Name: Paarsgewijze Groei Competitie Assay voor het bepalen van de Replicatie Fitness van Human Immunodeficiency Virussen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Leer paarsgewijze groeicompetitie-assays voor het meten van replicatiefitness van HIV-1-stammen. Deze methode biedt gevoelige en robuuste metingen van virale groeikinetiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze onderzoeken werden gefinancierd door subsidies van de Amerikaanse Public Health Services P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 en de Functional Profiling and Computational Biology Core van het Center for AIDS Research van de Universiteit van Washington (P30 AI027757).

<ol><li>Domingo, E., Holland, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+virus+mutations+and+fitness+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">RNA virus mutations and fitness for survival.</a> Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).</li>
<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+viral+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of viral emergence.</a> Veterinary research. 41 (6), 38(2010).</li>
<li>Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+resistance+mutations+and+fitness%3A+a+view+from+the+clinic+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo.</a> Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).</li>
<li>Troyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+fitness+impact+of+HIV-1+escape+mutations+to+cytotoxic+T+lymphocyte+%28CTL%29+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000365(2009).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-acid+co-variation+in+HIV-1+Gag+subtype+C%3A+HLA-mediated+selection+pressure+and+compensatory+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics.</a> PLoS One. 5 (9), e12463(2010).</li>
<li>Abraha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR5-+and+CXCR4-tropic+subtype+C+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+have+a+lower+level+of+pathogenic+fitness+than+other+dominant+group+M+subtypes%3A+implications+for+the+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic.</a> J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).</li>
<li>Quinones-Mateu, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+infection%2Fcompetition+assay+shows+a+correlation+between+ex+vivo+human+immunodeficiency+virus+type+1+fitness+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression.</a> J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).</li>
<li>Ball, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+ex+vivo+fitness+of+CCR5-tropic+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+of+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22B+and+C.+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes.</a> B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).</li>
<li>Lanxon-Cookson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+relative+fitness+measurements+in+pairwise+competition+assays+of+human+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses.</a> J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).</li>
<li>Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmitted+human+immunodeficiency+virus+type+1+carrying+the+D67N+or+K219Q%2FE+mutation+evolves+rapidly+to+zidovudine+resistance+in+vitro+and+shows+a+high+replicative+fitness+in+the+presence+of+zidovudine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine.</a> J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).</li>
<li>Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+replication+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+with+a+didanosine-selected+reverse+transcriptase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation.</a> J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).</li>
<li>Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+fitness+of+protease+inhibitor-resistant+mutants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).</li>
<li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reverse+transcriptase+mutants+G190S+and+G190A%2C+which+confer+resistance+to+non-nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors%2C+demonstrate+reductions+in+RNase+H+activity+and+DNA+synthesis+from+tRNA%28Lys%2C+3%29+that+correlate+with+reductions+in+replication+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency.</a> Virology. 348 (2), 462-474 (2006).</li>
<li>Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+immune+escape+mutations+on+HIV-1+fitness+in+the+context+of+the+cognate+transmitted%2Ffounder+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome.</a> Retrovirology. 9 (89), (2012).</li>
<li>Ali, A., Yang, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+reporter+gene+and+HIV-1+fitness+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay.</a> Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).</li>
<li>Maarseveen, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real-time+PCR+assay+to+determine+relative+replication+capacity+for+HIV-1+protease+variants+and%2For+reverse+transcriptase+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants.</a> J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cytotoxic+T-lymphocyte+epitopes%3A+fitness-balanced+escape%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape.</a> J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).</li>
<li>Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+CCR5+inhibitors+caused+by+sequence+changes+in+the+fusion+peptide+of+HIV-1+gp41%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).</li>
<li>Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+HIV-1+ex+vivo+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness.</a> Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+real-time+PCR+based+assay+to+estimate+the+impact+of+amino+acid+substitutions+on+the+competitive+replication+fitness+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture.</a> J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).</li>
<li>Brumme, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+capacity+of+NL4-3+recombinant+viruses+encoding+reverse+transcriptase-integrase+sequences+from+HIV-1+elite+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr%22%5BJournal%5D)">Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+reductions+in+Gag-protease-mediated+HIV-1+replication+capacity+during+the+course+of+the+epidemic+in%5BTitle%5D)+AND+%22Japan.+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in.</a> Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+conserved-element+vaccines%3A+relationship+between+sequence+conservation+and+replicative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity.</a> J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).</li>
<li>Martinez-Picado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+cost+of+escape+mutations+in+p24+Gag+in+association+with+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).</li>
<li>Brockman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+and+Compensation+from+Early+HLA-B57-Mediated+Cytotoxic+T-Lymphocyte+Pressure+on+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Gag+Alter+Capsid+Interactions+with+Cyclophilin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A.</a> J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).</li>
<li>Miura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-associated+alterations+in+replication+capacity+of+chimeric+NL4-3+viruses+carrying+gag-protease+from+elite+controllers+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).</li>
<li>Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, PCR: The Polymerase Chain Reaction. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction">http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction</a> (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).</li>
<li>Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, Restriction Enzyme Digests. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests">http://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests</a> (2014).</li>
<li>McClure, J., van't Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+upregulates+HIV-1+replication+in+monocyte-derived+macrophages+cultured+at+low+density%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimatingfifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimatingfifty percent endpoints.</a> Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).</li>
<li>Nickle, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+and+ancestral+state+HIV+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Consensus and ancestral state HIV vaccines.</a> Science. 299 (5612), 1515-1518 (2003).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+function+of+ancestral+center-of-tree+human+immunodeficiency+virus+type+1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins.</a> J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).</li>
<li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlap+extension+PCR+cloning%3A+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li>
<li>Spira, A. I., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+donor+cells+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+and+selection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro.</a> J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).</li>
<li>Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+costs+of+mutations+at+the+HIV-1+capsid+hexamerization+interface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface.</a> PLoS One. 8 (6), e66065(2013).</li>
<li>Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+height+pattern+in+dichloro-rhodamine+and+energy+transfer+dye+terminator+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing.</a> Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).</li>
<li>Lalonde, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+oligonucleotide+ligation+assay+for+low-level+detection+of+nevirapine+resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+quasispecies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies.</a> J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen. De meningen hier zijn die van de auteurs en mag niet worden opgevat als officiële of vertegenwoordiging van de standpunten van het Amerikaanse ministerie van Defensie of het Ministerie van het Leger.

De gepresenteerde protocol bestond uit twee delen: de bouw van recombinant HIV-1 moleculaire klonen en groei concurrentie assays. Om de twee virussen in een tweevoudig geïnfecteerde celkweek te onderscheiden, is het belangrijk dat de concurrerende moleculaire klonen bevatten sequentietags, die kan worden gedetecteerd door een RT-qPCR primer-probe assay of door Sanger sequentiebepaling. Dit protocol maakt gebruik van de Vifa en VifB markeringen, die hetzelfde gebied van HIV-1 NL4-3 vif bezetten en coderen voor dezelfde aminozuursequentie maar verschillen zes synoniem mutaties. Deze mutaties bleken niet te beïnvloeden virale replicatie fitness 20. De PCR-gebaseerde kloneringswerkwijze gebruikt in dit protocol geeft meer flexibiliteit bij de keuze kloneringsplaatsen tegenover restrictieplaats gebaseerde klonering. De efficiëntie van PCR klonering af naarmate de insert wordt groter. De stroomlimiet van de insert grootte ~ 5 kb 34. Voor PCR-gebaseerde klonen en plaatsgerichte mutagenesis, het gebruik van een high-fidelity DNA polymerase is cruciaal om de kans op extra mutaties verminderen. Het gebruik van het minimale aantal PCR cycli die nodig zijn om voldoende hoeveelheden van produkten verkregen wordt ook aanbevolen. In onze ervaring, hebben we geen extra mutaties na de PCR-gebaseerde klonen en plaatsgerichte mutagenese hier beschreven stappen op te sporen. Toch is de PCR producten worden gesequenced om te controleren op ongewenste mutaties. Idealiter zou de gehele HIV coderende gebied wordt resequenced. Minstens drie sampling tijdstippen moeten worden onderzocht binnen de exponentiële groeifase 9. De virale groeikinetiek moet eerst worden vastgesteld met behulp van de dagelijkse steekproeven naar de juiste kweekperiode en bemonstering tijdstippen voor de groei concurrentie te bepalen. Een factor die virusgroei kinetiek beïnvloedt is de multipliciteit van infectie (MOI). Dit protocol maakt gebruik van een totaal MOI van 0,005 voor zowel monoinfection en de groei van de concurrentie, zoals het werd aangetoond dat meer ro opleverenbuste resultaten dan lagere MOI 9. Desalniettemin kunnen lagere MOI&#39;s worden gebruikt om indien gewenst een langere exponentiële groeifase te verkrijgen, maar ten koste van het resultaat consistentie. Dit protocol geeft een aanvankelijke infectie van 50:50, aangenomen dat de conditie verschillen van de virussen die in het algemeen niet op voorhand. Het gebruik van ongelijke ingang verhoudingen geschikt wanneer er voorlopige gegevens suggereren significante verschillen in virale replicatie kinetiek. In deze gevallen wordt een infectie van 70:30 aanbevolen om voor de detectie van een grote fitness uit waar het minder geschikt virus wordt in overmaat 9. Het protocol voor het bepalen van de TCID 50, virale groei kinetiek en voor het uitvoeren van de groei competitietesten werden geoptimaliseerd met behulp van HIV-1 subtype B zijn NL4-3 COTB-p24 en PBMC&#39;s van een donor waarvan PBMC constante gevoeligheid aangetoond HIV- 1-infectie in vitro. De kweekperiodeen bemonstering tijdstippen die in dit protocol zijn waarschijnlijk geschikt voor het bestuderen van HIV-1 groep M virussen in menselijke PBMC&#39;s te zijn. Met behulp van PBMC uit één bron wordt sterk aangeraden om consistente resultaten te verkrijgen als de virale replicatie kan variëren in verschillende donorcellen 35. Alhoewel minder wenselijk kunnen PBMC samengebracht uit meerdere donoren worden gebruikt als vervanging voorwaarde dat dezelfde pool wordt gebruikt in alle experimenten. Een ander alternatief is het gebruik van cellijnen. De hier gepresenteerde protocol werd met succes gebruikt bij de T-cellijn CEMx174 23,36. Het is echter van belang dat het aantal cellen uitgezet zijn opnieuw geoptimaliseerd om consistente celgroei te bereiken. Virale groeikinetica moeten worden hersteld, omdat het kan variëren in verschillende cellijnen, voor de juiste bemonsteringstijdstip punten bepalen de stappen groeicompetitie. Twee verschillende methoden om de virale verhouding berekend geschiktheid vast zijn opgenomen in de protocol. De eerste maakt gebruik van RT-qPCR om virale cDNA aantal kopieën op elk monsternemingstijdstip punt meten. Virusreplicatie fitness werd vervolgens berekend uit het virale verhouding, gebaseerd op cDNA-kopieaantal. Alternatief kan het virale verhouding worden bepaald op basis van de verhouding van chromatogram piekhoogte bij VifAB tag sites. Beide werkwijzen leverden vergelijkbare resultaten (Figuur 4). Het chromatogram piekhoogte werkwijze kan worden toegepast op andere HIV-1-stammen zonder aangelegde sequentieaanhangsel. Voor RT-qPCR, het gebruik van primers of probes om virale varianten onderscheiden eerst zorgvuldig moet worden geëvalueerd (zie 20). Niettemin RT-qPCR een betere gevoeligheid voor monsters met een kleine hoeveelheid viraal RNA, zoals die van het eerste tijdpunt in de exponentiële groeifase. Directe meting van de virale cDNA maakt het ook mogelijk de detectie van technische problemen die kunnen voortvloeien uit de RNA-extractie en cDNA synthese. Het gebruik van moleculaire klonen met sequentietags een kosteneffectieve oplossing to de RT-qPCR methode, aangezien slechts twee paren van primers en probes nodig zijn meerdere virussen te bestuderen. Deze strategie vermijdt het probleem van piek hoogte variatie in sequentie chromatogrammen vanwege naburige bases 37, zoals sequentiebepaling wordt uitgevoerd op dezelfde locatie voor alle virussen in de studie. De PCR producten geproduceerd voor RT-qPCR en Sanger sequentiebepaling kan ook gebruik van andere methoden om virale verhouding vastgesteld zoals bulk sequencen van individuele klonen 12,13, HTA 4,7,17,19 of oligonucleotide ligatie-assay (OLA) 38 .

Virale replicatie conditie wordt gedefinieerd als het vermogen van een virus om infectieus nageslacht te produceren in een bepaalde omgeving 1 en is een belangrijke factor bij het ​​bepalen van het voorkomen van een virus variant op populatieniveau tijd 2. Zoals in vivo studies conditie niet haalbaar met pathogene menselijke virussen, zoals HIV-1, diverse in vitro en ex vivo replicatie fitness assays werden ontwikkeld om de effecten op fitness gevolge van resistentie tegen immune ontsnappingsmutaties, epistasie en de evolutie bestuderen van virale populaties 3-6. Onder verschillende fitness assays zijn groei competitiebepalingen erkend gevoeliger en valide metingen van fitness verschillen verkregen, als twee of meer virale varianten strijden om dezelfde celpopulatie onder exact dezelfde omgevingsomstandigheden, zoals gebeurt in vivo 1,7,8. Voordat groei concurrentie-experimenten te beginnen, enkele variables behoeft te worden vastgesteld, inclusief het gebruik van verschillende veelvouden van infectie (MOI), virale invoerfactor en timing van monsters voor analyse. We hebben de effecten van deze parameters op de virale kinetiek en de groei van het resultaat van de concurrentie-experimenten bestudeerd en hebben in celcultuur 9 belangrijke factoren die nodig zijn voor robuuste metingen van HIV-1 fitness geïdentificeerd. Naast assay variabelen zijn verschillende methoden voor het kwantificeren van virale varianten groei competitie-experimenten. Bulk 10,11 of 12,13 klonale sequentie werd gebruikt om de verhouding van de concurrerende virussen gebaseerd op de nucleotide frequenties op de plaats (en) van belang te bepalen. Relatieve fitness is afgeleid van veranderingen in deze verhouding in de tijd. Deze methode is handig als DNA sequencing services zijn overal verkrijgbaar. De parallelle allel-specifieke sequencing (PASS) methode maakt sequencing op meerdere plaatsen en de opsporing van recombinanten 14 </sup&gt;, Maar het vereist ook speciaal ontwikkelde reagentia en detectiesystemen. In wezen zijn deze werkwijzen ontwikkeld om virusstammen studie met een klein aantal nucleotide verschillen in een van belang. Andere werkwijzen gebruiken een reportergen 15 of synoniem mutaties 4,16-18 als tags aan de concurrerende virussen door sequentiebepaling, heteroduplex tracking-assays (HTA) 4,7,17,19 onderscheiden of omgekeerde transcriptie-kwantitatieve real-time polymerase-kettingreactie (RT-qPCR) 15,16,18,20, die allemaal toepassing studeren concurrerende stammen, onafhankelijk van sequentieovereenkomst kan worden gemaakt. Een extra stap nodig om labels in virale genoom te introduceren en de RT-qPCR assay vereist ook specifieke reagentia en instrumenten. We hebben ontdekt dat bulk Sanger sequencing levert vergelijkbare resultaten 9. Na groei concurrentie, is virale replicatie fitness gepresenteerd als relatieve fitness, of een fitness-verhouding tussen two virale varianten. De relatieve conditie van een virus kan worden gedefinieerd als de uiteindelijke hoeveelheid van een virale variant genormaliseerd zijn aanvankelijke hoeveelheden in het inoculum of de netto groei tussen de twee concurrerende virussen. We vonden dat deze werkwijze gebruikt longitudinale gegevenspunten alleen in de exponentiële groeifase, produceerde de meest robuuste resultaten 9,20. In vitro assays fitness hoofdzakelijk worden gebruikt om biologische klonen 6-8 en besmettelijke moleculaire klonen van HIV-1 te bestuderen. De laatste, die ontvankelijk zijn voor genetische manipulatie, worden dikwijls gebruikt om het effect op de geschiktheid van bepaalde mutaties of specifieke sequenties van belang 3-5,21,22 bestuderen. De volgende protocollen beschrijven een werkstroom van het punt van de bouw van nieuwe full-length infectieus HIV-1 moleculaire klonen middels HIV-1 vectoren die een sequentie tag, introduceren van mutaties plaats, waardoor virale voorraden en vaststelling virale groeikinetiek, Het uitvoeren van de groei competitieve test en het berekenen van relatieve fitness (figuur 1). Met behulp van onze geoptimaliseerde procedures, creëerden we drie recombinant HIV-1 mutanten en vastberaden hun replicatie fitness. Het recombinante moleculaire kloon werd eerst geconstrueerd door de HIV-1 gag p24-gen regio pNL4-3, een plasmide dat een volledige lengte infectieus genoom van HIV-1 NL4-3 lab stam, een synthetisch COTB (Midden-Of- Boom, subtype B) gag-p24 volgorde 23 tot de prototype stam te creëren. Single aminozuur veranderingen (T186M, T242N en I256V) werden vervolgens geïntroduceerd tot drie mutante klonen te creëren. Elke mutant werd streden tegen het prototype virus aan de fitness effect van elke mutatie in de gegeven genetische achtergrond te observeren. De drie mutanten gedemonstreerd variërende niveaus van replicatie fsitness van licht tot ver onder het prototype virus. De T242N mutatie werd eerder gemeld een matige Fitne hebbenss kosten 24-26, vergelijkbaar met de in deze studie resultaat. De geschiktheid kosten van de andere twee mutaties nog niet eerder beschreven.

<table><tbody><tr><td>Constructie van recombinante klonen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chimere primer/Mutagene/Sequencing primers</td><td>IDT</td><td></td><td>Aangepaste DNA oligo's</td></tr><tr><td>pNL4-3VifA en pNL4-3VifB plasmid</td><td></td><td></td><td>Neem contact op met Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)</td></tr><tr><td>High-fidelity DNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>High-fidelity buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>Thermische cycler</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems&reg; GeneAmp&reg; PCR System 9700</td></tr><tr><td>DNA lading kleurstof</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel-extractiekit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DpnI enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>TOP10 chemisch competent Escherichia coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth basispoeder</td><td>Invitrogen</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>Research Products International</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Transfectie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA-transfectiereagens</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>http://www.atcc.org/</td></tr><tr><td>0.22 &#956;m filter top tube</td><td>VWR International</td><td>89220-716</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&prime;s Modified Dulbecco&prime;s Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 media</td><td>Life Technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>Phytohemagglutinine (PHA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>Human Interleukin-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>JR Scientific</td><td>43640</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline en Streptomycine</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>VWR Scientific</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>48 well plate</td><td>VWR Scientific</td><td>62407-338</td><td></td></tr><tr><td>96 well flat-bodem plate</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-3015-4</td><td></td></tr><tr><td>96 well ronde bodem plate</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tube</td><td>Mt. Baker Bio</td><td>MBD-1500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tubes met O-ring</td><td>VWR Scientific</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische tube</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-3317-6</td><td></td></tr><tr><td>ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat buffer saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-konijn HRP</td><td>KPL</td><td>474-1516</td><td></td></tr><tr><td>TMB Microwell Peroxidase Substraat</td><td>KPL</td><td>52-00-01</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300-500</td><td>Veroorzaakt ernstige brandwonden bij alle blootstellingsroutes. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen. Alleen gebruiken onder een chemische afzuigkap. Onmiddellijk met veel water spoelen gedurende ten minste 15 minuten.</td></tr><tr><td>HIV p24 standaard</td><td>AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick)</td><td></td><td>Voor besteldetails neem contact op met Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>VMax Kinetic ELISA Microplate Reader</td></tr><tr><td>RNA isolatie cDNA synthese</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAxtractor</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>SuperscriptIII</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>First-strand buffer</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Rnase inhibitor</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>RnaseH</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Real-time qPCR machine</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR</td></tr><tr><td>TaqMan&reg; Gene Expression Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Voorwaartse, achterwaartse primer</td><td>IDT</td><td></td><td>Aangepaste bestelling</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Aangepaste bestelling</td></tr><tr><td>optische 96 well reactie plate</td><td>Life Technologies</td><td>I19N3Q216</td><td></td></tr><tr><td>PCR+sequencing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase (Biolase)</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>NH4 buffer</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing primer</td><td>IDT</td><td></td><td>Aangepaste bestelling</td></tr><tr><td>QIAxcel</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/

paarsgewijze groei competitie assay voor het bepalen van de replicatie fitness van human immunodeficiency virussen

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitnessassays zijn essentiële hulpmiddelen voor het bepalen van de virale replicatiefitness voor virussen zoals HIV-1. Er zijn verschillende metingen gebruikt om de virale replicatiefitness te extrapoleren, variërend van het aantal virale deeltjes per infectieuze eenheid, groeisnelheid in celcultuur en relatieve fitheid afgeleid van groeiassays met meerdere cycli. Groeiassays bieden een bijzonder gevoelige meting van fitheid aangezien de virussen onder identieke groeiomstandigheden concurreren voor cellulaire doelen. Er zijn verschillende experimentele factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het uitvoeren van groeiassays, waaronder de multipliciteit van infectie (MOI), bemonsteringstijden en virale detectie- en fitheidsberekeningsmethoden. Elke factor kan het eindresultaat beïnvloeden en moet daarom zorgvuldig worden overwogen tijdens het experimentele ontwerp. Het hier gepresenteerde protocol omvat stappen van het construeren van een nieuw recombinant HIV-1-klon tot het uitvoeren van groeiassays en het analyseren van de experimentele resultaten. Dit protocol maakt gebruik van experimentele parameterwaarden waarvan eerder is aangetoond dat ze consistente en robuuste resultaten opleveren. Alternatieven worden besproken, aangezien sommige parameters moeten worden aangepast aan het celtype en de virussen die worden bestudeerd. Het protocol bevat twee alternatieve methoden voor virale detectie om flexibiliteit te bieden, aangezien de beschikbaarheid van instrumenten, reagentia en expertise varieert tussen laboratoria.

Om de geschiktheid effect van enkele aminozuurveranderingen in HIV-1-Gag p24 onderzoeken, gebruikten we oligonucleotide-gerichte mutagenese om mutaties te introduceren in een pNL4-3 plasmide dat het HIV-1-p24-gen COTB 23,32,33. Virale voorraden werden gegenereerd door transfectie van 293T-cellen en geoogst na 48 uur. We schatten de 50% weefselkweek infectieuze dosis (TCID50) van elke virale voorraad van het Reed-Muench methode 31. De TCID50 van het prototype en mutante virussen varieerde van 10 april - 10 mei IU / ml (Figuur 3A). De groeikinetiek van de recombinante virussen werden in PBMC opgericht vanuit een donor met een MOI van 0,005. RT-qPCR werd gebruikt om de dagelijkse virale cDNA aantal kopieën te meten zes dagen. Alle mutante virussen en prototype exponentieel steeg tussen dag 2 en dag 4, waarna virale groei vertraagd, zoals aangegeven door een verminderde helling van het virale RNA kopienummer verhoging (&lt;strong&gt; Figuur 3B). De afname van cDNA kopienummer tussen dag 0 (overeenkomend met de inoculum) en dag 2 wordt veroorzaakt door de absorptie van het virus aan de cellen en het verwijderen van niet-gebonden virionen per dag 1 was (stap 5.1.6). In de exponentiële groeifase alledrie mutanten hadden een tragere groeisnelheid (g) dan het prototype virus (Figuur 3C). Alle drie mutanten werden concurreerde prototype virus groei competitietesten in totaal MOI van 0,005. Virale groeikinetiek in tweevoudig geïnfecteerde kweken was vergelijkbaar met die van monoinfection; virale exponentiële groeifase was tussen dag 2 en 4, en virale groei een plateau bereikt rond dag 5 (Figuur 4A). Virale groei verschillen werden afgeleid uit de verandering van de virale verhouding in de tijd. Het virus werd berekend op basis van cDNA kopieaantal van de referentie en de mutante virussen met behulp van RT-qPCR, en door vergelijking van piekhoogtenachtereenvolgens chromatogrammen op nucleotideplaatsen onderscheiden de twee virussen (Figuur 4B). Het groeitempo verschillen bepaald met behulp van de piek-hoogte en viraal RNA copy aantal methoden leverde vergelijkbare resultaten (Figuur 4C). Alle drie mutanten hadden lagere replicatie fitness dan het prototype-virussen met de mutant I256V met de laagste fitness (Figuur 4C). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> Figuur 1: Stroomdiagram van de in dit document protocols Het viruspreparaat protocols betrekking bouw van HIV-1 recombinante klonen en productie van virale voorraden.. De Fitness Testen protocollen zijn voor het vaststellen van virale groei kinetiek en het bepalen van de relatieve virale fitness. Stippellijnen vertegenwoordigen alternatieve stromen voor de protocollen. Bijvoorbeeld kan een mutatie worden direct in HIV-1 NL4-3 ingevoerdmoleculaire kloon zonder het genereren van een recombinant-kloon. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> Figuur 2:. Constructie van HIV-1 NL4-3 COTB Gag p24-recombinante moleculaire klonen middels overlap extensie PCR (A) Ontwerp de chimère primers. De 5 &#39;helften van de primers bevatten de NL4-3 vector sequentie en de 3&#39; helften bevatten de einden van de insert sequentie. (B) Chimere primers gebruikt om het insert fragment, COTB Gag p24 amplificeren. (C) De insertie-fragmenten worden gebruikt als primers voor een tweede PCR met een nieuw recombinant-plasmide te genereren. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> Figuur 3:. Virale groeikenmerken in PBMCs (A) Log 10 TCID50 </sub&gt; van virale voorraden. (B) Virale groeikinetiek in monoinfections begonnen bij een MOI = 0,005. (C) Virale groeipercentage in zes dagen, inclusief de exponentiële groeifase (dagen 2-4) verkregen uit paneel (B). De getoonde waarden vertegenwoordigen het gemiddelde van drie herhalingen van het ene experiment. De fout balken geven 95% betrouwbaarheidsintervallen. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> Figuur 4: Virale groei en relatieve fitness bepalingen (A) Virale groei in tweevoudig geïnfecteerde PBMC culturen.. (B) Ratio van T242N en prototype virussen bepaald met behulp van RT-qPCR of sequencing piek hoogte methode. (C) Netto virale groei verschillen (d) tussen de mutant en het prototype virussen tweevoudig geïnfecteerde kweken, zoals in (A). d-waarden werden berekend from de virale verhoudingsgegevens getoond in (B). De getoonde waarden vertegenwoordigen het gemiddelde van drie herhalingen van het ene experiment. De fout balken geven 95% betrouwbaarheidsintervallen.

Groeiconcurrentie tussen bijna isogene virussen biedt een gevoelige meting voor het bepalen van relatieve replicatiefitheid. De hier beschreven protocollen omvatten de constructie van recombinante HIV-1-klonen, viruspropagatie en groeiconcurrentie en analysemethoden geoptimaliseerd om gevoelige en consistente resultaten op te leveren.

Paarsgewijze Groei Competitie Assay voor het bepalen van de Replicatie Fitness van Human Immunodeficiency Virussen

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Het algemene doel van deze procedure is het bepalen van de relatieve replicatiegeschiktheid van HIV-1-stammen van belang. Dit wordt bereikt door eerst virale moleculaire klonen of DNA-plasmiden te construeren die volledige HIV-1-sequenties van belang bevatten. De tweede stap is het genereren van virale stocks voor elke moleculaire kloon via DNA-transfectie.Vervolgens worden de groeikinetiek en de exponentiële groeifase van elke HIV-1-stam vastgesteld door longitudinale bemonstering van mono-geïnfecteerde celculturen. De laatste stap is het uitvoeren van paarsgewijze groeiconcurrentie of dubbele infectie in celculturen. Uiteindelijk worden reverse transcriptie, kwantitatieve real-time PCR en de piekhoogtes van DNA-sequentiechromatogrammen verkregen via Sanger-DNA-sequencing gebruikt om virale ratio's te bepalen, die vervolgens worden gebruikt om de relatieve virale replicatie-fitness te berekenen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals para-mono infectie of duale infectie op twee tijdstippen, is dat het gevoeliger en robuustere metingen oplevert van het verschil in replicatiefitness tussen twee virale stammen. De protocollen in dit artikel omvatten het construeren van HIV-1 recombinante klonen, het introduceren van mutaties van belang via site-directed mutagenese, het maken van virale stocks en het uitvoeren van fitness-assays om de virale groeikinetiek vast te stellen en de relatieve virale fitness te bepalen. Deze video zal de groeicompetitie en twee verschillende methoden demonstreren.Raadpleeg voor het bepalen van de virale ratio voor de berekening van de fitness de protocoltekst voor alle overige procedures. Om de groeiconcurrente-assay voor te bereiden, zaait u driemaal 10⁵ PHA-gestimuleerde perifere mononucleaire bloedcellen of PBMCs in een totaalvolume van 500 µL per putje in een 48-wells platbodemplaat. Bewaar de plaat op 37 °C in een 5% CO2-atmosfeer tot aan de inoculatie. Bereid vervolgens drie milliliter inoculum voor dat 6.000 IU voor elk virus bevat.In een typisch experiment worden meerdere mutanten getest, maar voor deze demonstratie wordt slechts één mutant getest tegen het prototypevirus. Een juiste bereiding van het virale inoculum is een cruciale stap in deze procedure, aangezien seriële verdunning nodig kan zijn bij een virale stock met een zeer hoge infectieuze titer. Breng 1,5 milliliters van elk viraal inoculum over naar een steriele buis om het dubbele infectie-inoculum te creëren.Voeg 500 µL van het dubbele inoculum toe aan de PHA-gestimuleerde PBMCs in elke put van de 48-well plaat. Het uiteindelijke cultuurvolume is 1 mL per put. Verdeel het dubbele inoculum in aliquoten van 200 µL per put over twee 96-well platen voor RNA-isolatie. Bewaar één plaat als reserve. Incubeer de geïnoculeerde cellen bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2 gedurende 16 tot 24 uur. Was 16 tot 24 uur na inoculatie de culturen, verwijder en gooi 750 µL van het cultuursupernatans weg en voeg 750 µL vers compleet Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium of cIMDM toe.Wikkel de plaat in plasticfolie en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 g. Verwijder en gooi 750 µL van het supernatant weg. Voeg 750 µL vers cIMDM toe. Incubeer de platen bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2. De bemonsteringstijden moeten zo worden gekozen dat er ten minste drie tijdspunten binnen de exponentiële groeifase van het virus worden meegenomen.Om een monster te verzamelen, brengt u 500 µL cultuursupernatans over naar een centrifugebuis van 1,8 mL en centrifugeert u dit gedurende één minuut bij 3000 g. Breng 200 µL van de celvrije supernatant over naar twee monsterplaten met 96 wells voor RNA-isolatie. Bewaar hierbij één plaat als reserve. Bewaar de supernatanten bij -80 °C tot aan de RNA-isolatie.Voeg 500 µL verse cIMDM toe aan elke cultuur en plaats de plaat terug in de incubator tot het volgende bemonsteringstijdstip. Vervolgens wordt RNA uit de monsters geïsoleerd, gevolgd door cDNA-synthese. Er zullen twee methoden worden gedemonstreerd voor het bepalen van virale ratio's.De eerste met behulp van reverse transcriptie, kwantitatieve real-time PCR of RT-qPCR en de tweede met behulp van chromatogrampiekhoogtes. Bereid voor qPCR een standaard seriële verdunningsreeks in triplikaat van het plasmide pNL4-3VifA, waarbij in elke stap een tienvoudige verdunning wordt aangebracht, van drie keer 10⁶ kopieën per µL tot 30 kopieën per µL. Stel een qPCR-reactieplaat van 96 wells op.Elke plaat moet ten minste één negatieve controle bevatten, de standaard verdunningsreeks in triplikaat en duplicaten van elk cDNA-monster. Gebruik een vFIA-primerprobe om signalen te detecteren in de negatieve controles, in de standaard verdunningsreeks en bij één duplicaat van het cDNA-monster. Gebruik de vIFB-primerprobe bij het andere duplicaat van het cDNA-monster. Gebruik voor elke qPCR-reactie 12,5 µL van de qPCR-mastermix, 0,2 µM van de qPCR-probe, 0,8 µM van elk de forward- en reverse-primers en 1 µL cDNA. Voeg voor de standaard verdunningsreeks de seriële verdunning van pNL4-3VifA toe in plaats van cDNA; gebruik voor de negatieve controles water of buffer in plaats van cDNA. Stel de PCR-cyclusparameters in volgens de instructies van de fabrikant voor het bedienen van het qPCR-apparaat. Bereken de standaardcurve met behulp van de amplificatiedata van de standaard verdunningsreeks.Vergelijk de amplificatiegegevens van de cDNA-monsters met de standaardcurve om het kopieaantal te bepalen. Gebruik de berekening van de virale groeisnelheid of de GRC-webtool om de relatieve virale fitness te berekenen. Voer het cDNA-kopieaantal dat is verkregen uit de RT-qPCR-stap in het aangegeven formaat in. Door op berekenen te klikken, wordt het netto verschil in groeisnelheid tussen twee concurrerende virussen weergegeven. Om virale ratio's te bepalen met behulp van chromatogrampiekhoogtes, worden HIV-1 Vif-fragmenten die de VifAB-sequentietag bevatten PCR-geamplificeerd met Vif-forward- en Vif-reverse-primers. Gebruik voor elke PCR-reactie 1 µL cDNA, 1X NH₄-buffer, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP's, 2,5 U Taq-polymerase en 0,45 µM van elke primer.Voeg water toe tot een eindvolume van 50 µL. Stel de PCR-cyclusparameters in op drie cycli van 94 °C gedurende één minuut, 55 °C gedurende één minuut en 70 °C gedurende één minuut, gevolgd door 34 cycli van 94 °C gedurende 15 seconden, 58 °C gedurende 30 seconden en 70 °C gedurende één minuut. Sluit af met een hold op 4 °C. Zuiver vervolgens de PCR-producten met een commercieel verkrijgbare kit en stuur de gezuiverde PCR-producten naar een DNA-sequencingdienst voor Sanger-sequencing.Controleer de gemiddelde read-kwaliteitsscore die door de sequencingdienst is verstrekt. Als de gemiddelde nauwkeurigheid van de base call minder dan 85% is, herhaal dan de PCR-amplificatie, de zuivering van de PCR-producten en de Sanger-sequencing. Gebruik de Chromat quantitative webtool om de virale ratio op elk tijdstip te berekenen.De benodigde inputs zijn de leider-sequentie en het sequentiechromatogrambestand in .ab1-formaat. De tool meet de piekintensiteit op de opgegeven locatie.De verhouding van de piekintensiteit komt overeen met de verhouding tussen de twee virussen. Gebruik de GRC-webtool om de relatieve virale fitness te berekenen. De invoer is de piekhoogte van het sequentiechromatogram, verkregen met de Chromat quantitative webtool in het getoonde specifieke formaat. De GRC-webtool berekent het netto verschil in groeisnelheid tussen de twee concurrerende virale stammen; er werden een prototype en drie HIV-mutante virussen geconstrueerd en hun groei in PBMCs werd gekarakteriseerd. De TCID 50 varieerde van 10⁴ tot 10⁵ IU per milliliter. Alle virussen groeiden exponentieel tussen dag twee en dag vier.In de exponentiële groeifase vertoonden alle drie de mutanten een lagere groeisnelheid dan het prototypevirus. Elke mutant werd in groeicompetitie-assays tegen het prototypevirus getest bij een totale MOI van 0,005; de virale groeikinetiek in dubbel geïnfecteerde culturen was vergelijkbaar met die van mono-infectie. De exponentiële groeifase van het virus vond plaats tussen dag twee en vier, en de virale groei bereikte rond dag vijf een plateau.Verschillen in de virale groeisnelheid werden afgeleid van de verandering in de virale ratio over de tijd. De virale ratio werd berekend op basis van het cDNA-kopiegetal van het referentie- en het mutantvirus met behulp van RT-qPCR, en door piekhoogtes in sequentiechromatogrammen te vergelijken op nucleotideposities die de twee virussen onderscheiden; hierbij wordt de T242-N mutant vergeleken met het prototype. In dit voorbeeld leverden de groeisnelheidsverschillen die met de twee methoden werden bepaald vergelijkbare resultaten op.Alle drie de mutanten vertoonden een lagere replicatie-fitness dan het prototypevirus, waarbij de I256-V mutant de laagste fitness had. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van paarsgewijze groeiconcurrerende assays om de relatieve replicatie-fitness van HIV-1 te bepalen.

pairwise-growth-competition-assay-for-determining-replication-fitness

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De kroon van de verschillende regio V3 lus sequenties van het oppervlak enveloppe glycoproteïne (gp120) van HIV-1 kan structureel worden gekarakteriseerd in veel gevallen door in silico vouwing van de posities 10 tot 22 van de lus met behulp van een...

Beoordeling van immunologisch relevante Dynamic tertiaire structurele kenmerken van de HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence door Ab initio Folding

We beschrijven een protocol om de belangrijkste taken van gastheer signaalmoleculen in lytische replicatie van een model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68) te identificeren. Gebruik te maken van genetisch gemodificeerde muizenstammen en embryonale fibroblasten voor γHV68 lytische replicatie, het protocol maakt het mogelijk zowel de fenotypische karakterisatie en moleculaire ondervraging van virus-gastheer interacties in virale lytische replicatie.

Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Hier beschrijven we cellulaire cytotoxiciteit en ronde infectiviteitsassays die zorgen voor een snelle en nauwkeurige screening van verbindingen om hun cellulaire cytotoxiciteit (CC50) bepalen en IC 50-waarden tegen WT en resistente HIV-1.

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

HIV-1-pathogenese wordt bepaald door zowel virale kenmerken als genetische factoren van de gastheer. Hier beschrijven we een robuuste methode die reproduceerbare metingen mogelijk maakt om de impact van de gag gensequentieverschil op de in vitro replicatiecapaciteit van het virus te beoordelen.

Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen<em&gt; In vitro</em&gt; Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen

Methoden om de werkzaamheid en toxiciteit van RNA-moleculen die zich richten op post-integratie stappen van de HIV-1 replicatiecyclus te evalueren, worden beschreven. Deze methoden zijn nuttig voor het screenen van nieuwe moleculen en het optimaliseren van de indeling van bestaande.

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Infectie van menselijke weefsels met humaan immunodeficiëntie virus (HIV) ex vivo biedt een waardevolle 3D-model van virus pathogenese. Hier beschrijven we een protocol voor het verwerken en infecteren van weefsel monsters van menselijke amandelen en vrouwelijke genitale mucosae met HIV-1 en onderhouden ze in cultuur in de vloeistof-lucht-interface.

Ex Vivo Infectie van menselijke lymfoïde weefsels en vrouwelijke genitale Mucosa met Humaan Immunodeficiëntie Virus 1 en Histoculture

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

Dit protocol biedt een methode om vast te stellen gehumaniseerd muizen (hu-NSG) via Intrahepatische injectie van menselijke hematopoietische stamcellen in straling-geconditioneerd neonatale NSG muizen. De hu-NSG muis is gevoelig voor HIV-infectie en combinatorische antiretrovirale therapie (cART) en dient als een geschikt pathofysiologisch model voor HIV-replicatie en latentie onderzoeken.

Gehumaniseerd knik/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) muis Model voor HIV-replicatie en Latency Studies

Hier beschrijven we enkele gevestigde methoden om endoplasmatisch reticulum (ER) stress en activering van ongevouwen eiwitrespons (UPR) te bepalen, met bijzondere nadruk op HIV-1-infectie. Dit artikel beschrijft ook een reeks protocollen om het effect van ER-stress/UPR op HIV-1-replicatie en virion-infectiviteit te onderzoeken.

Het meten van endoplasmatisch reticulumstress en ongevouwen eiwitrespons in HIV-1-geïnfecteerde T-cellen en het analyseren van de rol ervan in HIV-1-replicatie

Leer paarsgewijze groeicompetitie-assays voor het meten van replicatiefitness van HIV-1-stammen. Deze methode biedt gevoelige en robuuste metingen van virale groeikinetiek.

Paarsgewijze Groei Competitie Assay voor het bepalen van de Replicatie Fitness van Human Immunodeficiency Virussen

Meer video's verkennen