inter-ras heterozygote mTERT-ER dieren homozygositeit genereren. </li></ol> 2. Genereren van LSL-mTERT Allele <ol><li> Introduceer de knock-in targeting vector die een LoxP - triple Stopper - Neo - LoxP fragment en het mTERT genomische sequentie (tussen exon 1 en intron 2, Figuur 1B) in de muis ES-cellen met elektroporatie 23. </li><li> De cultuur van de ES-cellen in neomycine voor 6-10 dagen. Pick neomycine-resistente klonen en uit te breiden in 48 well platen. Pak het genomische DNA met behulp van een commerciële kit en bevestig de knock-in allel door Southern blot 23. </li><li> Inject twee ES lijnen met meer dan 95% normaal karyotypes in C57BL / 6 blastocysten met een Micromanipulatie kit onder een omgekeerde microscoop. Implanteren de blastocysten in de baarmoeder van de draagmoeder 23. Mate de hoogwaardige mannelijke chimaeras (70-90%) tot C57BL / 6 vrouwtjes. </li><li> Bevestig de genotypering van heterozygote LSL-mTERT dieren door Southern blot. </li><li> Mate de heterozygote dieren C57BL / 6 dieren ten minste drie maal, en andere inter-ras heterozygote LSL-mTERT dieren homozygositeit genereren. </li></ol> 3. Reactivering van telomerase in mTERT-ER en LSL-mTERT Muizen In Vivo Voor mTERT-ER <ol><li> Steriliseer de chirurgische instrumenten voor de injectie. </li><li> Verdoven de muizen met isofluraan kamer (4% voor inductie, 2% voor handhaving) in 50% (v / v) zuurstof / 50% (v / v) distikstofmonoxide gasmengsel. Of verdoven muizen door een ketamine-xylazine mengsel (100 mg / kg lichaamsgewicht + 10 mg / kg lichaamsgewicht). </li><li> Nadat diepe verdoving is bereikt, verwijdert verdoofde dier uit de inductie kamer en houden hun kop in de buis verbonden met de kamer isofluraan (2%). </li><li> Knijp de voetzolen van de muizen om ervoor te zorgen het dier is diep verdoofd. Zet zalf op beide ogen om te voorkomen dat de ogen uitdrogen. Veeg de achterkant van de muizen met povidon-joodoplossing. </li><li> Injecteer de slow-releasing 4-OHT pellet nauwkeurig trochar (10 G) onder de huid van de rug en duwt de pellet tot aan de middellijn tussen twee schouders. </li><li> Dicht de incisie met wond klemaanbrenger en bewaken van de muizen voor herstel van de anesthesie. Verwijder de clips 10 dagen later. Aanvullende warmte niet nodig omdat de procedure kort is voltooid. </li><li> Duur van de behandeling met 4-OHT pellet worden geoptimaliseerd volgens het doel van de studie. </li></ol> Voor LSL-mTERT &lt;ol&gt; <li> Tamoxifen (10 mg / ml, opgelost in maïsolie) wordt intraperitoneaal twee opeenvolgende dagen (200 ul / 25 g / dag). </li></ol> 4. Isolatie van neurale stamcellen en Reactivering van telomerase In Vitro <ol><li> Muizen worden gedood met kooldioxide en de hersenen worden verwijderd. Volg het protocol van commercieel beschikbare zenuwweefsel dissociatie kit per fabrikant. </li><li> Resuspendeer de gevriesdroogde poeder in de flacon gelabelde Oplossing 4 met 1 ml celkweekmedium voor oplossing 4. Niet vortex. Deze oplossing moet vervolgens in hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C voor later gebruik. </li><li> Verwarm het mengsel bij 37 ° C gedurende 15 min vóór gebruik. </li><li> Voeg Enzyme Mix 1: Oplossing 1 (50 ui) en oplossing 2 (1900 pl). Voeg Enzyme Mix 2: Oplossing 3 (20 pl) en Oplossing 4 (10 pl). </li><li> Bereid 1950 ul enzym mix 1 voor maximaal 400 mg weefsel en vortex. Verwarm het mengsel bij 37 ° C15 min vóór gebruik. </li><li> Neem de 1-daagse muis hersenen, en houden de voorhersenen door het verwijderen van de olfactorische bollen en de kleine hersenen. Houd de voorhersenen weefsels in 1 ml koud kweekmedium aangezien het wegnemen en op te slaan in 4 ° C. Zorg ervoor dat het zenuwweefsel binnen 1 uur te verwerken. </li><li> Bepaal het gewicht van het weefsel om ervoor te zorgen dat de limiet van 400 mg per spijsvertering niet wordt overschreden. Plaats de hersenen op het deksel van een 35 mm petrischaal, en plet de hersenen met behulp van een scalpel. </li><li> Met behulp van een 1 ml pipet, voeg 1 ml HBSS (w / o Ca / Mg) en pipet stukken weer in een 15 ml buis. Spoelen met HBSS (w / o Ca / Mg). Centrifugeer bij 300 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en zuig de supernatant voorzichtig. </li><li> Voeg 1,950 ul voorverwarmde enzymmengsel 1 (Oplossingen 1 en 2) per tot 400 mg weefsel. Incubeer in de 15 ml buis gedurende 15 minuten bij 37 ° C, het mengen door omkeren of schudden van de buis om de 5 min. </li><li> Bereid 30 pi enzym mix 2 per weefselmonster door het toevoegen van 20 &amp; #956, l Oplossing 3 tot 10 gl oplossing 4. Voeg vervolgens aan monster. Omkeren voorzichtig te mengen. Doe niet vortex. </li><li> Distantiëren weefsel mechanisch met behulp van een breed-getipt, brand gepolijst Pasteur pipet door en neer te pipetteren 10 keer langzaam. Voorkom de vorming van luchtbellen. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min, het buisje elke 3 min. </li><li> Herhaal de stappen 4.11 en 4.12 stap als het weefsel groter zijn dan 200 mg. </li><li> Breng de celsuspensie op een 70 urn zeef cel, geplaatst op een 50 ml buis. Solliciteer 10 ml PBS via cel zeef. Gooi cel zeef en centrifugeer celsuspensie bij 300 g gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Zuig supernatant volledig. </li><li> Resuspendeer cellen met stamcel medium tot het vereiste volume voor verdere toepassingen. </li><li> Om telomerase in LSL-mTERT NSC activeren behandelen van de cellen met 100 uM 4-OHT twee dagen. Om telomerase in mTERT-ER NSC&#39;s te activeren, houdt u de cellen in kweekmedium met 100 uM 4-OHT. </li></ol> 5. telomeren FISH <ol><li> Bereid de metafasechromosomen van gekweekte cellen. </li><li> Voor FFPE (formaline gefixeerd en in paraffine ingebedde) weefselcoupes, deparaffinize in xyleen en rehydrateren in ethanol serie gedurende 5 minuten elk (100%, 90%, 70%, 50% ethanol) en PBS gedurende 5 min. </li><li> Post-fix in methanol: azijnzuur (3: 1) gedurende 1-2 uur. Dehydrateer in koude ethanol serie 5 minuten elk (70%, 90%, 100% ethanol) en drogen. Was in 1x PBS bij 37 ° C gedurende 5 min. </li><li> Denatureren chromosomen in 4% formaldehyde bij 37 ° C gedurende 2 min. Uitdrogen in koude ethanol serie 5 min per stuk (70%, 90%, 100% ethanol) en de lucht drogen. </li><li> Breng 12 tot 25 ul van de PNA hybridisatie mengsel per glaasje. (Hybridisatie mix: 70% formamide, 0,06 x SSC, 0,2% BSA, 0,5 ng / ul tRNA, 0,5 ng / ul telomere of centromeer probes) </li><li> Dicht het dekglas met rubber cement. Na denatureren chromosomale preps en weefselsecties bij 80 ° C gedurende 4 min. Hybridiseren bij kamertemperatuur of 37 ° C gedurende 2-4 uur in vochtige kamer. </li><li> Wassen bij kamertemperatuur met wasbuffer 2 x 15 min. (Wasbuffer: 70% formamide, 0,06 x SSC, pH 7,2). Wassen bij kamertemperatuur 3 x 5 min met PBST. Counter-vlek dia&#39;s met DAPI of ver-rode fluorescentie voor microscopisch onderzoek. </li></ol>

<ol><li>Bass, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing+of+colorectal+adenocarcinomas+identifies+a+recurrent+VTI1A-TCF7L2+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion.</a> Nat Genet. 43, 964-968 (2011).</li>
<li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li>
<li>Blasco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+tumor+formation+by+mouse+cells+lacking+telomerase+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.</a> Cell. 91, 25-34 (1997).</li>
<li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+mouse+telomerase+in+highly+proliferative+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs.</a> Nature. 392, 569-574 (1998).</li>
<li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447, 725-729 (2007).</li>
<li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+and+Atm+deficiency+compromises+organ+homeostasis+and+accelerates+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing.</a> Nature. 421, 643-648 (2003).</li>
<li>Rudolph, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity%2C+stress+response%2C+and+cancer+in+aging+telomerase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice.</a> Cell. 96, 701-712 (1999).</li>
<li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+impairs+DNA+repair+and+enhances+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation.</a> Nat Genet. 26, 85-88 (2000).</li>
<li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131, 4059-4070 (2004).</li>
<li>Savage, S. A., Alter, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Dyskeratosis congenita.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 23, 215-231 (2009).</li>
<li>Armanios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndromes+of+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Syndromes of telomere shortening.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).</li>
<li>Vulliamy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+component+of+telomerase+is+mutated+in+autosomal+dominant+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita.</a> Nature. 413, 432-435 (2001).</li>
<li>Harley, C. B., Harley, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase%2C+checkpoints+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+surveys%22%5BJournal%5D)">Telomerase, checkpoints and cancer.</a> Cancer surveys. 29, 263-284 (1997).</li>
<li>Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarlseder%2C+J+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 283, 1321-1325 (1999).</li>
<li>Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRF2+protects+human+telomeres+from+end-to-end+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions.</a> Cell. 92, 401-413 (1998).</li>
<li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+deficiency+rescues+the+adverse+effects+of+telomere+loss+and+cooperates+with+telomere+dysfunction+to+accelerate+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis.</a> Cell. 97, 527-538 (1999).</li>
<li>Artandi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+promotes+non-reciprocal+translocations+and+epithelial+cancers+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice.</a> Nature. 406, 641-645 (2000).</li>
<li>Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+and+evolution+of+intestinal+carcinoma+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans.</a> Nat Genet. 28, 155-159 (2001).</li>
<li>Greenberg, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+dysfunctional+telomeres+impair+tumorigenesis+in+the+INK4a%28delta2%2F3%29+cancer-prone+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse.</a> Cell. 97, 515-525 (1999).</li>
<li>Jaskelioff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+reactivation+reverses+tissue+degeneration+in+aged+telomerase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice.</a> Nature. 469, 102-106 (2011).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitelomerase+therapy+provokes+ALT+and+mitochondrial+adaptive+mechanisms+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer.</a> Cell. 148, 651-663 (2012).</li>
<li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+reactivation+following+telomere+dysfunction+yields+murine+prostate+tumors+with+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases.</a> Cell. 148, 896-907 (2012).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 3rd Edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier melden wij het ​​genereren van twee induceerbare muizen telomerase allelen en hoe telomerase activeren in vivo en in vitro. De cruciale stap voor het reactiveren mTERT-ER-activiteit is om een ​​continue concentratie van tamoxifen te houden, zodat we ervoor kiezen om 4-OHT time-release pellets vervaardigd door Innovative Research van Amerika te gebruiken. De korrels blijven vrijgeven 4OHT bij een constante bloedspiegel van 1 ng / ml tot 60 dagen. In een eerdere studie hebben we aangetoond dat reactiveren telomerase-activiteit met deze strategie kon de degeneratieve fenotypen zoals stamcellen uitputting, aantasting van weefselbeschadiging reacties en orgaanfalen in meerdere organen die werden geïnduceerd door telomeer dysfunctie G4 mTERT ER / ER verbeteren muizen 20. Anders dan de functie bestuderen van telomerase bij veroudering, kunnen deze twee induceerbare telomerase allelen worden gebruikt om kanker te onderzoeken. Eerdere studies hebbenvoordeel van deze allelen om de rol van telomeerattritie en telomerase reactivering verkennen vormgeven van het genoom en beïnvloeden de biologie van T-cel lymfoom thymus 21 en 22 prostaatkanker. Deze twee studies toonden aan dat de telomeren disfunctie in de late generatie G4 Atm - / - mTERT ER / ER en G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L muizen biedt een mechanisme aanwakkeren van de overname van de vroege mutagene evenementen voor tumorinitiatie, maar voorkomen progressie volledig maligne tumoren. Toen telomerase werd gereactiveerd in de context van telomere dysfunctie geïnduceerde genomische instabiliteit, DNA schade controleposten en ongebreidelde chromosomale instabiliteit onderdrukt, hetgeen de volledige progressie van maligne tumoren met nieuwe biologische eigenschappen zoals bot metastase van prostaatkanker 21 en hersenen infiltratie van thymi toegestaanc lymphoma 21. Soortgelijke verschijnselen werden ook waargenomen in andere soorten kanker, waaronder darmkanker en alvleesklierkanker (persoonlijke communicatie met Drs. Haoqiang Ying, Adam Boutin en Ronald DePinho). Omdat TERT-ER proteïne makkelijk kan worden geschakeld tussen aan en uit-toestanden naargelang de dieren behandeld met tamoxifen of voertuig, kan de tumormodellen die door mTERT-ER allel gebruikt worden om anti-telomerase therapie testen. In eerdere studie, tumoren gegenereerd in G4 Atm - / - mTERT ER / ER dieren werden vrijgelaten uit de 4-OHT; op telomerase uitputting, tumoren uiteindelijk kromp als gevolg van het herstel van de telomeer-dysfunctie geïnduceerde checkpoints 21. Sommige van de resistentie verworven reactie tumoren uitsterven telomeer door activeren van een alternatieve Verlenging van telomeren (ALT) mechanisme. Verdere karakterisatie van deze ALT + resistente tumoren bleek dat they hebben afwijkende transcriptie van genen betrokken bij mitochondriale biologie en oxidatieve verdediging, waaronder een master regulator van mitochondriale synthese en oxidatieve verdediging PGC-1β. Knock-down van PGC-1β of SOD2 (een andere regulator van de oxidatieve verdediging) aanzienlijk elimineert ALT + tumorcellen terwijl houden telomerase + tumorcellen blijven relatief intact 21. Een beperking van deze twee knock-in allelen is dat ze alleen kunnen veroorloven reactivering van telomerase op endogeen niveau omdat ze in de natieve locus van het telomerasegen. In de meeste humane kankers is telomerase eigenlijk overexpressie op een veel hoger niveau. Om het niveau van telomerase verbeteren, een wijziging mogen worden geacht om de mTERT-ER construct met een sterkere promoter invoegen zoals PGK (fosfoglyceraatkinase) promoter in Rosa26 locus. Kortom, deze twee nieuwe induceerbare muizen telomerase allelen bieden ongekende genetic instrumenten om de functies van telomerase bestuderen veroudering en weefsel homeostase en de tumorprogressie, vooral onder de achtergrond van vooraf verkregen telomere-dysfunctie geïnduceerde genomische instabiliteit. De mTERT-ER allel kan ook worden gebruikt om anti-telomerase therapie bestuderen door kruising in andere tumor-gevoelige muismodellen.

Telomerase is een enzym verantwoordelijk voor telomeren. Deze zijn repetitieve sequenties aan de uiteinden van chromosomen die de integriteit beschermen. De kerncomponenten van telomerase holoenzyme een reverse transcriptase katalytische subeenheid (TERT) en een RNA-subeenheid (TERC) dat dient als de matrijs voor het toevoegen van de telomere herhaalt 1,2. Terwijl over het algemeen onderdrukt in gedifferentieerde somatische cellen, telomerase vertoont robuuste activiteit en speelt een belangrijke rol in geslachtscellen, kankercellen en stamcellen. mTERC en mTERT knockout muizen zorgen voor een grote in vivo modellen voor de functies van telomerase studeren in zowel stamcellen en kanker. De mTERC en mTERT knockout muizen (G1) geen duidelijke fenotypen door de lange reserve van telomeren in muizen 3 tonen. Echter, serieel intercrossing mTERC en mTERT knockout muizen te laat generatie (G5-G6) resulteerde inprogressieve erosie van telomeren en uiteindelijk leidde tot ernstige degeneratie van zeer proliferatieve weefsels 4. Late generatie (G5-G6) mTERC - / - muizen zijn onvruchtbaar te wijten aan de hoge tarieven van apoptose in de testis en kiemcel uitputting. G5-G6 mTERC - / - muizen vertonen ook degeneratieve fenotypes in sterk proliferatieve weefsels waaronder het beenmerg, de darmen en de huid als gevolg van hoge tarieven van apoptose en defecte zelfvernieuwing vermogen in weefsel stam / voorlopercellen cel compartimenten 4. Hematopoietische stamcellen in het beenmerg van de late generatie mTERC - / - muizen vertonen verlies van proliferatieve potentieel, gecompromitteerd zelfvernieuwing vermogen, verbeterde apoptose en uiteindelijk functionele uitputting 5,6. Evenzo geleidelijk toe apoptotische lichamen intestinale crypten werden waargenomen bij elke volgende generatie van G1-G6 mTERC - / - muizen 7,8. THij schadelijke werking van disfunctionele telomeren lijkt niet beperkt tot hoge omzet weefsels aangezien zowel de proliferatie van volwassen neurale stamcellen in vitro en de neurogenese in vivo werden zwaar aangetast eind generatie (G4 G5) mTERC - / - muizen 9 . De rol van telomerase in stamcellen wordt verder ondersteund door de bevindingen in een zeldzame menselijke genetische stoornis dyskeratose congenita (DKC), die in sommige opzichten lijkt op voortijdige veroudering 10,11. DKC wordt veroorzaakt door mutaties in TERC, TERT, en genen die dyskerine een kern telomerase subeenheid en andere dyskerine 12 geassocieerde eiwitten coderen. In het gemiddelde, telomeren in DKC patiënten zijn korter dan 99% van de leeftijd gematchte controles. De belangrijkste morbiditeit van de ziekte wordt veroorzaakt aplastische anemie, die wordt veroorzaakt door afwijkingen handhaving van hematopoietische stamcellen. Andere aspecten van de ziekte zoals orale leukoplakie, nageldystrofie, mentale retardatiop, testes atrofie en pulmonale complicaties alle stel gestoorde werking van weefsel stamcellen en stamcellen 10, bevindingen in nauw overleg met die in de late generatie van telomerase knockout muizen. DKC patiënten gevoelig voor myelodysplastisch syndroom en een verhoogde prevalentie van maligne mucosale neoplasmata. Zo tekort van telomerase in menselijke patiënten recapituleert de gebreken van stamcellen functies en tumor predispositie die worden waargenomen in de late generatie telomerase knockout muizen. Korte telomeren en hoge telomerase activiteit zijn kenmerken van kanker. Als normaal of premaligne cellen delen, de lage of afwezige telomerase activiteit leidt tot de uiteindelijke erosie van telomeren en activering van cellulaire checkpoints vergelijkbaar met die veroorzaakt door DNA dubbelstrengs-breuken (DSB&#39;s) 13. Zoals klassieke DSB is telomeer disfunctie aangetoond dat p53 en bijbehorende cellulaire responsen, zoals veroudering en / of apoptosis 14,15. Bij mutatie inactivatie van p53, cel fietsen en overleving van de cel worden versterkt in cellen met telomeren disfunctie, die een pro-carcinogene mutator mechanisme gekenmerkt door translocaties en regionale versterkingen en verwijderingen 16,17 biedt. Tezelfdertijd bleef telomeer dysfunctie en geassocieerde ongebreidelde chromosomale instabiliteit (zelfs p53 null cellen) lijken volledig maligne progressie van dergelijke kankers beperken. Zo laat generatie G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - muizen vertoonden aanzienlijk verminderd lymfoom incidentie vergeleken met Ink4a / Arf null muizen vanwege telomeerattritie. In een andere studie, meer geavanceerde adenomateuze laesies G4 mTERT - / - APC min muizen sterk onderdrukt vergeleken met APC min muizen door aanzienlijke groeistop en apoptose 18,19. Dewaarneming dat telomeer dysfunctie geïnduceerde genomische instabiliteit remt tumorprogressie vraagt ​​de speculatie dat de activering van telomerase maligne progressie nut kunnen gedeeltelijk door het onderdrukken genomische instabiliteit tot een niveau geschikt levensvatbaarheid van kankercellen en / of neutraliserende p53-afhankelijke en -onafhankelijke checkpoint mechanismen. Om te bestuderen of telomerase reactivering kunnen stoppen of zelfs omkeren veroudering van stamcellen, en of telomerase reactivering het ontstaan ​​van tumoren tegen de achtergrond van genomische instabiliteit kan bevorderen, genereerden we twee induceerbare muizen telomerase allelen. De eerste is 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) -induceerbare TERT-oestrogeenreceptor (ER-mTERT) fusie knock-in allel. Aangezien 4-OHT muizen homozygoot voor mTERT-ER (aangeduid mTERT ER / ER) zijn telomerase-activiteit gebrekkig en sustain dezelfde cytogenetische en cellulaire fenotypes conventionele mTERT of mTERC knock-out model. Bij 4-OHT behandeling, kan tert-ER proteïne activiteit worden hersteld tot niveaus die vergelijkbaar zijn met de inheemse TERT- eiwit 20, 21. De tweede allel is een roman induceerbare TERT- knock-in-allel bevat een intronische LoxP-Stopper-LoxP cassette (LSL- mTERT); upon Cre gemedieerde excisie van LSL is mTERT opnieuw tot expressie gebracht onder controlemechanismen endogene expressie 22.

<table><tbody><tr><td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td><td>Leica</td><td>Per quote</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td><td>Leica</td><td>Per quote</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Life technologies</td><td>21810031</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane vaporizer</td><td>Veterinary Anesthesia Systems</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>1005796</td><td></td></tr><tr><td>ketamine-xylazine mixture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113-10ML</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxfien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT pellet</td><td>Innovative Research of America</td><td>Custermized</td><td></td></tr><tr><td>Precision Trochar (10 Gauge)</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>wound clip applier</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804</td><td></td></tr><tr><td>clip</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>xylene</td><td>Fischer Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A-433S4</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid</td><td>Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>22-032-104</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Fischer Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>PNA telomere probe</td><td>Panagene</td><td>F1001-5</td><td></td></tr><tr><td>PNA centromere probe</td><td>Panagene</td><td>F3003-5</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1325-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>rubber cement</td><td>Walmart</td><td>Elmer's</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik makend van muriene induceerbaar telomerase allelen in de studies van weefseldegeneratie / regeneration en kanker

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomeer dysfunctie-geïnduceerd verlies van de integriteit van het genoom en de bijbehorende DNA-schade signalering en controlepost reacties zijn goed gevestigde drivers die weefseldegeneratie veroorzaken tijdens het verouderen. Kanker, met incidentie sterk toeneemt met de leeftijd, wordt gekenmerkt door korte telomerenlengten hoge telomerase activiteit. Om de rol van telomeren dysfunctie en telomerase reactivering studeren in veroudering en kanker, het protocol laat zien hoe twee muizen induceerbare telomerase genereren knock-in allelen 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) -induceerbare tert-oestrogeenreceptor (mTERT-ER) en Lox -Stopper-Lox TERT- (LSL-mTERT). Het protocol beschrijft de procedures om telomeren dysfunctie induceren en reactiveren telomerase-activiteit in mTERT-ER en LSL-mTERT muizen in vivo. De vertegenwoordiger van de gegevens blijkt dat reactivering van telomerase activiteit het weefsel degeneratieve fenotypes geïnduceerd door telomeren disfunctie kan verbeteren. In order om de impact van telomerase reactivering op het ontstaan ​​van tumoren te bepalen, genereerden we prostaattumor model G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L en thymus-T-cel lymfoom model G4 Atm - / - mTERT ER / ER . De vertegenwoordiger van de gegevens blijkt dat telomerase reactivering in het decor van genomische instabiliteit veroorzaakt door telomeren disfunctie kan sterk verbeteren van het ontstaan ​​van tumoren. Het protocol beschrijft ook procedures voor neurale stamcellen (NSC&#39;s) van mTERT-ER en LSL-mTERT muizen isoleren en activeren telomerase-activiteit in NSC in vitro. De vertegenwoordiger van de gegevens blijkt dat reactivering van telomerase de zelfvernieuwing vermogen en neurogenese in vitro kunnen verbeteren. Ten slotte is het protocol beschrijft de procedures voor het uitvoeren van telomeren FISH (fluorescentie in situ hybridisatie) aan beide muis FFPE (formaline gefixeerde en Paraffin Embedded) hersenweefsel en metafasechromosomen van gekweekte cellen.

De strategieën om murine mTERT-ER genereren en LSL-mTERT knock-in allelen in figuur 1A en 1B. Specifiek, een LoxP - triple Stopper - Neo - LoxP fragment werd tussen exon 1 en exon 2 van mTERT locus ingebracht om LSL-mTERT allel genereren. Om mTERT-ER allel genereren ERT2-LBD domein in frame met de mTERT gen ingevoegd in het N-uiteinde van exon 1. We zien dat wanneer telomerase tijdelijk gereactiveerd telomeren dysfunctie muizen door ze met 4-OHT pellets 4 weken, kan de degeneratieve fenotype worden verbeterd in meerdere organen zoals hersenen (Figuur 2A) en testes (figuur 2B). Om de impact van telomerase reactivering op cellen gekweekt in vitro te bepalen, geïsoleerd we neurale stamcellen (NSC) van eind generatie G4 LSL-mTERT en G4 mTERT-ER Muizen. We toonden aan dat wanneer telomerase gereactiveerd telomeren disfunctioneel NSC, de zelfvernieuwing vermogen van NSC werd sterk verhoogd (Figuur 3A) en in vitro neurogenese was ook significant verhoogd (Figuur 3B). Om het effect van telomerase reactivering van tumorigenese in de context van telomere disfunctie bepalen, genereerden wij PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L (prostaattumor model) en Atm - / - mTERT ER / ER (thymus T-cel lymfoom model) laat generatie cohorten. Toen telomerase gereactiveerd door tamoxifen bij deze muizen met injectie (figuur 4A) of 4-OHT pellets 8 weken (figuur 4B), werd de tumorgenese sterk verbeterd in zowel prostaattumor model (Figuur 4A) en thymus-T-cellymfoom model ( <strong&gt; Figuur 4B). Ten slotte hebben we meldde de protocollen van het uitvoeren van telomeren FISH op FFPE muizenhersenen weefsels (Figuur 5) en metafasechromosomen (Figuur 5, inzet). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Figuur 1: (A) mTERT-ER knock-in strategie. TV, targeting vector; WT, wild type allel; KI, knock-in-allel; LA, linkerarm; RA, rechterarm; E1, exon 1; E2, exon 2; neo, PGK promoter aangestuurde neomycine resistentiegen; ER, gewijzigd oestrogeen receptor (ERT2) ligandbindingsdomein; DT, dyphteria toxinegen. (B) LSL-mTERT knock-in strategie. TV, targeting vector; WT, wild type allel; KI, knock-in-allel; LA, linkerarm; RA, rechterarm; E1, exon 1; E2, exon 2; neo, PGK promoter aangestuurde neomycine resistentiegen; Stop, drie repetitieve transcriptie stop sequenties; DT, dyphteria toxinegen. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Figuur 2: Representatieve gegevens telomerase reactivering tonen verbetert degeneratieve fenotypen van organen Representatieve beelden van hersenen (links). en testes (rechts) van G0 en G4 mTERT-ER muizen behandeld met placebo of 4-OHT gedurende 4 weken. Schaal balken geven 50 urn. Re-print met toestemming van 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Figuur 3:. Vertegenwoordiger gegevens naar telomerase reactivering tonen verbetert zelfvernieuwing en neurogenese van neurale stamcellen in vitro (A) Vertegenwoordiger beelden van neurale stamcellens geïsoleerd van G4 LSL-mTERT (bovenste paneel) en G4 mTERT-ER (onderste paneel) groeit in stamcellen medium behandeld met vehikel of 4-OHT. (B) Vertegenwoordiger beelden van in vitro neurogenese (Tuj1 +) van neurale stamcellen geïsoleerd van G4 mTERT-ER gekweekt in differentiatie medium (met 1% FBS) behandeld met voertuig of 4-OHT. Schaal balken geven 100 urn. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Figuur 4:. Vertegenwoordiger gegevens naar telomerase reactivering tonen verbetert het ontstaan ​​van tumoren tegen de achtergrond van genomische instabiliteit (A) Vertegenwoordiger beelden van prostaattumoren ontleed uit G0 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB- Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT- / - En G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L behandeld met tamoxifen. Re-print met toestemming van 22. (B) Vertegenwoordiger beelden van thymus T-cel lymfomen ontleed uit G0 Atm - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER behandeld met het voertuig, en G4 Atm - / - mTERT ER / ER behandeld met 4- OHT gedurende 8 weken. Schaal balken geven 1 cm. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Figuur 5: Representatieve beelden van telomeer en centromerische FISH op FFPE muis hersenweefsel en metafase (inzet). Rood geeft aan DNA, groen geeft telomeer vlekken, en cyaan geeft centromere kleuring. Schaal balken geven 1 mm.

Telomeren en telomerase spelen essentiële rollen bij veroudering en tumorigenese. Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe je twee muis-induceerbare telomerase knock-in allelen kunt genereren en hoe je ze kunt gebruiken in de studies van weefseldegeneratie/regeneratie en kanker.

Gebruik makend van Muriene Induceerbaar Telomerase Allelen in de Studies van weefseldegeneratie / Regeneration en Kanker

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om twee murine inducibele mase-knockout-allelen in vivo en in vitro te manipuleren voor studies van weefseldering en regeneratie en kankerstudies. Dit wordt bereikt door hydroxytamoxifentabletten in dieren te implanteren om mase in vivo te reactiveren. Als tweede stap worden neurale stamcellen geïsoleerd uit dieren die vervolgens worden behandeld met hydroxytamoxifen om mase in vitro te reactiveren.Vervolgens wordt telomere fluorescentie in C twee hybridisatie of vis uitgevoerd op zowel gekweekte cellen als formeel en gefixeerd paraffine ingebed hersenweefsel om de activiteit van mase te controleren. De resultaten toonden aan dat hydroxytamoxifen-behandelingen mase-activiteit robuust kunnen reactiveren, wat zowel verouderingsfenotypen kan verlichten en tumorvorming kan bevorderen op basis van histopathologisch onderzoek. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in de verouderings- en kankervelden, zoals of we de verouderingsprocessen kunnen vertragen door TH-trauma-activiteit te moduleren, of hoe we Thomas specifiek kunnen targeten om kanker te behandelen.Het demonstreren van deze procedure zal instructeur Dr. Takashi Shingu zijn en een technicus April Un van mijn laboratorium. Begin deze procedure met de generatie van de Turt ER en lock stop locks turt allelen zoals beschreven in het tekstprotocol, steriliseer alle chirurgische gereedschappen voor de injectie, ga door met het anestheseren van de muizen zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat diepe anesthesie is bereikt, verwijder de verdoofde dieren uit de inductiekamer en houd hun hoofd binnen in de buis die is aangesloten op de iso fluorine kamer.Prikt in de voetzolen van de muizen om ervoor te zorgen dat het dier diep verdoofd is. Smeer ook zalf op beide ogen Om te voorkomen dat de ogen uittrekken, veeg de achterkant van de muizen met povidone-jodiumoplossing. Injecteer vervolgens een langzaam afgevende hydroxytamoxifen-pellet met een precisietrocar onder de huid van de rug.En duw de pellet helemaal naar de middenlijn tussen de twee schouders. Sluit de incisie met een wondclipapplicateur en bewaak de muizen voor herstel. Voor anesthesie.Haal de muizenhersenen van één dag eruit en bewaar de vier hersenen door de reukbollen en de kleine hersenen te verwijderen. Bewaar de vier hersenweefsels in één milliliter koud kweekmedium en bewaar bij vier graden Celsius. Zorg ervoor dat het neurale weefsel binnen een uur wordt verwerkt.Bepaal het gewicht van het weefsel om ervoor te zorgen dat de limiet van 400 milligram per vertering niet wordt overschreden. Plaats de hersenen op de deksel van een 35 millimeter diameter petrischaal en verpletter de hersenen met een scalpel. Gebruik een pipettip van één milliliter en voeg één milliliter Hank's balanszoutoplossing of HBSS toe.Pipet vervolgens de stukken terug in een 15 milliliter buis na het spoelen met HBSS centrifugeren bij 300 keer G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Na zorgvuldig verwijderen van de supernatant, voeg 1.950 microliters voorverwarmd enzym toe. Meng één per tot 400 milligram weefsel.Incubeer het monster in de 15 milliliter buis gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Meng het monster door de buis om te draaien of te schudden om de buis om de vijf minuten. Bereid vervolgens 30 microliters enzym Mix twee per weefselmonster voor door 20 microliters oplossing toe te voegen, drie tot 10 microliters oplossing vier.Voeg vervolgens toe aan het monster en inverteer voorzichtig om het weefsel mechanisch te dissociëren met behulp van een wijdgetippelde, gepolijste pastapipet door tien keer langzaam op en neer te pipetten en de vorming van luchtbellen te vermijden. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten, de buis om de drie minuten omdraaiend. Breng vervolgens de celsuspensie aan op een 70 micron celzeef geplaatst op een 50 milliliter buis.Breng 10 milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS aan door de celzeef. Gooi vervolgens de celzeef weg en centrifugeer de celsuspensie bij 300 keer G gedurende 20 minuten. Zet de kamertemperatuur na centrifugatie en aspireer het supernatant volledig.Resuspendeer de cellen met stamcellenmedium tot het vereiste volume voor verdere toepassingen om tele array in locks, stop locks te activeren. Turt neurale stamcellen. Behandel de cellen met 100 micromolar hydroxytamoxifen gedurende twee dagen om emase en turt er neurale stamcellen te activeren.Bewaar de cellen in kweekmedium met 100 micromolar hydroxytamoxifen om telomere vis uit te voeren. Bereid eerst de metafase chromosomen uit gekweekte cellen voor voor formaline gefixeerde en paraffine ingebedde of FFPE weefselsecties. Deparizeer het monster in xyleen en rehydreer in een ethanolreeks gedurende vijf minuten elk en in PBS gedurende vijf minuten.Postfixeer vervolgens de secties in een verhouding van drie tot één van methanol tot azijnzuur gedurende één tot twee uur. Dehydrateer de secties in een koude ethanolreeks gedurende vijf minuten elk en laat ze aan de lucht drogen was in één XPBS bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Volgende in natuur, de chromosomen in 4% formaldehyde bij 37 graden Celsius gedurende twee minuten.Dehydrateer de secties in een koude ethanolreeks zoals eerder en laat ze drogen en breng vervolgens 12 tot 25 microliters van de peptidenucleïnezuur hybridisatiemix op elke schuif aan. Verzegelde de deksel met rubbercement die natuur chromosomale preps en weefselsecties plaatsen bij 80 graden Celsius gedurende vier minuten. Hybridiseer vervolgens bij kamertemperatuur of 37 graden Celsius gedurende twee tot vier uur in een vochtige kamer.Was vervolgens de monsters bij kamertemperatuur met wasbuffer gedurende 15 minuten tweemaal. Was ze vervolgens bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten met PBS en tween 23 keer. Counterstain eindelijk de glijbanen met DPI of verre rode fluorescentie voor microscopisch onderzoek.Toen telomere tijdelijk werd gereactiveerd in telomere disfunctionele muizen, konden de degeneratieve fenotypes worden verlicht in meerdere organen zoals de her

utilizing-murine-inducible-telomerase-alleles-studies-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

RNA-interferentie (RNAi) beschikt over een groot aantal voordelen ten opzichte van gen knock-out en is in brede kring gebruikt als een instrument in gen functionele studies. De uitvinding van DNA-vector-gebaseerde RNAi-technologie heeft op lange termijn en induceerbaar gen knockdown mogelijk, en verhoogde ook de haalbaarheid van gene...

DNA vector-gebaseerde RNA-interferentie op genfunctie in Cancer Study

Het genereren en karakteriseren van tumorspecifieke T-cellen met gehumaniseerde muizen wordt hier beschreven. Human thymusweefsel en genetisch gemodificeerde humane hematopoietische stamcellen worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen. Dit resulteert in de bereiding van een op menselijke immuunsysteem waardoor in vivo onderzoek van anti-tumor immuunrespons.

Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel

Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide myogene voorlopers zijn veelbelovende kandidaten voor celtherapiestrategieën om spierdystrofieën te behandelen. Dit protocol beschrijft transplantatie en functionele metingen die nodig zijn om de engraftment en differentiatie van iPSC-afgeleide mesoangioblasten (een type spiergenitors) te evalueren in muismodellen van acute en chronische spierregeneratie.

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Dit protocol beschrijft technieken voor het isoleren van levende cellen en de primaire kweek van myogene en fibroblastcellijnen uit spier- of huidweefsel. Er wordt ook een techniek beschreven voor het onvergankelijk maken van deze cellijnen. Samenvattend bieden deze protocollen een betrouwbare tool om afgeleide cellen van patiënten te genereren en te bewaren voor downstream-toepassingen.

Isolatie en immortaliseren van Patient afgeleide cellijnen van spierbiopsie for Disease Modeling

Dit manuscript geeft een beschrijving van de methodologie die wordt gebruikt om muizenmodellen voor transductie-transplantatie te vestigen. Er wordt een gedetailleerd overzicht gegeven van technische fouten die moeten worden vermeden bij het uitvoeren van beenmergtransplantaties. Er moet een duidelijk begrip worden verkregen van het belang van hoog viraal titer, transfectie/transductie en bestraling.

Transductie-Transplantatie Mouse Model van myeloproliferatieve aandoening

We presenteren een protocol om aan te tonen van een roman somatic gene transfersysteem met behulp van RIP-Tag; RIP-BTW muismodel om te bestuderen van de functie van genen in metastase. De aviaire retrovirussen zijn intracardiacally om ervoor te zorgen genenoverdracht in pre-maligne, noninvasive laesies van de cellen van de alvleesklier β in volwassen muizen geleverd.

Identificatie en karakterisering van metastatische factoren door genenoverdracht in de roman RIP-Tag; RIP-BTW lymfkliertest Model

De volgende procedure beschrijft een methode voor ruimtelijke en temporele controle van melanocytische tumor initiatie in muizen dorsale huid, met behulp van een genetisch gemanipuleerde muismodel. Dit protocol beschrijft macroscopische en microscopische cutane melanoom initiatie.

Ruimtelijke en temporele controle van muizen melanoom initiatie van mutant melanocyt stamcellen

Ontwikkeling van Murine modellen met specifieke genen gemuleerd in hoofd-en nekkanker patiënten is nodig voor het begrijpen van neoplasie. Hier presenteren we een protocol voor in vitro transformatie van primaire muriene tong cellen met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem om Murine HNC cellijnen met specifieke genomische veranderingen te genereren.

In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het produceren van een betrouwbaar en reproduceerbaar dun baarmoederslijmvlies met een zeer laag sterftecijfer en minimale intra-uteriene verklevingen door binnen 1-3 minuten 95% ethanol in de baarmoeder van de muis te injecteren.

Een muismodel van dun endometrium opstellen

Dit protocol schetst methoden voor het kweken, manipuleren en analyseren van muizen CAF's, inclusief in vitro/in vivo functionele assays, transcriptomics en computationele analyse. Bovendien beschrijft het een webgebaseerd platform dat is ontwikkeld om de openbaar beschikbare transcriptomen van laseropname van micro-ontlede stromale en epitheliale componenten uit een verzameling menselijke borstkankertumoren te analyseren.

Kanker-geassocieerde fibroblasten van borsttumoren bij muizen als hulpmiddelen voor moleculaire en computationele studies

Leer hoe je inductibele telomerase-allelen in muizen genereert voor onderzoek naar weefseldegeneratie, regeneratie en kanker. Deze methode maakt reactivatie van telomerase mogelijk om veroudering en tumorgenese te bestuderen.

Gebruik makend van Muriene Induceerbaar Telomerase Allelen in de Studies van weefseldegeneratie / Regeneration en Kanker

Meer video's verkennen