Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen
24 maart 2015
Het is een uitdaging om stabiele, intravitale, hoogwaardige beelden van immuuncellen in de lever te maken. Hier bieden we een zeer gevoelige en betrouwbare methode om migratie en cel-cel-interacties van immuuncellen in de muizenlever gedurende langere perioden (ongeveer 6 uur) te bestuderen door middel van intravitale multifoton laser scanning microscopie in combinatie met intensieve zorg monitoring.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de migratie en interactie van leukocyten in progressieve leverontstekingsziekten te volgen. Om de reeks gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan hoe deze cellen worden aangetrokken in het leverweefsel en hun mogelijke betrokkenheid bij de immunopathologie beter te begrijpen. Dit wordt bereikt door eerst een tracheotomie uit te voeren om de controle over de ademhaling van de muis te krijgen, een cruciale stap om de langetermijnoverleving van het dier te garanderen.
Als tweede stap worden de muis laparotomies om het leverweefsel chirurgisch bloot te leggen, waardoor toegang tot het orgaan met de multifotonmicroscoop wordt verkregen. Vervolgens wordt de lever gefixeerd en gepositioneerd door deze in een aeros in te bedden om bewegingsartefacten te minimaliseren. Beeldvorming kan gedurende enkele uren worden uitgevoerd, wat leidt tot hoogwaardige, time-lapsesequenties die de veranderingen in rekrutering, positionering en interactie van individuele leukocyten volgen.
In het proces van het ontwikkelen van leverontsteking, kan deze methode helpen om belangrijke vragen op het gebied van acute en chronische leverontsteking te beantwoorden, zoals leukocytenrekrutering, cel-cel-interacties of mechanismen van immunopathologie. Het grote voordeel van deze techniek in vergelijking met conventionele microscopie is dat multifocale microscopie langdurige beeldvorming mogelijk maakt met vrijwel geen verstoring van het monster met lage verbleking of fototoxiciteit, evenals optische plakjes tot 100 micrometer diep in het weefsel, en dit komt door de unieke fysica van de laser van het ver rode laserlicht. Welnu, deze methode kan inzicht bieden in leverziekten.
Het kan gemakkelijk worden aangepast aan andere systemen. Omdat de methode van stabilisatie en fixatie, het weefsel kan worden toegepast op vrijwel alle vragen van intravitale microscopie, zodat het gemakkelijk organen zoals milt, nier of zelfs subcutane tumoren kan beeldvormen met behulp van vloeibare gerelateerde cellen. Het is ook mogelijk om alle leukocytensubsets te visualiseren en hun interacties en leverontsteking te bestuderen.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn bij deze methode worstelen vanwege de extreme complexiteit van kleine dierdierenchirurgie. Echter, vanwege onze eigen ervaring, is dit slechts een beperkende factor voor een paar weken en heeft het slechts wat praktische ervaring nodig. Vanwege de kwetsbaarheid van leverweefsel, zijn de voorbereidingsstappen moeilijk te leren, en visuele demonstratie van de methode is essentieel. Na het opzetten van de anesthesie, vult u de muis aro-fase met 3% aros, door deze in een hoek van 40 graden te gieten.
Zorg er vervolgens voor dat het chirurgische werkgebied volledig gedesinfecteerd is, evenals alle vereiste instrumenten en ga zo maar door. Vervolgens verdooft u de muis met een intraperitoneaal injectie van een anesthesiecocktail. Vijf minuten later controleert u de reflexen van het dier en desinfecteert u vervolgens de huid en brengt u oogzalf aan op de ogen.
Vastzet nu de muis op de voorbereidingstafel. Gebruik tape om deze te positioneren om de ventrale zijde voorzichtig bloot te leggen door de nek licht te strekken. Een rubberen band die aan de snijtanden is gehaakt, kan dit bereiken.
Voer nu de eerste incisie uit onder de kin van ongeveer 0,5 tot een centimeter lang. Vervolgens dissecteert u voorzichtig het bindweefsel tussen de speekselklieren en vindt u de spierbuis rond de luchtpijp. Scheur de spier voorzichtig open om de luchtpijp bloot te leggen.
Trek een draad onder de luchtpijp en open vervolgens de luchtpijp met microscharen met een T-vormige incisie in de incisie. Plaats de beademingsbuis ongeveer een halve centimeter. Breng de buis vooruit met kleine anatomische pincetten.
Beveilig vervolgens de buis met hechtingen. Vervolgens voor extra veiligheid, hecht u de buis aan de huid, sluit u de incisie in de huid af met cyanoacrylaat en bevestigt u de buis aan het hoofd van het dier. Gebruik kleefband om de anesthesie te onderhouden met een continue stroom van 2% iso fluorine.
Nadat u de muis hebt voorbereid op de operatie, maakt u een kleine huidincisie onder het borstbeen en verlengt u de snede lateraal onder de ribben aan beide zijden. Cauteriseerd alle blootgestelde bloedvaten in dit proces. Om bloedingen te minimaliseren, voert u een kleine initiële snede uit bij de lineaire elleboog om toegang te krijgen tot de buikholte.
Verleng de snede horizontaal, sluit alle bloedvaten af en geef toegang tot de lever. Verplaats nu de muis naar de agro-fase en stapel dia's aan beide zijden van het dier om het op zijn plaats te houden. Deze stapels moeten overeenkomen met de hoogte van de muis, zodat de fase voor de lever, die later zal worden geplaatst, geen overmatige druk op de buik uitoefent.
Gebruik nu hechtingen in het borstbeen om de ribben terug te trekken. Een vier nul hechting zal voldoende zijn. Nadat u de ribben hebt teruggetrokken, snijdt u de ligamenten die de lever en het diafragma verbinden, tot aan de aorta, maar werk met extra voorzichtigheid om het vat niet te scheuren of te snijden. Snijd ook het ligament dat de lever en het maagdarmkanaal verbindt.
Draai de muis 45 graden om de toegang tot de grotere leverkwab te verbeteren. Neem een standaard dekglas en kleef het langs de randen zodat het niet scherp is. Plaats het over de buikholte.
Dit zal dienen als een podium voor de lever om de lever op het podium te positioneren. Schuif voorzichtig een dubbele kogelstiftsonde of een gevulde spatel onder de lever en houd de bovenkant van het orgaan vast. Met behulp van een vochtig weefselmechanische druk zal de leverweefsel onmiddellijk worden beschadigd, dus het is essentieel om het orgaan voorzichtig te behandelen.
Til vervolgens de lob op de schuif en trek er voorzichtig aan en in positie. De lob zal meestal gebogen of gevouwen eindigen, probeer de randen voorzichtig uit te vouwen door het weefsel op te tillen met een dunne spatel of een
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor stabiele intravitale beeldvorming met hoge resolutie van immuuncellen in de lever, waardoor de observatie van hun migratie en interacties over langere perioden mogelijk is. Door gebruik te maken van intravitale multifoton laserscanning microscopie, maakt deze benadering gedetailleerde monitoring van leukocytengedrag in een muismodel van inflammatoire leverziekte mogelijk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Intravitale beeldvorming
Achtergrond
- Het begrijpen van de dynamica van immuuncellen bij leverontsteking is cruciaal voor inzichten in immunopathologie.
- Langdurige beeldvormingstechnieken zijn noodzakelijk om het gedrag van leukocyten vast te leggen.
- Vorige methoden ontbraken de gevoeligheid en betrouwbaarheid voor lange observatieperioden.
- Deze studie gaat deze uitdagingen aan met een nieuwe beeldvormingsbenadering.
Doel van studie
- Om de migratie en interactie van leukocyten in de lever te onderzoeken.
- Om de recruteringsmechanismen van immuuncellen tijdens leverontsteking te verduidelijken.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor langetermijnbeeldvorming van immuunresponsen.
Gebruikte methoden
- Tracheotomie uitgevoerd voor ademhalingscontrole van de muis.
- Laparotomie om de lever bloot te leggen voor beeldvorming.
- Inbedding van de lever in een medium om bewegingsartefacten te verminderen.
- Intravitale multifoton laserscanning microscopie voor beeldvorming met hoge resolutie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle langetermijnbeeldvorming van leukocytenmigratie en interacties.
- Hogeresolutie time-lapse sequenties legden veranderingen in leukocytengedrag vast.
- Inzichten in de dynamica van immuuncelrecrutering bij leverontsteking.
- Demonstratie van de haalbaarheid van de methode voor het bestuderen van immuunresponsen.
Conclusies
- De ontwikkelde methode biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van immuunceldynamica.
- Het verbetert ons begrip van de rol van leukocyten bij leverziekten.
- Deze benadering kan worden toegepast op andere modellen van ontsteking en immuunrespons.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Long-term intravital imaging of immune cell dynamics in the liver enables mechanistic de-risking of inflammatory liver disease targets by visualizing leukocyte recruitment, positioning, and interactions in real time. This approach supports target validation by linking CXCR6-expressing immune cell behavior to disease progression in preclinical models, improving predictive confidence in therapeutic hypotheses. The method provides a disease-relevant system for assessing immunomodulatory compounds under physiologically relevant conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking CXCR6.gfp+ immune cell migration and positioning in healthy and diseased liver.
- Operational Value: Provides functional validation of leukocyte subsets involved in immunopathology through direct observation of cell-cell interactions.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by visualizing impaired migration and cell trapping in CCl4-induced liver injury models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements such as migration speed, total displacement, and interaction frequency for compound screening.
- Operational Value: Delivers reproducible, high-resolution time-lapse data with minimal phototoxicity over 6-hour imaging windows.
- Operational Value: Enables standardized preparation and fixation protocols that reduce variability across experiments and laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects immune cell dynamics to disease progression by correlating CXCR6+ cell behavior with acute and chronic liver damage.
- Operational Value: Facilitates preclinical model validation by enabling longitudinal assessment of leukocyte trafficking in intact tissue.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by linking imaging readouts to histopathological outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical assessment by providing dynamic, quantitative readouts of immune cell behavior in a disease-relevant liver microenvironment.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of leukocyte recruitment mechanisms and stromal interactions in inflammatory liver disease.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized tissue preparation with stabilization of vital signs for consistent imaging conditions.
- Analytics: Provides track-based metrics including migration speed, displacement, and interaction maps for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects intravital observations to disease phenotypes through correlation with CCl4-induced hepatocellular damage.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other organs and disease models via standardized surgical preparation and intravital imaging framework.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in leukocyte-driven immunopathology.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized anesthesia, vital sign monitoring, and tissue embedding protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by visualizing target engagement and cellular response in intact tissue.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on direct observation of immune cell modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, anesthesia management, and intravital microscopy operation.
- Dependent on multiphoton laser scanning microscopes with tunable far-red excitation and sensitive detectors.
- Necessitates cross-team standardization of surgical preparation, vital sign monitoring, and image analysis pipelines.
- Adaptation to other models requires validation of tissue stabilization and reporter expression in target organs.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for specialized training to maintain animal viability during long-term imaging.
