Name: 3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Leer een 3D organotypische co-cultuurmethode voor medullaire thymus-epitheelcellen met verbeterde proliferatie, differentiatie en promiscueuze genexpressie in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk is ondersteund door het Duitse Kankeronderzoekscentrum (DKFZ), het EU-consortium “Tolerage”, de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) en de Landesstiftung Baden-Württemberg.

Deze studie is goedgekeurd door de ethische commissie van het Regierungspräsidium Karlsruhe. Alle dieren werden gehuisvest onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden bij de Duitse Cancer Research Center (DKFZ). Voor alle kweekexperimenten muis pups van 1 tot 7 dagen oud werden gebruikt. 1. Isolatie van mTECs van Thymus Opmerking: De volgende digestie stappen werden uitgevoerd zoals eerder is beschreven 1 onder steriele omstandigheden met enkele wijzigingen, opgenomen. <ol><li> Onthoofden de muis pups en verwijder de thymus. Plaats de thymi op ijs in een Petri plaat met RPMI 1640 medium (met 5% FCS). </li><li> Snijd de thymi in fijne, reepjes en plaats in een buis met ronde bodem ~ 5-30 ml RPMI-medium en voorzichtig roeren met een magneet voor 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Daarna, decanteren de bovenstaande die hoofdzakelijk thymocyten en te verteren de resterende weefsel opeenvolgend met een ronde van COLLAGENAse type IV (0,2 mg / ml en 57 U / ml uiteindelijk concentartion) gedurende 15 min elk bij 37 ° C, gevolgd door collagenase / dispase (0,2 mg / ml en 1,2 U / ml eindconcentratie) gedurende 25 min elk bij 37 ° C in een waterbad onder magnetisch roeren totdat de thymi volledig gedigereerd. Met 1 ml enzyme per 2-3 thymi. </li><li> Schud het weefsel eens 7-10 minuten met een Pasteur pipet. Pool de collagenase / dispase breuken en filteren door middel van een 70 um gaas. </li><li> Verrijk de mTECs door magnetische celsortering (MACS). Voer de zuivering van mTECs door magnetische celsortering zoals eerder 11 beschreven en is getoond in figuur 1. OPMERKING: Bij magnetische sortering van mTECs gebruikten we de volgende antilichamen: anti-CD80-PE (16-10A1, gebruikt bij 1: 100 verdunning) en anti-EpCAM-bio (G8.8, gebruikt bij 1: 100 verdunning) 12. Onvolwassen en volwassen mTECs met MACS werden gedefinieerd als: CD45 - EpCAM + CD80 - en CD45 - CD80 + respectively. </li><li> Na MACS zuivering (zuiverheid van onrijpe mTECs = 83,1 ± 6,3% en volwassen mTECs = 79,23 ± 3,42%), het zaad van de mTECs op de organotypische culturen zoals hieronder beschreven (paragraaf 2.3). </li><li> Alternatief sorteren mTECs met FACS (met 100 um nozzle) na CD45 MACS depletie met de volgende antilichamen: anti-CD45-PerCP (30-F11, gebruikt bij 1: 100 verdunning), anti-Ly51-FITC (6C3, gebruikt bij 1 : 100 verdunning), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, gebruikt bij 1: 500 verdunning) en anti-CD80-PE (16-10A1, gebruikt bij 1: 100 verdunning). Uitsluiten dode cellen met behulp van propidiumjodide (1: 5.000) (dag 4). Onvolwassen en volwassen mTECs met FACS werden gedefinieerd als: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - en PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 +, respectievelijk. </li></ol> 2. 3D Organotypische Co-culturen (OTC) LET OP: De 3D-dermal constructies voor organotypische teelt van keratinocytes werden bereid zoals eerder beschreven 9,13. Bij alle stappen werden cellen geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO 2. De OTC&#39;s gebruiken mTECs werden als volgt bereid met geringe modificaties. <ol><li> Voorbereiding van de menselijke fibroblasten OPMERKING: De menselijke dermale fibroblasten werden verkregen uit explantkweken van-de epidermised dermis zoals eerder 9 beschreven. <ol><li> Kortom, gesneden stroken menselijke huid (~ 5 cm lang) en behandel met thermolysine (0,5 mg / ml in zoutoplossing met 10 mM Hepes pH 7,4) O / N bij 4 ° C. </li><li> Daarna, scheid de epidermis van de dermis behulp van een tang. </li><li> Fijn gesneden de dermis in kleine stukjes, plaats in een 10 cm Petri plaat en laten drogen gedurende 1-2 uur onder een steriele luchtstroom. Vul het explantaten regelmatig DMEM met 20% FBS. </li><li> Splits de-out groeiende fibroblasten wanneer confluent (meestal rond de 3 weken) met 0,1% trypsine ervoor te zorgen dat de explantaten blijven houden aan de plaat voor verdere conopeenvolgende rondes van uitgroei. </li><li> Vouw de fibroblasten uit dezelfde explantaten tot 3 maal in DMEM met 10% FBS en cryo-behouden ze 14. Gebruik dezelfde partij fibroblasten voor elke experimentele serie. LET OP: De fibroblasten werden niet bestraald voor de set-up van de dermale equivalenten. </li></ol></li><li> Bereiding van de steiger <ol><li> Snijd de 0,4-0,6 mm dik viscose, geweven vezelmateriaal (productdetails in de ondersteuning van excel sheet) in goed afgebakend cirkels met een scherp 11 mm diameter metalen puncher om precies te passen in 12 goed filter inserts. Plaats deze dan in de 12- goed filter insert (polyester capillaire porie membraan, 3 micrometer poriegrootte) als een schavot. Plaats het volledige filter opstelling in een steriele 12-well plaat. </li><li> Bereid de fibrine gel met een fibrinelijm-kit voor chirurgie bestaande uit een combinatie van fibrinogeen en trombine. Pre-verdun het fibrinogeen en de thrombine-component van de kit tot 8 mg / ml en 10eenheden / ml, respectievelijk. Voor een enkel putje van een 12-well plaat als volgt. <ol><li> Verdun 100 pi fibrinogeen (8 mg / ml) met 100 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca 2 + en Mg2 +, pH 7,0. Verdun 100 ui thrombine (10 eenheden / ml) met 100 ul FCS bevattende 270.000 fibroblasten. </li><li> Breng 200 pi van het thrombine met fibroblasten cell-mix op de scaffold waaraan 200 pi fibrinogeen toe (1: 1 mengsel), resulterend in een uiteindelijke concentratie van fibrinogeen van 2 mg / ml en 2,5 eenheden trombine / ml. Meng goed en verdeel gelijkmatig over het hele gebied van de steiger door zachte pipetteren (dag 1). OPMERKING: Na 30 min bij 37 ° C een prop omsluit de fibroblasten wordt gevormd, vult volledig de binnenruimten van de steiger en het vormen van een glad bovenvlak. </li></ol></li></ol></li><li> Co-cultuur met mTECs <ol><li> Voor pre-cultuur, dompel het orgel culturenDMEM met 10% FBS, 50 ug / ml L-ascorbinezuur en 1 ng / ml TGF-β1 met een mediumverversing om de dag gedurende 4-5 dagen. </li><li> Op de dag van MTEC zaaien Vervang het medium rFAD medium (1: 1 DMEM + DMEM / F12) met 10% FBS, 10 -10 M choleratoxine, 0,4 mg / ml hydrocortison, 50 ug / ml L-ascorbinezuur, RANK-ligand (0,1 ug / ml) en 500 eenheden / ml aprotinine, waardoor vroegtijdige fibrinolyse door serine proteasen vanuit fibroblasten voorkomen. </li><li> 7-8 uur later, set-up van de co-kweken van zaaien 250.000 mTECs (hetzij volledig mTECs of CD80 en CD80 hi lo subsets), in een volume van 100 gl per putje bovenop de fibroblast scaffold. Tel de cellen met behulp van een Neubauer kamer (dag 4). LET OP: Te allen tijde de thymus 3D organotypische culturen worden ondergedompeld in de media in tegenstelling tot de huid OTC&#39;s die voorzien zijn opgeheven. </li><li> Na 24 uur incubatie, leveren de culturen met medium (totaal medium uitwisseling) zoals hierboven (stap 2.3.2) genoemd nu containing verlaagde bedragen van aprotinine, 250 eenheden / ml (Dag 5). </li><li> Om de proliferatieve activiteit van mTECs beoordelen voeg edu (6,7 uM / ml, dat wil zeggen, 10 pM / putje) aan OTC&#39;s voor 4 uur voor beëindiging van het kweken. Voer de kleuring van OTC cryo-profielen zoals beschreven in de EDU Beeldverwerkingskit combinatie met co-kleuring van keratine 14. Bepaal de proliferatieve indices van mTECs, hetzij door het tellen van de K14 + EDU + cellen in twee secties van elke kweek specimen of de stroming cytometrie (EDU flowcytometrie, paragraaf 1.7 maar in plaats van Ly51-FITC gebruikt CDR1-PB 15 bij een 1: 100 verdunning en 2.3.6.4). </li><li> Na 4-7 dagen van de co-cultuur, beëindigen de OTC&#39;s en het proces voor de RNA-isolatie, cryo-snijden of FACS-analyse (dag 8-11). <ol><li> Beëindig de kweken met een pincet, het scheiden van de scaffold / dermale equivalenten voor filter van de put insert. </li><li> Voor cryo-snijden, insluiten het gehele OTC in OCT verbinding en bevriezen in liquid stikstofdamp voordat cryo-snijden. Bereid 5-7 pm dikke secties OTC behulp van een cryostaat en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. Voor immuno-histochemie van cryo-sectioned OTC&#39;s gebruiken anti-keratine 14 (AF64 gebruik bij 1: 1000 verdunning), en anti-vimentine (GP53, gebruikt bij 1: 100 verdunning) antilichamen. Voer de indirecte immuno-histochemie kleuring met behulp van respectieve secundaire antilichamen. </li><li> Voor RNA-isolatie, voeg 1 ml denaturerende oplossing (bevattende fenol en guanidinium thiocyanaat) in een schroefdop van 2 ml RNase-free tube. Snijd de gehele OTC in stukken met een scalpel en voeg in de buis bevattende denaturerende oplossing. Mechanisch versnipperen de OTC&#39;s met FastPrep instrument tweemaal gedurende 30 seconden bij een snelheid van 6,0, plaatsen tussen op ijs gedurende 2 minuten (het monster kan worden opgeslagen bij -80 ° C na dit punt). Indien bij -80 ° C ingevroren, ontdooid op ijs. Centrifugeer de buizen bij 11,500-13,000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C. Breng het supernatant naar een nieuwe buis, incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en fOLLOW RNA-isolatie protocollen middels zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie zoals beschreven door de fabrikant. </li><li> Voor FACS analyse, verwijder het schavot en scheiden de membraan van de fibrine / fibroblast / Mtec gel. Fijngesneden de gel met een scalpel en verteren in een FACS buis ~ 20 minuten of totdat het volledig gedigereerd met 2 ml collagenase / dispase bij 37 ° C in een waterbad onder magnetisch roeren. Schud de enzymoplossing met een Pasteur pipet eens 5 min. Na volledige digestie, filter de celsuspensie door een 70 urn filter; vlek de enkele celsuspensie met de antilichamen zoals beschreven in 1.7 en geanalyseerd door flow cytometrie. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li>
<li>Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A central role for central tolerance.</a> Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).</li>
<li>Bonfanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+reprogramming+of+thymic+epithelial+cells+to+skin+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells.</a> Nature. 466, 978-982 (2010).</li>
<li>Kont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Aire+regulates+the+expression+of+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens.</a> Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).</li>
<li>Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+the+thymus+is+required+to+maintain+delta-like+expression+necessary+for+inducing+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development.</a> J Immunol. 176, 730-734 (2006).</li>
<li>Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+proinsulin-producing+medullary+thymic+epithelial+cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones.</a> Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).</li>
<li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaggregate+thymus+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).</li>
<li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+homeostasis+in+long-term+scaffold-enforced+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Dermatol+Symp+Proc%22%5BJournal%5D)">Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents.</a> J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).</li>
<li>Boehnke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fibroblasts+and+microenvironment+on+epidermal+regeneration+and+tissue+function+in+long-term+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents.</a> Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).</li>
<li>Pinto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).</li>
<li>Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+and+the+developmental+dynamics+of+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells.</a> Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).</li>
<li>Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+heterogeneity+in+the+murine+thymus%3A+a+cell+surface+glycoprotein+expressed+by+subcapsular+and+medullary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).</li>
<li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Authentic+fibroblast+matrix+in+dermal+equivalents+normalises+epidermal+histogenesis+and+dermoepidermal+junction+in+organotypic+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture.</a> Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).</li>
<li>Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+organization+and+differentiation+of+HaCaT+keratinocytes+in+organotypic+coculture+with+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).</li>
<li>Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+reactive+with+subsets+of+mouse+and+human+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen financiële of commerciële belangenverstrengeling.

Naast RTOCs zijn de 3D ​​OTC&#39;s qua TEC differentiatie en PGE onderhoud / inductie (Tabel 1) in vergelijking met andere (i) &quot;vereenvoudigde 3D ​​cultures &#39;met verreweg superieur - fibroblasten alleen zonder het skelet; (Ii) 2D systemen met - fibroblasten / feeder-cellen samen gekweekt met TEC 10, (iii) 3T3-J2 cellen waarbij TEC klonen ontwikkelen, maar PGE verloren, (iv) Matrigel of (v) ECM componenten (ongepubliceerde gegevens). PGE werd gehandhaafd voor maximaal 7 dagen in de 3D...

Ontwikkeling thymocyten maken ongeveer 98% van de thymus, terwijl de resterende 2% uit diverse cellen die tezamen vormen het thymus stroma (bijvoorbeeld epitheliale cellen, dendritische cellen, macrofagen, B-cellen, fibroblasten, endotheelcellen). De buitenste corticale epitheelcellen (cTECs) verwerven immigratie van pro-T-cellen van het beenmerg, T cellijn inductie bij multipotente pre-T-cellen en positieve selectie van zelf-MHC beperkte onrijpe thymocyten. De binnenste medullaire thymus epitheelcellen (mTECs) zijn betrokken bij inductie van de thymocyten met hoge affiniteit TCR voor zelf-peptide / MHC-complexen door ofwel induceren negatieve selectie of de afwijking in de regulatoire T-cellijn. In het kader van de centrale tolerantie inductie, mTECs zijn uniek in dat ze drukken een breed spectrum van weefsel beperkt zelf-antigenen (TRA) dus mirroring de perifere zelf. Dit fenomeen wordt promiscue genexpressie genoemd (PGE)1,2. De meeste huidige studies over deze fascinerende celtype afhankelijk ex vivo geïsoleerde cellen, diverse korte 2D kweeksystemen steeds resulteerde in het verlies van PGE en belangrijke regulator moleculen zoals MHC klasse II, FoxN1 en Aire binnen de eerste 2 dagen 3-6 . Het bleef echter onduidelijk welke bepaalde componenten en eigenschappen van het intacte 3D maaswerk van de thymus ontbraken in 2D modellen. De re-aggregatie thymus orgaankweek (RTOC) heeft tot nu toe de enige 3D-systeem dat de studie van T-celontwikkeling mogelijk maakt, enerzijds, en stromale celbiologie, daarentegen is, in een intacte thymus micromilieu 7. Toch RTOCs bepaalde beperkingen, dat wil zeggen, zij bevatten reeds een complex mengsel van cellen, input nodig foetale bindweefselcellen en doorstaan ​​een maximale kweekperiode van 5-10 dagen. Het ontbreken van reductionistisch in vitro kweeksystemen heeft de studie van belemmerdverschillende aspecten van de T-cel ontwikkeling en thymus organogenese niet in het minst de moleculaire regulatie van PGE en haar relatie tot de ontwikkelingsbiologie van mTECs. Door de nauwe verbondenheid van de gestructureerde organisatie van de epitheelcellen van de huid en de thymus, hebben we gekozen voor een 3D organotypische cultuur (OTC) systeem dat oorspronkelijk was ontwikkeld om de differentiatie van keratinocyten in vitro na te bootsen en zo een dermale equivalent. De OTC bestaat uit een inerte scaffold matrix bedekt met dermale fibroblasten die zijn gevangen in een fibrinegel, waarop keratinocyten geënt 8,9. Hier hebben we vervangen keratinocyten met gezuiverd mTECs. Terwijl de fundamentele kenmerken van dit model, we geoptimaliseerd bepaalde parameters. In de vastgestelde OTC model mTECs verspreidden, onderging terminale differentiatie en onderhouden Mtec identiteit en PGE, dus nauw nabootsen in vivo mTECs ontwikkeling <sup&gt; 10. Deze technische notitie geeft een gedetailleerd protocol waardoor de stapsgewijze set-up van de thymus OTC&#39;s.

```html
<table><tbody><tr><td>Zwangere C57BL/6 muizen&nbsp;</td><td>Charles River WIGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS kolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MS kolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Microbeads, muis</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 en -biotine)</td><td>Ref. 12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD80-PE antilichaam</td><td>BD Pharmingen</td><td>553769</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PerCP antilichaam</td><td>BD Pharmingen</td><td>557235</td><td></td></tr><tr><td>Ly51-FITC antilichaam</td><td>BD Pharmingen</td><td>553160</td><td></td></tr><tr><td>CDR1-Pacific Blue</td><td>Ref. 15</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratine 14 antilichaam</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin antilichaam</td><td>Progen</td><td>GP58</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-geconjugeerd AffiPure Geit anti-Konijn IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-geconjugeerd AffiPure F(ab')2 Fragment Geit anti-Guinee-Varken IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>106-546-003</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Konijn IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488-conjugaat</td><td>Molecular Probes (Invitrogen GmbH)</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10339</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10425</td><td></td></tr><tr><td>12-wels filter inserts (thincerts)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657631</td><td></td></tr><tr><td>12-wels plaat</td><td>Greiner</td><td>665180-01</td><td></td></tr><tr><td>Jettex 2005/45</td><td>ORSA, Giorla Minore, Italië</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogeen TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trombine TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Serva</td><td>47302.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-049&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinine (Trasylol)</td><td>Bayer</td><td>4032037</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin</td><td>Biomol</td><td>G117</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Seromed (Biochrom)</td><td>K3520</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbinezuur</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&szlig;1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9214</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>R&amp;D systems</td><td>462-TR-010</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp;T-7902</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>TissueTek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (ook bekend als Denaturerende oplossing - Acid guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie)</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep FP120</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collageenase Type IV&nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS004189</td><td>0,2 mg/ml en 57U/ml eindconcentratie</td></tr><tr><td>Neutrale Protease (Dispase)</td><td>CellSystems</td><td>LS002104</td><td>0,2 mg/ml en 1,2U/ml eindconcentratie</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 284 932 001</td><td>25 &micro;g/ml eindconcentratie</td></tr></tbody></table>
```

3d organotypische co-cultuur model supporting medullary thymic epitheelcelproliferatie, differentiatie en promiscuous gene expression

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymus T cel ontwikkeling vereist een ingewikkelde driedimensionale maaswerk uit verschillende stromale cellen, dwz niet-T-cellen. Thymocyten doorkruisen deze steiger in een sterk gecoördineerde temporele en ruimtelijke orde, terwijl achtereenvolgens passeren verplichte check points, dwz T-cel lineage inzet, gevolgd door T-cel-receptor repertoire generatie en selectie vóór de uitvoer in de periferie. De twee belangrijkste bewoner celtypes vormen deze steiger zijn corticale (cTECs) en medullaire thymus epitheelcellen (mTECs). Een belangrijk kenmerk van mTECs is de zogenaamde promiscue expressie van verschillende weefsel-beperkte antigenen. Deze weefsel beperkte antigenen worden gepresenteerd aan thymocyten direct of indirect onvolwassen door mTECs of thymus dendritische cellen, respectievelijk resulterend in zelf-tolerantie. Geschikte in vitro modellen emuleren de ontwikkelingstrajecten en functies van cTECs en mTECs zijn lacking. Dit gebrek aan adequate experimentele modellen is bijvoorbeeld bemoeilijkt de analyse van promiscue genexpressie, die nog steeds slecht begrepen op cellulair en moleculair niveau. We pasten een 3D organotypische co-cultuur model tot cultuur ex vivo geïsoleerde mTECs. Dit model werd oorspronkelijk ontworpen om keratinocyten kweken op zodanige wijze dat een huidequivalent in vitro genereren. Het 3D-model behouden belangrijke functionele kenmerken van MTEC biologie: (i) proliferatie en terminale differentiatie van CD80 lo, Aire-negatief in CD80 hi, Aire-positieve mTECs, (ii) respons op RANKL, en (iii) aanhoudende expressie van FoxN1, aire en weefsel beperkt genen in CD80 hi mTECs.

We heeft een 3D organotypische co-cultuur model (3D OTC), die oorspronkelijk was ontwikkeld voor in vitro lange termijn cultuur van keratinocyten 9. MACS-verrijkte mTECs (zie MACS verrijking schema Figuur 1) werden gezaaid op een steiger bestaande uit een fibrine gel en ingesloten fibroblasten. De fibroblasten geven de essentiële extracellulaire matrix (ECM) ondersteunen mTECs in vitro. MTECs werden in OTC&#39;s gekweekt voor 4-14 dagen in de aanwezigheid van RANKL in onderg...

Het bestuderen van medullaire thymische epitheelcellen in vitro is grotendeels onsuccesvol geweest, omdat huidige 2D-kweeksystemen het in vivo scenario niet nabootsen. Het 3D-kweeksysteem dat hierin wordt beschreven - een gemodificeerd organotypisch model voor huidcultuur - heeft zich superieur getoond in het nadoen van mTEC-proliferatie, differentiatie en het behoud van promiscue genregulatie.

3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Het algemene doel van deze procedure is het kweken van thymische, medullaire epitheelcellen, of mTEC, in een driedimensionale organotypische kweek of OTC-systeem. Dit wordt bereikt door eerst het vezelige steigermateriaal in een filterinzet voor 12 putjes te plaatsen, gevolgd door het aanbrengen van een laag vers bereide fibrinengel die menselijke huidfibroblasten bevat. Na vier tot vijf dagen prekweek worden de mTEC op de steiger geplaatst en gekweekt onder ondergedompelde kweekcondities.Uiteindelijk kunnen immunohistochemie, RNA-isolatie en functionele analyses worden uitgevoerd op de co-culturen om de ontwikkeling van de CED Mtech te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van de 3D-organotypische co-culturesystemen ten opzichte van de bestaande 2D-culturesystemen is dat ze veel superieur zijn in het nabootsen van de mtech-differentiatie, proliferatie en het behoud van promiscuïe genexpressie. Vandaag zal Iris Martin, een technicus van ons collaboratielaboratorium, deze techniek demonstreren.Wanneer de humane dermale fibroblasten confluentie bereiken, worden de steigervezels voorbereid door de 0,4 tot 0,6 millimeter dikke stukken visconiet-vliesmateriaal te koken, te drogen en te strijken. Gebruik een metalen perforator om ze in cirkels van 11 millimeter te snijden. Plaats het gesneden vezelmateriaal tussen twee objectglazen, wikkel de objectglazen in folie en autoclaceer ze.Plaats de inserts na sterilisatie in de putjes van een steriele 12-wellplaat, en plaats vervolgens elk scaffold in een overeenkomstig insert. Meng daarna 2,7 × 10⁵ fibroblasten in 100 µL foetaal kalfsserum met 100 µL vers verdunde thrombine per scaffold. Verdeel het mengsel van thrombine en fibroblasten over elk van de scaffolds, gevolgd door 200 µL vers verdund fibrinogeen.Meng vervolgens het celmengsel in elke put door de oplossing met voorzichtig pipetteren gelijkmatig over het gehele scaffold te verdelen. De afbeelding toont de groei van de humane dermale fibroblasten met de fibrinengel op dag één en dag vier van de cultuur. Bereid daarnaast een testgel voor in een controleput zonder scaffold om de tijd en de vorming van de stolsels op dit moment te volgen.Beoordeel de stolling met een pipetpunt of door de plaat om te keren; zodra de fibroblasten zijn gestold, worden de organkweken gedurende vier tot vijf dagen ondergedompeld in medium, aangevuld met sorbinezuur en TGF beta one. Vervang op de dag van de MTE-uitzaaiing dit medium door RFAD-medium dat 500 units per milliliter aprotinine bevat om vroegtijdige fibrinolyse te voorkomen. Zaai zeven tot acht uur later 2,5 × 10⁵ MTE, gesuspendeerd in 100 µL RFAD, uit op de bovenkant van elk scaffold en incubeer de coculturen gedurende 24 uur. Vervang de volgende dag het medium door vers medium met 250 units per milliliter aprotinine voor nog eens vier tot zeven dagen kweek.Om de ontwikkeling van de m Texs aan het einde van de kweek via immunohistochemie te beoordelen, gebruikt u een pincet om het dermale equivalent van het steigerwerk van elk filter te scheiden. Plaats en bedC de OTC's in OCT-compound. Bevries de OTC's in de gasfase boven vloeibare stikstof om de O-T-C-R-N-A te isoleren.Nadat het steunweefsel van de filters is gescheiden, gebruik een scalpel om de OTC's in stukjes te snijden en breng de stukjes over in een RNA-vrije buis van twee milliliter die één milliliter denatureeroplossing bevat. Gebruik een fast prep-instrument om de OTC's tweemaal mechanisch te versnipperen met een snelheid van 6,0 gedurende 30 seconden per keer, met een rustperiode van twee minuten op ijs tussen elke versnippering. Isoleer vervolgens het RNA met behulp van zuur guanidiniumthiocyanaat-fenylchloroformextractie zoals beschreven door de fabrikant.Om de OTC's via flowcytometrie te analyseren, verwijdert u het membraan en scheidt u het steunstructuur van de fibrine fibroblast mtech-gel. Snijd vervolgens de gel met een scalpel zoals zojuist gedemonstreerd. Breng het weefsel over in een fax-buis.Voeg twee milliliters van de collagenase-pasta toe. Plaats de buis vervolgens 20 minuten lang in een waterbad van 37 degrees Celsius onder magnetisch roeren. Roer elke vijf minuten met uw pipet totdat het weefsel volledig is verteerd.Filter de resulterende celsuspensie door een zeef van 70 micrometer en kleur de cellen met de geschikte antilichamen zoals geïllustreerd. De MTS kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van hun expressie van keratine 14, waardoor ze gemakkelijk te onderscheiden zijn van de menton-positieve fibroblasten. Opvallend is dat onrijpe en rijpe M Texs verschillende, maar zeer reproduceerbare groeipatronen vertonen in kweek.De onrijpe CD 80 D low M Texs vormen bijvoorbeeld typisch dubbellaagen in nauw contact met de fibroblasten. Terwijl de CD 80 D high MTS de neiging hebben om compacte celaggregaten te vormen die worden begrensd door de fibroblasten, overleven de mtech-subsets niet alleen, maar prolifereren zij ook onder de gedemonstreerde 3D OTC-condities, zoals blijkt uit hun EDU-incorporatie. Opvallend is dat de CD 80 low MT techs een hogere proliferatiesnelheid vertonen in de aanwezigheid van rankl.Hoewel het omgekeerde geldt voor CD 80-hoge MT-techs, zou u na het bekijken van deze video een goed inzicht moeten hebben in hoe MT-techs gekweekt kunnen worden met behulp van 3D-OTC's. Deze methode is superieur aan het gebruik van 2D-kweeksystemen wat betreft de differentiatie van techs en de instandhouding en inductie van PGE, met het potentieel om verschillende parameters te bestuderen of te manipuleren.

3d-organotypic-co-culture-model-supporting-medullary-thymic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In deze video de bereiding van 2-dGuo behandelde reaggregate thymus culturen is aangetoond.

Reaggregate Thymus Culturen

Deze video toont de dissectie en verwijdering van de foetale thymus en de voorbereiding van de ex vivo kweken van 2-dGuo behandeld thymus.

Bereiding van 2-dGuo behandelde Thymus Organ culturen

This video demonstrates a protocol for generating functional antigen-specific T cells from iPSC-derived immature T cells using a three-dimensional thymic culture system. Co-culturing the iPSC-derived immature T cells with endogenous lymphocyte-depleted mice fetal thymic lobes resulted in successful maturation of the T cells to form CD8αβ+ MHC class I+ iPSC-derived thymic emigrants (iTEs).

Three-Dimensional Thymic Culture System to Generate iPSC-Derived Thymic Emigrants

Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

We beschrijven de bereiding van thymus segmenten die in combinatie met flowcytometrie, kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie van T-cellen ontwikkelen modelleren. Thymus segmenten kunnen ook worden aangepast voor de in situ analyse van thymocyten migratie, lokalisatie en signalering via immunofluorescentie en twee-foton microscopie.

Voorbereiding en Toepassingen van organotypische thymus Slice Culturen

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Hier worden vier methoden beschreven voor het genereren van testiculaire organoïden uit primaire neonatale murine-testiculaire cellen, d.w.z. extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije 2D- en 3D-cultuuromgevingen. Deze technieken hebben meerdere onderzoekstoepassingen en zijn vooral nuttig voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling en fysiologie in vitro.

Extra Cellular Matrix-based en extra cellular matrix-vrije generatie van Murine Testiculaire Organoïden

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van type-1 aangeboren lymfoïde cellen uit de muriene dunne darm lamina propria, en het vaststellen van 3-dimensionale (3D) co-culturen tussen beide celtypen om bi-directionele interacties tussen intestinale epitheelcellen en type-1 aangeboren lymfoïde cellen te bestuderen.

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

Dit protocol beschrijft de isolatie van dubbelnegatieve thymocyten uit de thymus van de muis, gevolgd door retrovirale transductie en co-cultuur op het delta-achtige 4-tot expressie brengende beenmerg stromale cellijn co-cultuursysteem (OP9-DL4) voor verdere functionele analyse.

Co-cultuur en transductie van murine thymocyten op delta-achtige 4-tot expressie brengende stromale cellen om oncogenen in T-cel leukemie te bestuderen

Hier beschrijven we een protocol voor de vorming van humane iPSC-afgeleide thymusorganoïden gekweekt in 3D-fibrinehydrogels met als doel de rijping van thymusepitheelcellen (TEC) en langdurig onderhoud te ondersteunen, evenals thymopoëse in vitro.

Vorming van menselijke thymusorganoïden in driedimensionale fibrinehydrogels

Om de differentiatie en functie van CD8 T-cellen in vitro te bestuderen, kunnen CD8 T-cellen uit de muis worden geïsoleerd om langdurig te worden gekweekt met vooraf geïnfecteerde vaginale epiteelorganoïden van muis. Hier beschrijven we dit proces en beoordelen we de verwerving van residente geheugen T-celmarkers bij co-kweek.

In vitro Resident geheugen CD8 T-celdifferentiatie met behulp van het epitheliale organoïde-T-cel co-cultuursysteem

Leer een 3D organotypische co-cultuurmethode voor medullaire thymus-epitheelcellen met verbeterde proliferatie, differentiatie en promiscueuze genexpressie in vitro.

3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression (Video) | JoVE Journal

3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression

Meer video's verkennen