Functionele en morfologische beoordeling van Diafragma Innervatie door diafragma Motor Neuronen

Het algemene doel van deze procedure is om zowel de functionele als morfologische innervatie van het diafragma door frenicus motorneuronen van het cervicale ruggenmerg kwantitatief te beoordelen. Dit wordt bereikt door het opnemen van samengestelde spieractiepotentialen van het hemidiafragma bij geanesthetiseerde dieren na supramaximale stimulatie van de ipsilaterale frenicuszenuw. De volgende stap is het uitvoeren van immunohistochemie van het gehele diafragma om de innervatie van individuele neuromusculaire juncties morfologisch te beoordelen.

Uiteindelijk biedt het combineren van samengestelde spieractiepotentiaal en neuromusculaire junctieanalyses een krachtige benadering voor het kwantitatief bestuderen van diafragmatische innervatie in knaagdiermodellen van CZS- en PNS-ziekten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ruggenmergletsel, zoals of therapeutische interventies kunnen worden gebruikt om de diafragmatische functie met succes te herstellen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot therapie voor ziekten zoals traumatisch ruggenmergletsel en ILS omdat diafragmatische ademhalingsfunctie een sleutelrol speelt bij de uitkomst van de patiënt in beide van deze invaliderende aandoeningen. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Dr.Kali, een postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium, Melanie Martin, een studente aan de universiteit in het laboratorium van Dr.Wright, en Tamara Holla, een onderzoekstechnicus in mijn laboratorium.

Na het anesthesizeren van het dier, plaats het op het operatiebord, dorsale kant naar beneden en bevestig de voorpoten aan het bord. Scheer vervolgens het ventrale oppervlak vanaf de basis van de schedel naar de buik aan beide zijden van de middenlijn. Nadat de huid is gereinigd, plaats de elektroden, bevestig de aarding aan de staart en plaats de referentie-elektrode subcutaan in de contralaterale onderbuik.

De opname-elektrode moet worden voorbereid met geleidend gel op het zelfklevende gedeelte en vervolgens langs de unilaterale costale rand worden bevestigd. Plaats nu de stimulerende elektroden, transcutaan een halve centimeter uit elkaar, lateraal aan de luchtpijp en superieur aan de sleutelbeen. Ze moeten loodrecht op de huid binnengaan en ongeveer een centimeter diep gaan.

Deze elektroden moeten goed worden beveiligd, het beste met de hand. Bevestig alle elektroden aan hun geschikte stimulatoren en versterkers. De verzamelde gegevens moeten op een computer worden geregistreerd.

Voor analyse, stel de stimulusparameters van de enkellaagse stimulatie in op 0,5 milliseconden, een hertz supramaximale pulsen. De amplitude kan variëren van zes tot acht volt. Stel de interessestimulatietijd in op 30 seconden en gemiddel de respons van 10 opeenvolgende stimulaties met behulp van de baseline tot piekamplitude record van elk dier ongeveer eenmaal per week indien gewenst.

Dierdierverwerking is gedetailleerd in het tekstprotocol. Nadat een dier is geëuthanaseerd met een overdosis injecteerbare anesthesie, voer een laparotomie uit met een scalpel of schaar. Maak een incisie vanaf het xiphoïde proces naar de middenlijn.

Gebruik vervolgens een scalpel en pincetten om voorzichtig de huid en het bindweefsel van de musculatuur te scheiden. Verwijder het diafragma door het xiphoïde proces omhoog te trekken en het diafragma uit het omringende bot te snijden. Wees voorzichtig om het diafragmaspier niet te beschadigen.

Breng het diafragma, superieur zijde omhoog, over in een siliconenlijnbak gevuld met 4% paraformaldehyd in PBS onder een stereoscoop. Speld het weefsel rond het diafragma vast en rek het diafragma strak. Verwijder vervolgens het bindweefsel van het superieure oppervlak met behulp van pincetten en schaar.

Laat het fixeermiddel 20 minuten werken en verwijder het vervolgens met drie 10 minuten wasbeurten in PBS. Breng vervolgens 0,1 molaar glycine met 2%BSA in PBS aan gedurende 30 minuten. Incubeer vervolgens het diafragma in rod Domine geconjugeerd alfa bungalow toine oplossing gedurende 15 minuten.

Was de bungalow toxine af met PBS zoals voor het fixeermiddel. Verander vervolgens het bad in koud methanol en koel het weefsel gedurende vijf minuten op min 20 graden Celsius. Verwijder na vijf minuten onmiddellijk het methanol en was het weefsel met PBS zoals eerder.

Breng nu een blok aan met 0,2% TBP-oplossing gedurende een uur. Verander de oplossing in het primaire antilichaam in 0,2% TBP en laat het weefsel overnacht incuberen bij vier graden Celsius met zachte agitatie. Gebruik de volgende dag drie 10 minuten wasbeurten in 0,2% TBP om het primaire antilichaam te verwijderen en incubeer vervolgens het weefsel in de secundaire antilichaamoplossing gedurende een uur met wiegen en in het donker. Gebruik later drie wasbeurten in PBS om het secundaire antilichaam te verwijderen en houd het weefsel in het donker.

Verwijder vervolgens onder een stereoscoop meer bindweefsel op het superieure oppervlak van de spier. Eenmaal schoongemaakt, monteer en beeld het weefsel af onder een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop en analyseer kwantitatief de morfologie van het gekleurde hemidiafragma. Gebruik 20 en 40 x vergroting omdat het diafragma wordt geanalyseerd als een geheel.

Het grootste deel van de fluorescente kleuring is uit focus. Bij gebruik van een standaardmicroscoop is het het beste om de analyse realtime uit te voeren. Om de morfologie van de individuele NM js correct te scoren, verdeel de spier in drie secties voor analyse op basis van de topografische innervatiepatronen van het ruggenmerg.

Begin in de meest ventrale regio, analyseer alle zichtbare njs langs de spiervezels, analyseer niet dieper dan de eerste drie tot vier vezels vanaf het oppervlak omdat de penetratie van de antilichamen nooit volledig is. Een intacte NMJ heeft een preterminale axon die dik is en alle regio's van de zenuwterminaal overlappen volledig met de onderliggende acetylcholinereceptoren van de spier. Een gedeeltelijk ontstelde NMJ zal enkele regio's van de onderliggende acetylcholinereceptoren onbezet hebben.

Een volledig denerveerde NMJ