High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen

Het algemene doel van deze procedure is om 384-well assay platen voor te bereiden en uit te voeren voor hoogwaardige doorvoeranalyse van een zeer homoloog groep genen, zoals de type één en drie interferon subtypes. Dit wordt bereikt door eerst de standaard seriële verdunning voor te bereiden die wordt gebruikt voor het uitvoeren van de assay platen. Vervolgens worden de primer probe en de no template control werkstockmixen voorbereid die worden gebruikt voor het maken van de platen.

Vervolgens worden de 384-well assay platen voorbereid met behulp van een geautomatiseerde multikanaals pipetter en worden ze gedroogd voor opslag. Ten slotte worden de 384-well assay platen uitgevoerd en geanalyseerd. Uiteindelijk wordt de hoogwaardige kwantitatieve real-time RT PCR R assay gebruikt om interferon expressiesignaturen in weefselkweekmodellen, ziekteverwekkers of in klinische monsters in de context van infectieuze of auto-inflammatoire ziekten te definiëren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals kwantitatieve R twee PCR, met behulp van standaard lineaire sondes of cyberg green, is dat moleculaire baken en lock nucleic acid fluorescente sondes kunnen worden gebruikt om verschillen van één basepaar te onderscheiden tussen zeer vergelijkbare sequenties Na het ontdooien, vortexen en kort centrifugeren van een standaard en zalmzaad of S-S-D-N-A. Bereid de SSD NA water mix voor de 17 standaard verdunningssets voor door 51 microliter S-S-D-N-A te mengen met 20,3 milliliter water. Schenk 190 microliter van de SS DNA water mix in de eerste buis van een achtbuisige PCR strip en 180 microliter in de volgende vijf buizen.

Voer een een op twintig verdunning uit door 10 microliter over te brengen van de 50 Picomolar standaardstock naar de buis met 190 microliter S-S-D-N-A water mix, vortex en centrifugeer snel. Voer in de PCR strip een een op tien verdunning uit door 20 microliter over te brengen van de meest recente verdunde buis naar de volgende buis in de serie, vortex en centrifugeer de PCR strip snel. Herhaal de een op tien verdunning totdat de laatste buis in de serie de standaard heeft ontvangen.

Na het labelen van maximaal 17 twee milliliter buizen, gebruik een 12,5 microliter elektronische multikanaals pipetter om twee microliter S-S-D-N-A toe te voegen aan elke buis met primers en probes die volgens het tekstprotocol zijn voorbereid. Voeg de juiste voorwaartse primer, achterwaartse primer en sonde toe aan elke primer. Probe set werkstockbuis om de no template control of NTC werkstockmixen voor te bereiden.

Breng 14,3 microliter van elke primer sonde set over naar de juiste NTC werkstockmixbuis volgens deze tabel. Na het verwijderen van een Eloqua van de primer sonde sets die nodig zijn voor de NTC werkstockmixen, voeg 1,5 milliliter water toe om het eindvolume van elke primer sonde set werkstockbuis op 1,7 milliliter te brengen. Om een 96-well bronplaat van de primer sonde sets en NTC mixen voor te bereiden.

Plaats een nieuwe 96-well plaat in een gekoeld 96-well koelblok en merk de putjes aan met de juiste primer sonde set of NTC mix met behulp van een 250 microliter elektronische multikanaals pipetter. Voeg 66 microliter water toe aan elke primer sonde set. Dispenseer 82,5 microliter water in de vier doelwit 17 putjes.

Dispens 27,5 microliter water in elke anti C mix. Voeg vervolgens 54 microliter van de juiste primer probes aan werkstock toe aan de aangewezen primer probes putjes. Dispenseer 67,5 microliter van de doelwit 17 primer Probe werkstockset naar de aangewezen doelwit 17 primer probes putjes.

Voeg 22,5 microliter van de juiste NTC werkstockmix toe aan de aangewezen putjes. Gebruik vervolgens een kleefplatenverzegeling om de 96-well plaat te verzegelen en centrifugeer gedurende één minuut bij 700 Gs om ervoor te zorgen dat de inhoud op de bodem van de putjes staat met de 96-well adapter. Plaats de plaat in de vortexmixer en meng gedurende één minuut bij 1000 RP.

Centrifugeer vervolgens de plaat gedurende vijf minuten bij 700 Gs. Om de 384-well assay platen voor te bereiden, zet de geautomatiseerde multikanaals pipetter aan en dubbelklik op het softwarepictogram om het protocol voor het maken van interferon assay platen te openen voor het instellen van het platform. Plaats een volledig gevulde pipettentipbox in platformpositie één, de 96-well bronplaat in positie vier en een nieuwe 384-well plaat in positie zes.

Begin de uitvoering door op de afspeelknop te drukken wanneer de uitvoering voltooid is. Tik voorzichtig op de 384-well assay plaat op een vlakke ondergrond om ervoor te zorgen dat de vloeistoffen op de bodem van de putjes staan en breng een kleefplatenverzegeling aan na het draaien van de plaat bij 700 Gs gedurende één minuut. Verwijder de kleefplatenverzegeling.

Plaats de 384-well assay plaat in de platendroger en plaats de 384-well mantel direct boven de putjes. Zodra de inhoud van de 384-well assay platen droog is. Breng een nieuwe kleefplatenverzegeling, snel folielabel aan en bewaar in het donker bij vier graden Celsius tot gebruik voor het laden en uitvoeren van de assay plaat.

Bereid twee housekeeping gen of HKG putjesmixen voor door twee microliter S-S-D-N-A te verdunnen in 84,9 microliter water. Voeg vervolgens twee microliter van de verdunde SSD NA 11,8 microliter water, 23 microliter mastermix en 9,2 microliter van de juiste 20 XHKG primer Probe set toe aan elke gelabelde HKG buis, vortex en centrifugeer kort na het voorbereiden van de monsters en positieve controle CDNA bij 78,8 microliter mastermix en 54,8 microliter water naar elke 24 microliter monster en positieve controlebuis. Om de standaards en NTC putjesmixen voor te bereiden die aan een gedroogd 384-well assay plaat moeten worden toegevoegd, voeg 165 microliter water toe aan 275 microliter mastermix in een 1,5 milliliter buis voor de NTC putjesmix bij 52,5 microliter water tot 52,5 microliter mastermix in een 1,5 milliliter buis.