Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de migratie en interactie van leukocyten in progressieve leverontstekingsziekten te volgen. Dit dient om beter inzicht te krijgen in de opeenvolging van gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan de manier waarop deze cellen in het leverweefsel worden gerekruteerd en hun potentiële betrokkenheid bij de immunopathologie. Dit wordt bereikt door eerst een tracheotomie uit te voeren om controle over de ademhaling van de muis te krijgen, een cruciale stap om het langetermijnoverleven van het dier te garanderen.

Als tweede stap wordt er een laparotomie bij de muis uitgevoerd om de lever chirurgisch bloot te leggen, waardoor het orgaan toegankelijk wordt voor de multifotonmicroscoop. Vervolgens wordt de lever gefixeerd en gepositioneerd door deze in een roos in te bedden om bewegingsartefacten te minimaliseren. Beeldvorming kan gedurende enkele uren worden uitgevoerd, wat leidt tot tijdversnelde sequenties met een hoge resolutie die de veranderingen in rekrutering, positionering en interactie van individuele leukocyten volgen.

Bij het proces van de ontwikkeling van leverontstekingen kan deze methode helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van acute en chronische leverontstekingen, zoals de rekrutering van leukocyten, cel-celinteracties of mechanismen van immunopathologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele microscopie is dat multifocale microscopie langetermijnbeeldvorming mogelijk maakt met vrijwel geen verstoring van het monster, een lage fotobleking of fototoxiciteit, evenals optische coupes tot 100 µm diep in het weefsel; dit is te danken aan de unieke fysica van het laserlicht in het verre rode spectrum. Deze methode kan derhalve inzicht bieden in leverziekten.

Het kan eenvoudig worden aangepast aan andere systemen. Dankzij de methode van stabilisatie en fixatie kan het weefsel worden toegepast op vrijwel alle vraagstukken van intravitale microscopie, waardoor organen zoals de milt, nieren of zelfs subcutane tumoren eenvoudig kunnen worden afgebeeld met behulp van fluorescente gerelateerde cellen. Het is tevens mogelijk om alle leukocyten-subsets te visualiseren en hun interacties bij leverontstekingen in kaart te brengen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn aan deze methode moeite hebben vanwege de extreme complexiteit van chirurgie bij kleine dieren. Echter, op basis van onze eigen ervaring is dit slechts enkele weken een beperkende factor en is er enkel wat praktische routine nodig. Vanwege de fragiliteit van leverweefsel zijn de voorbereidende stappen moeilijk aan te leren en is een visuele demonstratie van de methode essentieel. Vul, na het opzetten van de anesthetica, de muizenpodia met 3%aros door dit onder een hoek van 40 graden in te gieten.

Zorg vervolgens dat het chirurgische werkgebied volledig is gedesinfecteerd, evenals alle benodigde instrumenten en dergelijke. Anestheseer de muis daarna met een intraperitoneale injectie van een anesthetisch cocktail. Controleer vijf minuten later de reflexen van het dier, desinfecteer vervolgens de huid en breng oogzalf aan op de ogen.

Zet de muis nu vast op de preparatietafel. Positioneer de muis met behulp van plakband zodanig dat de ventrale zijde blootligt, waarbij de nek voorzichtig wordt overstrekt. Dit kan worden bereikt door een elastiekje aan de snijtanden te bevestigen.

Maak nu de initiële incisie onder de kin van ongeveer 0,5 tot één centimeter lang. Disseceer vervolgens voorzichtig het bindweefsel tussen de speekselklieren en zoek de spierbuis die de trachea omringt. Scheur de spier voorzichtig open om de trachea bloot te leggen.

Trek een draad onder de trachea door, open vervolgens de trachea met microschaar door middel van een T-vormige incisie in de bestaande incisie. Voer de ventilatiebuis ongeveer een halve centimeter in. Schuif de buis verder op met kleine anatomische pincetten.

Zet de tube vervolgens vast met hechtingen. Hecht de tube daarna voor extra zekerheid aan de huid, sluit de incisie in de huid af met cyanoacrylaat en bevestig de tube aan de kop van het dier. Handhaaf de anesthesie met behulp van plakband door een continue stroom van 2% isofluoraan.

Nadat de muis voor de operatie is voorbereid, wordt er een kleine huidincisie onder het sternum gemaakt, die zijwaarts onder de ribben aan beide kanten wordt uitgebreid. Cauteriseer tijdens dit proces alle blootliggende bloedvaten. Om bloedingen te minimaliseren, wordt er een kleine initiële snede bij de linea alba gemaakt om toegang te krijgen tot de buikholte.

Verbreed de incisie horizontaal, waarbij alle bloedvaten worden afgesloten om toegang tot de lever te verkrijgen. Plaats de muis nu op de agro-tafel en stapel aan weerszijden van het dier glaasjes om het op zijn plaats te houden. Deze stapels moeten overeenkomen met de hoogte van de muis, zodat de tafel voor de lever, die later wordt geplaatst, geen overmatige druk op de buikholte uitoefent.

Retract nu de ribben met behulp van hechtingen in het borstbeen. Een 4-0 hechtdraad is hiervoor voldoende. Nadat de ribben zijn geretracteerd, worden de ligamenten die de lever en het diafragma verbinden doorgeknipt; knip helemaal door tot aan de aorta, maar werk met extra voorzichtigheid om te voorkomen dat het vat scheurt of wordt doorgesneden. Knip daarnaast het ligament door dat de lever met het maagdarmstelsel verbindt.

Draai de muis 45 graden om de toegang tot de grootste leverkwab te verbeteren. Neem een standaard dekglas en plak de randen af zodat deze niet scherp zijn. Plaats dit over de buikholte.

Dit zal dienen als een platform om de lever op te positioneren. Schuif voorzichtig een dubbele kogelstylus-sonde of een gewattelede spatel onder de lever en houd de bovenkant van het orgaan vast. Omdat mechanische druk met een vochtig weefselletje het leverweefsel onmiddellijk kan beschadigen, is het essentieel om het orgaan met zorg te behandelen.

Til de lob vervolgens op op het objectglas en trek deze voorzichtig in de juiste positie. De lob zal meestal gebogen of gevouwen eindigen; probeer de randen voorzichtig uit te vouwen door het weefsel op te tillen met een dunne spatel of een vochtig tissue. Voeg daarna zijwaartse steunen toe in de vorm van dekglasjes of objectglazen.

Stapel de dekglasjes zodanig dat ze dezelfde hoogte hebben als de leverkwab. De positionering en fixatie van de lever is de meest cruciale stap in het protocol. Elke mechanische stress, torsie of druk zal leiden tot onmiddellijke weefselschade of ten minste een belemmerde bloedstroom in de sinusoïdale vaten.

Plaats nu een groot dekglas met afgeplakte randen over de leverkwab, ondersteund door de laterale steunen. Positioneer dit dekglas zo waterpas mogelijk. Het mag de lever niet samenknijpen.

Wit weefsel duidt op een verminderde doorbloeding, tenzij de beeldvorming snel wordt uitgevoerd. Het is nu noodzakelijk om twee onafhankelijke intraperitoneale katheters in te brengen voor langdurige anesthesie en het toedienen van G five. Deze worden samengesteld uit naalden van 27 gauge en flexibele siliconen buisjes.

Start vervolgens de vloeistofstroom met behulp van spuitpompen. Voer de katheters in de onderbuik in, nabij de achterpoten. Nadat de vitale functiemonitors bij de muis zijn aangebracht, bereid je 100 milliliters van 3%aros in één XPBS voor.

Wanneer de aros is afgekoeld tot 41 °C, wordt de lever erin ingebed met behulp van een spuit van 5 mL met een naald van 18 gauge. Zodra de aeros is afgekoeld, wordt een heideman-spatel gebruikt om het teveel te verwijderen en een gezichtsveld vrij te maken dat groot genoeg is om de lever te scannen. Ga vervolgens verder met het scannen.

Nadat het gezichtsveld is voorbereid, wordt de muis onder de microscoop verplaatst om geschikte scangebieden voor de time-lapse imaging te selecteren. Het leverweefsel wordt visueel gescand met behulp van een externe witte lichtbron om representatieve velden te identificeren met voldoende bloedstroom en minimale verstoring van het monster. CXCR6 GFP heterozygotische muizen werden als experiment onderworpen aan intravitale T-P-L-S-M imaging. Sommigen kregen een intraperitoneale injectie van tetrachloride om acute leverschade op te wekken.

Modale cellen die GFP tot expressie brachten, werden gevolgd via video en hun trajecten werden over elkaar heen gelegd om een momentopname van de cellulaire mobiliteit te verkrijgen. De trajecten werden vervolgens genormaliseerd. Normale levers bevatten cellen met willekeurige migratiepatronen.

Levermet coursework geïnjecteerd met CCI vier vertoonden een verminderde cellulaire migratie. Bij het meten van de totale verplaatsing vanaf hun oorsprong was duidelijk dat er 36 uur na de CCI vier-behandeling sprake was van celopsluiting op de plaats van de hepatocellulaire schade. De door leverschade belemmerde migratie kon ook worden aangetoond door de migratiesnelheid van individuele cellen over de tijd uit te zetten, waarbij een gedeeltelijke stop na 18 uur en een volledige migratiestop na 36 uur zichtbaar was.

De afname in de snelheid van de migrerende cellen kon ook als statistisch significant worden aangetoond wanneer de cellen als populaties werden vergeleken. Deze benadering is derhalve geschikt voor het volgen van veranderingen in celmigratie en positionering bij ontwikkelende leverziekten. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de lever van een muis klaarmaakt voor intravitale multifotonmicroscopie.

De methode die wij hier presenteren, stelt ons in staat om het dier te stabiliseren voor overleving op lange termijn, terwijl bewegingsartefacten tot een minimum worden beperkt dankzij de milde fixatiemethode die wij beschrijven. Zodra de maskering is voltooid, kan deze techniek in ongeveer één uur worden uitgevoerd indien deze correct wordt toegepast. Tijdens deze procedure is het essentieel om de vitale parameters van de dieren te controleren, waaronder de stabilisatietemperatuur, hartslag, zuurstofgehalte en CO2-waarden. Dit kan worden bereikt door de diepte van de narcose en de ademhaling bij het volgen van deze techniek aan te passen.

Andere procedures, zoals flowcytometrie-analyse of laser-capture microdissectie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het fenotype van de infiltrerende immuuncellen of mediatoren die door weefsel of infiltrerende cellen na hun ontwikkeling worden uitgescheiden. Deze technieken stelden onderzoekers in staat om inzicht te krijgen in de dynamiek van leukocytenverkeer en cellulaire interacties in de lever, waardoor de volgorde van gebeurtenissen die leiden tot inflammatoire leverziekten kon worden ontleed. Volg de richtlijnen voor laserveiligheid bij het uitvoeren van beeldvorming met een infraroodlaser met hoge energiepulsen die wordt gebruikt voor multifotonmicroscopie.

Zorg ervoor dat geen enkele reflectie van laserstraling een gevaar kan vormen voor uw ogen en huid tijdens het uitvoeren van dit experiment.