Name: High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer een high-throughput qRT-PCR assay voor interferon expressieprofielen met geautomatiseerde pipettering. Deze methode discrimineert enkelvoudige basenpaarverschillen voor nauwkeurige immunologische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency overeenkomst yi-AI-6153-01, FDA / CBER intramurale fondsen, en de FDA medische tegenmaatregelen Initiative. TCT, MNB, VPM, LMS, en KDK werden ondersteund door een benoeming in de Research Program Deelname aan het Center for Biologics Evaluation and Research door de Oak Ridge Instituut voor Wetenschappelijk Onderwijs toegediend via een overkoepelende overeenkomst tussen de VS Departmen van Energie en de VS Food and Drug Administration.

1. Voorbereiding van Standard seriële verdunningen (figuur 3A) OPMERKING: Serial verdunningsreeks van gelineariseerde plasmiden die de sequenties doelwit van een Pr / Pb set worden gebruikt als kwantitatieve normen voor de qRT-PCR-test. Elke standaard seriële verdunning set voor de IFN subtypen bevat voldoende volume tot 90 assayplaten draaien. De vier punten van de standaard verdunningscurve gebruikt voor de test zijn geselecteerd Ct effectief mogelijk uit een reeks van 20-32 (tabel 3). <ol><li> Ontdooi, vortex en centrifugeer kort de standaard (50 pM) en zalmsperma DNA (ssDNA, 10 mg / ml) voorraadoplossingen. </li><li> Bereid de ssDNA / water mix voor de 17 standaard verdunning sets door het mengen van 51 ul van ssDNA met 20,3 ml water. </li><li> Label een 8-tube PCR strip voor een standaard verdunning set. OPMERKING: Voorbereiding van de standaard seriële verdunningen van de voorraad oplossingen zal 2-3 uur duren. </li><li> Doseer 190 ul van de ssDNA / water mengsel aan de ferste buis in de strip en 180 ul van ssDNA- / water mix tussen de vijf overblijvende buizen. </li><li> Voer een 1:20 verdunning door de overdracht van 10 ul van de 50 pM standaard bouillon aan de buis met 190 ul van de ssDNA / water, meng; vortex en snel centrifuge de PCR-strip. </li><li> Voer een 1:10 verdunning van overdracht 20 ul van de laatst verdund buis de volgende buis in de serie; vortex en snel centrifuge de PCR-strip. </li><li> Herhaal stap 1.6 tot de laatste buis in de verdunningsreeks is de norm ontvangen. </li><li> Herhaal de stappen 1,3-1,7 voor elke standaard. </li></ol> Zie onderstaande tabel 3 2. Voorbereiding van de primer / probe (Pr / Pb) en No Template Controle (NTC) werken Stock Mixes (figuur 3B) OPMERKING: Elke 1,7 ml Pr / Pb set werkvoorraad en 128,6 ul Geen Template Controle (NTC) werkvoorraad mix zal 30 assayplaten maken. <ol><li> Bereid de Pr / Pb set werkvoorraad mixen. NIETE: Voorbereiding van de Pr / Pb set en NTC werkvoorraad mengt uit de voorraad oplossingen zal 2-3 uur duren. <ol><li> Resuspendeer de primers en probes bij 100 uM met ultra-zuiver water voor de bereiding van de stockoplossingen. </li><li> Bestempelen tot zeventien 2 ml buizen; één voor elk Pr / Pb set opgenomen in de test. </li><li> Ontdooi, vortex, en kort gecentrifugeerd primers (100 uM), probes (100 uM) en ssDNA (10 mg / ml) voorraadoplossingen. </li><li> Voeg 2 pi van ssDNA aan elke buis met 12,5 ui elektronische multichannel pipet. Voeg de juiste voorwaartse primer, reverse primer, en peilen naar elke Pr / Pb set werkvoorraad buis. Zie tabel 1 voor de Pr / Pb sets gerichte humaan IFN-subtypen en tabel 2 voor de rhesus macaque Pr / Pb sets. Voeg water toe om het volume van elk Pr brengen / Pb set werkvoorraad buis tot 200 ul. Opmerking: Het volume van primers, probe en water toe te voegen afhankelijk van de gewenste uiteindelijke concentratie reactie van een Pr / Pbset. </li></ol></li><li> Bereid de NTC werkvoorraad mixen. <ol><li> Label twee 5-tube PCR-strips voor de NTC werkvoorraden mengt. </li><li> Transfer 14,3 pi van elke Pr / Pb ingesteld op het juiste NTC werkvoorraad mix buis. Zie tabel 4 voor de Pr / Pb set combinaties voor NTC putten. Water Aan elk van de NTC werkvoorraad mengt om het uiteindelijke volume op 128,6 pl brengen. </li><li> Vortex, kort centrifuge, en plaats de buizen in het donker op ijs of bij -20 ° C voor langdurige opslag. </li></ol></li></ol> Zie onderstaande tabel 4 <ol start="3"><li> Verdun de Pr / Pb ingesteld werkvoorraden. <ol><li> Na verwijdering van een hoeveelheid van de Pr / Pb sets nodig voor de NTC werkvoorraad mixen, voeg 1,5 ml water om het eindvolume van elk Pr / Pb brengen set werkvoorraad buis 1,7 ml. </li><li> Vortex, kort centrifuge, en plaats de buizen in het donker op ijs of bij -20 ° C voor langere tijd te bewaren. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Bereiding van 384-well testplaten de geautomatiseerde multichannel pipet <ol><li> Bereid een 96-well bronplaat van de Pr / Pb sets en NTC mixen voor aliquoting 384-well testplaten. OPMERKING: Voorbereiding van de bron plaat uit de Pr / Pb werking voorraad mixen zal minder dan 1 uur duren. Elke 96-well bron plaat is genoeg om zes 384-wells assay platen (Figuur 3C) te maken. <ol><li> Vortex en kort centrifugeren de Pr / Pb set werkvoorraden en NTC werkvoorraad mixen. </li><li> Plaats een nieuwe 96-well plaat in een gekoelde 96 putjes koelblok en wijzen de putjes per Pr / Pb set of NTC meng de putjes ontvangen (zie figuur 2). </li><li> Voeg water toe aan de plaat met 96 putjes met 250 ui elektronische multichannel pipet: Pipetteer 66 ul water te laten Pr / Pb goed opgezet (behalve 4 putjes Target 17). Doseer 82,5 ul van water om de 4 Target 17 putten. Doseer 27,5 ul van water om elke NTC mix goed. </li&gt; <li> Voeg de juiste Pr / Pb set werkvoorraad op de aangegeven putjes van de plaat met 96 putjes: Pipetteer 54 ul van de juiste Pr / Pb set werkvoorraad voor de aangegeven Pr / Pb set putjes (behalve 4 putjes Target 17). Doseer 67,5 ul van de Target 17 Pr / Pb ingesteld werkvoorraad naar de aangewezen Target 17 Pr / Pb set putten. Voeg 22,5 ul van de juiste NTC werkvoorraad mix naar de aangewezen putten. </li><li> Sluit de 96-well plaat met een plakplaat afdichting en centrifugeer gedurende 1 min bij 700 xg te zorgen voor de inhoud op de bodem van de putjes. </li><li> Plaats de plaat met 96 putjes in de vortex menger met een 96-well plaat adapter en meng gedurende 1 min bij 1000 rpm. Centrifugeer de 96-well plaat gedurende 5 min bij 700 x g. </li><li> Sla de 96-well bronplaat in het donker bij 4 ° C bij gebruik op dezelfde dag, of anders bij -20 ° C tot gebruik. </li></ol></li><li> Bereid de 384-wells assayplaten door het toevoegen van de Pr / Pb-sets met behulp van de automatische multichannel pipet. OPMERKING: Voorbereiding van zes assayplaten van de 96-well bron plaat zal 3-4 uur duren. <ol><li> Voorafgaand aan het maken van platen, pre-chill de koeling nest tot 4 ° C en pre-Verwarm de plaatverdamper tot 125 ° C en de bodem warmte blok tot 80 ° C met een luchtstroom blaast tussen 20-25 liter per minuut (LPM). </li><li> Schakel de automatische multichannel pipet en open het protocol voor het maken van IFN assayplaten door te dubbelklikken op de software-icoon. </li><li> Voor het opzetten van het platform, plaats een volledig volle pipet tip box aan platform positie 1, de 96-well bron plaat in positie 4, en een nieuwe 384-wells plaat in positie 6. Begin de run door op de afspeelknop. OPMERKING: Na voltooiing van een run, elk goed zal 5 ul van Pr / Pb mix bevatten. OPMERKING: Het eindbedrag van ssDNA- toegevoegd per putje van de 384-wells testplaat is 0,025 ug. </li><li> Tik de 384-well assay plaat op een vlakke ondergrond vocht garanderen onderaan de putten en een lijmplaat afdichting. </li><li> Centrifugeer de plaat gedurende 1 min bij 700 x g. Verwijder de zelfklevende plaat afdichting, plaatst u de 384-wells testplaat in de plaat droger en de positie van de 384-wells spruitstuk direct boven de putten. </li><li> Wanneer de inhoud van het 384-wells assayplaat&#39;s droog is, brengt een nieuwe lijm plaat seal, wikkel in folie, label, en op te slaan in het donker bij 4 ° C tot gebruik. OPMERKING: Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende ten minste 6 maanden. </li><li> Herhaal stap 3.2.3-3.2.6 tot 6 x 384-well assay platen worden vervaardigd of de vloeistof in de 96-well plaat bron is uitgeput. </li><li> Schakel de koeling nest, sluit de software, en schakel de automatische multichannel pipet. Schakel de plaat droger. </li></ol></li></ol> 4. Laden en runnen van een 384-wells bepalingsplaat <ol><li> Bereid twee huishouding gen (HKG) goed mixen, die bestaan ​​uit de Pr / Pb set voor een HKG, ssDNA, PCR master mix en water, om te worden toegevoegd aan een gedroogde 384-wells testplaat ( <strong&gt; Figuur 3D). OPMERKING: Voorbereiding van het mixen en het laden van de testplaat zal 1-2 uur duren. Het uitvoeren van de test plaat zal minder dan 2 uur duren. <ol><li> Label een 1,5 ml buis voor elke HKG mix. </li><li> Verdun 2 pl ssDNA (10 mg / ml) met 84,9 pl water. Voeg 2 pi van de verdunde ssDNA, 11,8 ul van water, 23 ul van master mix, en 9,2 ul van de juiste 20x HKG Pr / Pr ingesteld op elke buis, vortex, en kort centrifuge. </li><li> Gebruik glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) en ubiquitine C (UBC) als HKG voor de humane assay (zie Materialen tabel). Gebruik GAPDH en 18S ribosomaal RNA als HKG voor de rhesus assay. OPMERKING: De HKG gebruikt om de test uit te voeren zijn flexibel en moet de genen die voor het type cel weerspiegelen wordt getest GAPDH-, UBC, en 18S zijn voorbeelden van veelgebruikte HKG;. andere HKG wellicht meer geschikt. </li></ol></li><li> Bereid het monster en positive controlewell mengsels, die bestaan ​​uit het monster of positieve controle cDNA master mix en water, worden toegevoegd aan een droge 384-well assay plaat. Bereid de steekproef en de positieve controle mixen in voldoende hoeveelheid af te zien tot en met 21 putjes (Figuur 3D). <ol><li> Voorafgaand aan cDNA-synthese, de instructies van de fabrikant om de RNA-monsters te bereiden met een DNase digestiestap. </li><li> Bereid de monsters en de controle vooraf van de cDNA synthese van ten minste 500 ng RNA, gevolgd door behandeling met RNase H (eindvolume van 24 ul per monster) volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar de bereide cDNA bij -20 ° C tot gebruik. Dooi, vortex, en kort centrifugeren het monster cDNA. </li><li> Voeg 78,8 ul van master mix en 54,8 ul van water aan elkaar op 24 ul monster en positieve controle buis. </li><li> Vortex en kort centrifugeren de buizen. </li></ol></li><li> Bereid de normen en NTC goed mengt, consteld uit master mix en water, om te worden toegevoegd aan een gedroogde 384-wells testplaat (Figuur 3D). Voor de normen meng goed, voeg 165 ul van water tot 275 ul van master mix in een 1,5 ml buis. Voor de NTC meng goed, voeg 52,5 ul van water tot 52,5 pi master mix in een 1,5 ml buis. Vortex en kort centrifugeren de buizen. </li><li> Bereid een gedroogde 384-wells testplaat voor het laden van het mixen en samples. <ol><li> Verwijder een droge 384-well assay plaat bij 4 ° C en centrifugeer gedurende 1 min bij 700 x g. </li><li> Leg de plaat op een gekoelde 384-wells koelblok, verwijder de lijm plaat afdichting en een overzicht van de putjes van de plaat aan te wijzen waar de verschillende mixen en monsters worden gepipetteerd (figuur 1). </li></ol></li><li> Laad de 384-wells assay plaat met standaard goed mix, normen, NTC meng goed, monsters, positieve controle, en HKG mix (figuur 3E). Vortex en kort centrifuge alle oplossingen voor het afgeven aan de plaat. <ol><li> Doseer 6 pl van de normen meng goed aan elke standaard goed met de 30-ul elektronische meerkanaalspipet. Doseer 1,5 ul van de juiste standaard seriële verdunning om goed de aangewezen met de 12,5 ul elektronische meerkanaalspipet. </li><li> Doseer 7,5 ul van NTC meng goed aan elke NTC goed met de 30-ul elektronische meerkanaalspipet. Verdeel 7.5 ul van het monster op de aangegeven putjes met 30 pl elektronische multichannel pipet. Doseer 2,5 ul van de HKG Pr / Pb mengt met de aangegeven putjes met de 12,5 ul elektronische meerkanaalspipet. </li><li> Vul alle lege putten met 7,5 ul van het overgebleven water en master mix mengsel met de 30-ul elektronische meerkanaalspipet; 7,5 ul van water alleen zal ook werken. </li><li> Sluit de 384-well assay plaat met de optische kleeffolie en centrifugeer gedurende 1 min bij 700 x g. Vortex de afgedichte 384-wells plaat in de vortex mixer gedurende 2 min bij 2600 rpmen centrifugeer 5 min bij 700 x g. </li><li> Plaats de verzegelde 384-wells assay plaat in de qRT-PCR-apparaat, opent u de sjabloon voor de test layout en beginnen met de run. OPMERKING: De resultaten kunnen worden geëxporteerd als een spreadsheet of als een tekstbestand voor analyse. </li><li> Gebruik de volgende optimale thermische cycler reactieomstandigheden voor de bepaling: i) 50 ° C gedurende 2 min, ii) 95 ° C gedurende 10 minuten, iii) 95 ° C gedurende 25 s, iv) 59 ° C gedurende 1 min. Herhaal stap iii en iv gedurende 40 cycli. </li><li> De ruwe data van de qRT-PCR-platform te exporteren naar een spreadsheet-applicatie software. Plot elke 4 punts standaard ingesteld als een standaard bocht naar lineariteit te observeren. Uit te voeren analyse door het berekenen van de ΔCq of door het aantal kopieën op basis van de vier punt standaardcurven 27. </li></ol></li></ol> Zie figuur 3 hieronder

<ol><li>Yan, N., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+antiviral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intrinsic antiviral immunity.</a> Nature. 13, 214-222 (2012).</li>
<li>Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferons%2C+interferon-like+cytokines%2C+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors.</a> Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).</li>
<li>Baum, A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+type+I+interferon+by+RNA+viruses%3A+cellular+receptors+and+their+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates.</a> Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).</li>
<li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-lambdas+mediate+antiviral+protection+through+a+distinct+class+II+cytokine+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.</a> Nature. 4, 69-77 (2003).</li>
<li>Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+type+I+interferon+locus+and+identification+of+novel+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes.</a> Genomics. 84, 331-345 (2004).</li>
<li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNbeta-dependent+increases+in+STAT1%2C+STAT2%2C+and+IRF9+mediate+resistance+to+viruses+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage.</a> The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).</li>
<li>Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-stimulated+genes%3A+a+complex+web+of+host+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses.</a> Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).</li>
<li>Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+the+nuclear+factor-kappaB+pathway+and+the+innate+immune+response+by+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses.</a> Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).</li>
<li>Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vaccinia+virus+soluble+alpha%2Fbeta+interferon+%28IFN%29+receptor+binds+to+the+cell+surface+and+protects+cells+from+the+antiviral+effects+of+IFN%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN.</a> Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+type+I+and+type+III+interferons+by+a+secreted+glycoprotein+from+Yaba-like+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).</li>
<li>Bidwell, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Irf7+pathways+in+breast+cancer+cells+promotes+bone+metastasis+through+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape.</a> Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).</li>
<li>Di Domizio, J., Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+autoimmunity%3A+type+I+interferon+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases.</a> Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).</li>
<li>Crow, Y. J., Casanova, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STING-Associated+Vasculopathy+with+Onset+in+Infancy+-+A+New+Interferonopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy.</a> The New England journal of medicine. , (2014).</li>
<li>Bermel, R. A., Rudick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-beta+treatment+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics+%3A+the+journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutics%22%5BJournal%5D)">Interferon-beta treatment for multiple sclerosis.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).</li>
<li>Kingham, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+HBsAg-positive+chronic+active+hepatitis+with+human+fibroblast+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon.</a> Gut. 19, 91-94 (1978).</li>
<li>Heathcote, J., Main, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+viral+hepatitis%22%5BJournal%5D)">Treatment of hepatitis C.</a> Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).</li>
<li>Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-lambda+and+therapy+for+chronic+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection.</a> Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).</li>
<li>Castaigne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+alpha+in+the+treatment+of+hairy+cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia.</a> Cancer. 57, 1681-1684 (1986).</li>
<li>Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+interferon-alpha+in+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Association+of+Physicians+of+India%22%5BJournal%5D)">Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia.</a> The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).</li>
<li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+alpha+on+NZM2328.Lc1R27%3A+Enhancing+autoimmunity+and+immune+complex-mediated+glomerulonephritis+without+end+stage+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+immunology+%28Orlando%2C+Fla.%29%22%5BJournal%5D)">Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure.</a> Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).</li>
<li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-alpha+Acts+on+the+S%2FG2%2FM+Phases+to+Induce+Apoptosis+in+the+G1+Phase+of+an+IFNAR2-Expressing+Hepatocellular+Carcinoma+Cell+Line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line.</a> The Journal of biological chemistry. , (2014).</li>
<li>Xia, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+IFN-alpha-Producing+Plasmacytoid+Dendritic+Cells+%28pDCs%29+in+Human+Th1-Mediated+Type+1+Diabetes%3A+pDCs+Augment+Th1+Responses+through+IFN-alpha+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production.</a> Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).</li>
<li>Hervas-Stubbs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+but+not+plasmacytoid+dendritic+cells+foster+the+systemic+virus-induced+type+I+IFN+response+needed+for+efficient+CD8+T+cell+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming.</a> Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).</li>
<li>Manry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+genetic+dissection+of+human+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Evolutionary genetic dissection of human interferons.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).</li>
<li>Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+relatedness+among+the+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+interferon+%26+cytokine+research+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Diversity and relatedness among the type I interferons.</a> Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).</li>
<li>Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+genomic+data+in+the+discovery%2C+annotation+and+evolutionary+interpretation+of+the+interferon-lambda+family%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family.</a> PloS one. 4, e4933(2009).</li>
<li>Hillyer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiles+of+human+interferon-alpha+and+interferon-lambda+subtypes+are+ligand-+and+cell-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent.</a> Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).</li>
<li>Schramm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+array+for+absolute+and+relative+quantification+of+rhesus+macaque+types+I%2C+II%2C+and+III+interferon+and+their+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+interferon+%26+cytokine+research+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes.</a> Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).</li>
<li>Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons+of+xeno-nucleic+acid+for+detecting+nucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid.</a> Theranostics. 3, 395-408 (2013).</li>
<li>Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLittle%2C+S+%22Current+protocols+in+human+genetics+%2F+editorial+board%2C+Jonathan+L.+Haines+...+%5Bet+al.%5D%22">Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]</a>. 9 (Unit 9 8), (2001).</li>
</ol>

VPM en RLR zijn co-uitvinders van de technologie om de expressie van IFN- en IFN- subtypes te meten en halen daarvan royalty-inkomsten. De overige auteurs verklaren geen belangenconflict te hebben.

Dit rapport beschrijft het ontwerp, batch-productie, en benadering van de analyse van een test om de transcriptie van een reeks van zeer gelijkaardige genen in een onderzoekslaboratorium instelling te meten. De high-throughput qRT-PCR-test hier gemeld meet de IFN en - λ subtypes met een hoge specificiteit. Deze methode omvat twee belangrijke aspecten, het ontwerp van Pr / Pb sets die onderscheid maken tussen leden van een homoloog gen-familie en de ontwikkeling van een productie-platform voor de ontwikkeling van betrouwbare en consistente 384-wells assayplaten voorgeladen met de Pr / Pb sets. De qRT-PCR-sondes zijn voorzien van een structurele (MB) of chemische (LNA) benadering van het verbeteren van hun specificiteit 29. Voor twee van de primer sets in de rhesus assay (tabel 2), de amplificatie-refractaire mutatiesysteem (ARMS) werd opgenomen in de primer sequenties verder te verbeteren specificiteit 30. Hoewel het algemeen het beste om exon-exon overgangen naar ENHA richtennce specificiteit van een qRT-PCR-reactie, was dit niet mogelijk omdat de type I IFN genen ontbreken intronen. Daarom zal genomisch DNA worden geamplificeerd in de PCR reactie en worden afgebroken door DNase behandeling na RNA-extractie. Het doelgebied van de Pr / Pb sets beperkt tot de coderende gebieden van de mature peptide voor elke IFN. Vanwege de hoge sequentieovereenkomst tussen de IFN-α subtypen, met name het rijpe peptide regio, was het soms noodzakelijk compromis gevoeligheid specificiteit te garanderen. Dit is vooral het geval bij IFN-α17, waarbij het rijpe peptide transcript vier unieke basen vergeleken met de andere IFN-α subtypen. Targeting IFN-α17 vereist primers die de transcripten van verschillende subtypes te binden, beperken specificiteit van de sonde. Bijgevolg zal de PCR reactie andere subtypen amplificeren dan IFN-α17, waardoor nuttigen van een aanzienlijk percentage van de PCR reagentia en lowering van de amplitude van het fluorescentiesignaal van de specifieke probe voor IFN-α17. Een extra uitdaging richting ontwerpen gevoelige en specifieke Pr / Pb sets voor zeer vergelijkbare genen zoals de IFN is de mogelijkheid dat de geannoteerde sequenties in de GenBank databank niet volledig of volledig te zijn op het moment van ontwerp. Nogmaals, dit was een uitdaging voor IFN-α17, waarbij nieuw geannoteerde sequenties niet perfect uitgelijnd met de versie van de sequentie in de databank op het moment van het ontwerp. Daarom is bij het ontwerpen van Pr / Pb sets voor genen die niet intensief bestudeerd, is het verstandig om regelmatig te controleren of de nieuwste geannoteerde sequentie van een target-gen. Tenslotte is het noodzakelijk dat de Pr / Pb sets niet pseudogenen die kunnen worden overgeschreven, maar niet vertaalde amplificeren. Na het ontwerpen van de Pr / Pb sets, is de volgende uitdaging het optimaliseren van de PCR-condities van zeventien verschillende Pr / Pb zet op een 384-wells plaat. Transcript normen zijn belang-tant in het testen van de specificiteit van een Pr / Pb-toestel en van essentieel belang voor de harmonisatie van de qRT-PCR-condities van de vele verschillende PCR-reacties worden. Testen van een Pr / Pb set tegen de transcript normen vaststelt zijn efficiëntie en gevoeligheid; plasmiden die zeer soortgelijk pseudogenen expressie nodig zijn opdat de Pr / Pb set meet selectieve transcriptie van het functioneel gen. Het transcript normen bieden een kwantitatieve middel van analyse (aantal transcripten), naast de semi-kwantitatieve analyse ten opzichte van een huishoudgen (ΔCq). Robotic meerkanaals pipetteren van een 96-well bronplaat in meerdere 384-well testplaten verbetert de nauwkeurigheid en consistentie van inter-plate resultaten. Zalmsperma DNA (ssDNA) wordt gebruikt als een drager die stabiliseert en behoudt de Pr / Pb sets voor langdurige opslag, evenals drogen reagentia afgegeven in de platen. Het drogen van de platen vermindert ook het volume van het reactiemengselnoodzakelijk reproduceerbare resultaten, waardoor bewaart kostbare monsters en vermindert het gebruik van dure reagentia. Door middel van deze stappen, worden batches van platen gemonteerd die precisie en consistentie bieden voor meer dan zes maanden. Volgende plaat voorbereiding, kwaliteitscontrole maatregelen zijn cruciaal voor de consistentie van een partij van platen controleren. Hiertoe worden vier extra sets normen uitgevoerd op een plaat. De &quot;5x standaard&quot; plaat volgt de prestaties en zorgt voor een dataset aan welke normen een individuele plaat&#39;s worden vergeleken. Terwijl tien 10-voudige verdunningen van elk standaard worden gebruikt tijdens testontwerp, ruimte overwegingen dient vier punten worden gebruikt voor de standaardcurve op elke testplaat en de 5x standaardplaat. Daarnaast moet een positieve controle worden opgenomen op elke plaat om de geldigheid van de plaat waarborgen. Gewoonlijk duurt 3-4 uur met zes testplaten bereiden van een Pr / Pb source plaat; Het is mogelijk om twaalf petrischaal in één dag in een onderzoekslaboratorium. Aangezien elke menselijke IFN subtype testplaat onderzoekt zeventien Pr / Pb sets en geschikt vijftien proefmonsters, een dag van verzameling geeft een partij van platen met de capaciteit om te genereren tot 3060 experimentele gegevenspunten. Ruwe gegevens van de qRT-PCR platform kan worden verwerkt geassembleerd uit programmering scripts in een spreadsheet software een voorgedefinieerde analyse sjabloon automatisch vullen. Deze methode minimaliseert hands-on data entry, waardoor het voorkomen van het kopiëren fouten en stelt de onderzoeker zich richten op data-analyse plaats van gegevens montage. Zoals hier beschreven, kan deze high-throughput qRT-PCR worden toegepast om de expressie van interferon subtypes menselijke of rhesus macaque monsters gemeten en kan worden aangepast voor andere soorten of homologe genen sets. De flexibiliteit van de plaatindeling kan de gebruiker veranderen primer / probe sets voor de genen van maatbelang naar een bepaald celtype of modelsysteem. Deze test kan worden toegepast IFN expressie signaturen meten celcultuurmodellen studeren pathogenen of patiëntmonsters in het kader van ziektemodellen de signalering mechanismen van immuunrespons helderen.

Type I en III interferonen (IFN) zijn cruciaal in de immuunrespons tegen virussen en andere pathogene stimuli en in alle vertebraten 1. Immuun en niet-immuun cellen tot expressie en scheiden, en reageren op IFN 2. Aangeboren immuunsysteem sensoren, zoals toll-like receptoren (TLR), Sting, en RIG-I, induceren type I en III IFN expressie bij detectie van pathogenen geassocieerde moleculaire patronen (PAMP) 3,4. Bij mensen type I IFN omvatten IFN-β, -ω, -κ en 12 subtypen van IFN-α, en binden aan het IFNAR1 / IFNAR2 receptorcomplex 2,5. Type III IFN onder IFN-λ1, -λ2 en -λ3 en binden aan de IL10RB / IL28RA receptor complex 2. Klassiek, typen I en III IFN binden aan hun respectievelijke receptor complexen die vervolgens rekruteren STAT1 / STAT2 heterodimeren en initiëren transcriptie van interferon gestimuleerde genen (ISG) 6. ISG zijn betrokken bij een breed scala aan functies, van antivirale en antiproliferatieve activiteit activatie van de adaptieve immuunrespons 7. De talrijke mechanismen pathogenen zijn geëvolueerd te ontwijken, ondermijnen en kapen elementen van het IFN signaalweg tonen het belang van IFN in de aangeboren immuunrespons 8. Bijvoorbeeld vacciniavirus drukt een lokreceptor met IFNAR1 homologie dat sequesters type I IFN 9 terwijl een Yaba-achtig virus van de ziekte scheidt een glycoproteïne dat remt type I en III IFN eiwitten 10. Naast hun rol bij de afweer worden IFN ook betrokken bij kanker surveillance en een aantal auto-inflammatoire aandoeningen: silencing van IFN expressie in borstkankercellen beperkt immunosurveillance 11, overproductie van IFN-α is een mechanisme in de ontwikkeling van systemische lupus erythematosus 12, en dolende activering van STING leidt tot systemische ontsteking veroorzaakt door overmatige hoeveelheden IFN in-STING geassocieerd vasculopathy13. Therapeutisch IFN gebruikt om multiple sclerose te behandelen 14, chronische virale infecties zoals HBV en HCV 15 16,17 en kankers zoals hairy cell leukemie en 18 chronische myelogene leukemie 19. Vragen over de relevantie van IFN in een bepaald fysiologisch proces continu onthullen de alomtegenwoordige karakter van dit cytokine familie. Type I IFN, vooral IFN-α subtypen, worden vaak beschouwd als één entiteit 20-23, in plaats van als een groep nauw verwante maar onderscheiden eiwitten. Het bestaan ​​en de persistentie van meerdere IFN species waaronder IFN-α subtypen gehele evolutie van vertebraten 24 suggereert dat ten minste een subset van deze subtypen specifieke en unieke functies. Het is mogelijk dat het definiëren van patronen IFN expressie ontcijferen helpen karakteriseren de specifieke functies van één of meer van de 17 subtypes. De uitdaging van het bestuderen van de tHij type I en III IFN subtypen gebaseerd op hun gemeenschappelijke sequentie identiteit: de twaalf IFN-α subtypen delen&gt; 50% 25 en IFN-λ subtypen delen 81-96% 26 van hun aminozuursequenties. In de beschreven qRT-PCR assay moleculaire beacon (MB) en vergrendeld nucleïnezuur (LNA) fluorescente probes onderscheid enkel basepaar verschillen tussen de zeer vergelijkbare IFN subtype sequenties en zorgen voor de karakterisering van de handtekening IFN expressie. 384-wells plaat formaat van de test omvat zowel kwantitatieve (transcript normen) en semi-kwantitatieve (het huishouden genen (HKG)) maatregelen, waardoor voor analyse door respectievelijk transcript aantal kopieën en ΔCq. Batch assemblage, gefaciliteerd door geautomatiseerde meerkanaals pipetteren, en lange termijn opslag, mogelijk door het drogen van de primer / probe (Pr / Pb) stelt op de platen, verbetering van de reproduceerbaarheid, het nut en de uitvoerbaarheid van de test. Dit protocol beschrijft het procesvoorbereidende 384 putjes qRT-PCR assay platen (figuur 1) met tot zeventien verschillende Pr / Pb sets gericht humaan IFN subtypen (Tabel 1). Pr / Pb set werkvoorraad bronplaten (figuur 2) worden gebruikt om meerdere 384-well testplaten bereid in een proces dat kan worden geautomatiseerd met behulp van een robot multichannel pipet. Terwijl de initiële focus lag op het creëren van een protocol voor het bestuderen van de menselijke IFN expressie handtekening, is deze methode toegepast op resusmakaken ook. Hoewel de plaat indelingen zijn iets anders en Pr / Pb sets (tabel 2) gescheiden zijn, de algemene werkwijze voorbereiding voor het creëren van menselijke en rhesus platen identiek. Met minimale aanpassingen van het protocol, kan de werkwijze worden uitgevoerd om de ontwikkeling van assays voor andere groepen van nauw verwante genen te bestuderen. Zie Figuren 1 en 2 hieronder Zie de tabellen 1 en 2 Belau

<table><tbody><tr><td>0.2 ml PCR Tube Strips&nbsp;</td><td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td><td>E0030 124 286</td><td></td></tr><tr><td>12-kanaals 384 Equalizer elektronische pipet, 0,5-12,5 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-139</td><td>*Discontinued</td></tr><tr><td>12-kanaals 384 Equalizer elektronische pipet, 1-30 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-137</td><td>*Discontinued</td></tr><tr><td>12-kanaals elektronische pipet, 5-250 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-118</td><td>*Discontinued</td></tr><tr><td>2.0 ml Micro Centrifuge buis, sterieel</td><td>Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>8-kanaals elektronische pipet, 15-1250 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-115</td><td>*Discontinued</td></tr><tr><td>Vloeibare reagent reservoirs&nbsp;</td><td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td><td>89094-668</td><td>25mL reservoirs met 2 verdelers</td></tr><tr><td>E-Centrifuge</td><td>Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)</td><td>1090003</td><td></td></tr><tr><td>Eukaryotisch 18S rRNA (18S)</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>Hs99999901_s1</td><td>Rhesus HKG Primer/probe set</td></tr><tr><td>Fixed Speed Mini Vortexer</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>02-215-360</td><td></td></tr><tr><td>Gas doorlatende kleefplatenseal</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>AB-0580</td><td>Weggeef platenseal gebruikt tijdens het platen voorbereidingsproces&nbsp;</td></tr><tr><td>Glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH)</td><td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td><td>Custom Order</td><td>Human HKG Primer/probe set</td></tr><tr><td>Glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH)</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>Rh02621745_g1</td><td>Rhesus HKG Primer/probe set</td></tr><tr><td>Hudson Solo geautomatiseerde multikanaals pipettor&nbsp;</td><td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td><td>800200</td><td>Gemodificeerd met een 384-well koelnest</td></tr><tr><td>Lineaire plasmiden (IFN genen)</td><td>Aldevron (Fargo, ND, USA)</td><td>Custom Order</td><td>Item 3000, 3580; gebruikt voor assay standaarden&nbsp;</td></tr><tr><td>LNA remmers</td><td>Exiqon (Woburn, MA, USA)</td><td>Custom Order</td><td>Item 500100</td></tr><tr><td>LNA Probes</td><td>Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)</td><td>Custom Order</td><td>Materiaalnummer VC00023</td></tr><tr><td>Matrix Gefilterde Pipet Tips, 12,5 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-193</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Gefilterde Pipet Tips, 30 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-196</td><td></td></tr><tr><td>Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1.250 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-160</td><td></td></tr><tr><td>Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-152</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 384-Well Reactie Plaat met Strijkcode</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well Reactie Plaat</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>4311971</td><td>Adhesive film gebruikt voor het verzegelen van de plaat voor de qRT-PCR run&nbsp;</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2010 Spreadsheet</td><td>Microsoft (Redmond, WA, USA)&nbsp;</td><td>Office 2010</td><td>Visual Basic programmeertaal&nbsp;</td></tr><tr><td>MixMate Vortex Mixer</td><td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td><td>5353 000.014</td><td>2 dimensionale plaat vortex apparaat</td></tr><tr><td>Molecular Beacon Probes</td><td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td><td>Custom Order</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cooler, ijsvrije koude opslag systeem voor 96 well platen en PCR buizen</td><td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Plate Dryer (manifold)</td><td>Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)</td><td>Custom Order</td><td></td></tr><tr><td>Primer sets</td><td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td><td>Custom Order</td><td></td></tr><tr><td>pUC57 plasmid DNA</td><td>Genescript (Piscataway, NJ, USA)</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-vrije 1.5 ml Microfuge Tubes</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNase-vrije DNase Set (50)</td><td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)</td><td>M0297L</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Robot Tips (heldere tip voorgesteriliseerde pipet tips)</td><td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td><td>800350-S</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA Solution</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>SoftLinx Version V</td><td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td><td>Custom Order</td><td>Software voor het programmeren van pipetteringsstappen</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), geen AmpErase UNG</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>ABgene Adhesive Plate Seals&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>AB0580</td><td></td></tr><tr><td>Ubiquitin C (UBC)</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>Hs01871556_s1</td><td>Human HKG Primer/probe set</td></tr><tr><td>Verso cDNA synthese Kit</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>AB1453B</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR Systeem</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>Water-Ultra Puur</td><td>Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)</td><td>351-029-101</td><td></td></tr><tr><td>Zipvap 384 (plate dryer verwarmingselement)</td><td>Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)</td><td>384-109A</td><td>Plate Dryer</td></tr></tbody></table>

high-throughput kwantitatieve real-time rt-pcr assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen i en iii interferon subtypen

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Beschreven in dit rapport is een qRT-PCR-test voor de analyse van zeventien menselijke IFN-subtypes in een 384-well plate-formaat dat zeer specifieke locked nucleic acid (LNA) en molecular beacon (MB) probes, transcriptstandaarden, geautomatiseerd multichannel pipetten en platendrogering omvat. Het bepalen van de expressie onder de type I interferonen (IFN), met name de twaalf IFN-α-subtypes, wordt beperkt door hun gedeelde sequentie-identiteit; evenzo zijn de sequenties van de type III IFN, met name IFN-λ2 en -λ3, zeer vergelijkbaar. Deze test biedt een betrouwbare, reproduceerbare en relatief goedkope manier om de expressie van de zeventien interferon-subtype transcripten te analyseren.

De qRT-PCR assay beschreven kan worden toegepast om expressiepatronen van type I en III IFN analyseren verschillende celtypes en contexten. Bijvoorbeeld, humaan type I en III IFN expressie handtekeningen geanalyseerd perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) van 6 donors gestimuleerd met TLR liganden; poly I: C (25 ug / ml), LPS (10 ng / ml), imiquimod (10 uM) en CpG oligonucleotiden (1 uM) (figuur 4). De gegevens werden geanalyseerd met behulp van een spreadsheet-applicatie software en gepresenteerd als radar grafieken met de IFN-α-subtypen geregeld met de klok mee volgens de fylogenetische boom van hun proteïnesequentie 27. De radar grafieken van de menselijke IFN expressie worden gepresenteerd in een log-schaal berekend met behulp van de twee verschillende analysemethoden opgenomen in de test ontwerp: absolute Cq waarde genormaliseerd naar HKG (ΔCq), en kopieer aantal template per microgram (ug) van totaal RNA . Kopieer aantal waarden worden berekend op basis van de resultaten o<html> fa transcript&#39;s standaard curve. De gegevens tonen dat menselijke IFN expressie signaturen opgewekt door TLR-agonisten ligand specifiek. Zie figuur 4 onder Zoals aangetoond voor het menselijk IFN expressie handtekeningen, expressie handtekeningen van type I en III IFN in rhesus makaken waren ook TLR-ligand specifiek. PBMC van 3 donoren gestimuleerd met poly I: C (50 ug / ml), LPS (10 pg / ml), en imiquimod (10 ug / ml) gedurende 3 uur (Figuur 5). IFN subtype expressie in gestimuleerde cellen in de uitgangssituatie was laag. Een beperkt aantal IFN-subtypen werden uitgedrukt als reactie op LPS en poly I: C. Daarentegen IFN expressie in reactie op imiquimod was hoog en het subtype expressie breed. Expressie van IFN-β en IFN-λ1 was door alle drie TLR-agonisten 28. Zie figuur 5 hieronder altijd &quot;&gt; <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig1.jpg" /> Figuur 1:. De lay-out voor een 384-wells assay plaat met zeventien Pr / Pb sets Target nummer verwijst naar een Pr / Pb set. De vierpunts standaard curves (donkergrijs driehoek) toegevoegd aan de kolommen 1-5. De HKG Pr / Pb sets (witte achtergrond) toegevoegd aan de kolommen 6 en 7. De overige kolommen, 8-24, zijn specifiek voor één van de zeventien Pr / Pb sets. Monsters worden toegevoegd aan rijen AP, van kolommen 6-24 (zwarte pijlen). De twee putten (O5, P5) op de bodem van kolom 5 ontvangen alleen water en master mix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig2.jpg" /> Figuur 2:. De lay-out voor een 96-wells plaat met zeventien bron Pr / Pb sets Target nummer verwijst naar een Pr / Pbset. Zwarte pijlen geven wanneer een Pr / Pb set wordt toegevoegd om meerdere putten. NTC mengsels worden toegevoegd aan de aangeduide putjes (donkergrijze achtergrond). De twee putten (F3, G3) met diagonale lijnen ongebruikt zijn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig3.jpg" /> Figuur 3: Schematische voorstelling van de specifieke stappen in de qRT-PCR-test protocol AE diagram selecteert delen van het protocol.. (A) Stap 1: Bereiding van standaard seriële verdunningen. (B) Stap 2: Voorbereiding van de Pr / Pb en NTC werkvoorraad mixen. (C) Stap 3.1: Bereiding van een 96-wells plaat werkvoorraden van de Pr / Pb sets en NTC mixen. (D) Stap 4,1-3: Voorbereiding van de mengsels voor het laden van de 384-wells assay plaat. (Estep 4.5: Het laden van de 384-wells assay plaat. Diagrammen worden gelezen van de linksboven naar rechtsonder. Reagentia voor de interferon (IFN) assay worden bewaard bij -20 ° C en in de linker kolom; lijnen afzonderlijke acties in het protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig4.jpg" /> Figuur 4: De menselijke IFN expressie signatuur in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) verschilt in reactie op de TLR liganden voor stimulatie PBMC werden gestimuleerd met TLR-liganden en RNA werd geoogst voor qRT-PCR analyse.. De geometrische gemiddelden van de piek reacties op poly I: C (25 ug / ml) 8 uur (rode vierkanten), LPS (10 ng / ml) 4 uur (groen driehoeken), imiquimod (10 uM) en 16 uur ( paarse diamanten), CpG (1 uM) bij16 u (zwarte cirkels) en ongestimuleerde controle 16 uur (blauwe cirkels) van 6 donors wordt in log10 schaal als functie van de expressie van het HKG UBC ΔCq (links) of kopieaantal per ug RNA (rechts) . IFN-α subtypen zijn gerangschikt volgens de fylogenetische plot van aminozuursequentiegelijkheid. Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in de immunologie en celbiologie 27. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig5.jpg" /> Figuur 5:. De rhesus macaque IFN expressie signatuur in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) verschilt in reactie op de TLR liganden voor stimulatie PBMC van drie rhesus makaken (door het kwadraat, diamant en driehoek aangeduid) werden geïsoleerd uit volbloed en gestimuleerd met lipopolysaccharide (LPS) (10 ug / ml), poly I: C (50 ug / ml) of imiquimod (10 ug / ml). Cellen werden geoogst op 0 uur (open vormen) of na 3 uur van TLR stimulatie (gesloten vormen) voor het meten van IFN expressie. Transcriptniveaus van type I, II en III IFN worden in log10 schaal als functie van de expressie van het GAPDH HKG ΔCq (links) of kopieaantal / ug RNA (rechts). Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Interferon en cytokine Research 28. <img alt="Tabel 1" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" width="700" /> Tabel 1:. Human IFN primer / probe set sequenties en reactie informatie <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze tabel bekijken.</a> <img alt="Tabel 2" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" width="700" /> Tabel 2:. Resusaap IFN primer / probe set sequenties en reactie informatie <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze tabel bekijken.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Plasmide concentraties (fM) </td></tr><tr><td></td><td> Een </td><td> B </td><td> C </td><td> D </td></tr><tr><td> IFN-α1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α4 </td><td> 2500 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> IFN-α5 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α6 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td>0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α7 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α8 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α10 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α14 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α16 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α17 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α21 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ3 </td><td>250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-β </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-ω </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> Tabel 3: Standaard verdunning set concentratie informatie. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> IFN Pr / Pb Sets toegevoegd </td><td> Volume water toegevoegd (ml) </td></tr><tr><td> NTC 1 </td><td> IFN-β, -ω, -λ3 </td><td> 85,7 </td></tr><tr><td> NTC 2 </td><td> IFN-α1, -α5 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 3 </td><td> IFN-α2 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 4 </td><td> IFN-α4 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 5 </td><td> IFN-α7 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td>NTC 6 </td><td> IFN-α6, -α8, -α10 </td><td> 85,7 </td></tr><tr><td> NTC 7 </td><td> IFN-α14, -α16 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 8 </td><td> IFN-α17 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 9 </td><td> IFN-α21, -λ1 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 10 </td><td> IFN-λ2 </td><td> 114.3 </td></tr></tbody></table> Tabel 4: NTC werkvoorraad mengt informatie.

Dit protocol beschrijft een qRT-PCR-assay met hoge doorvoer voor de analyse van type I en III IFN-expressiesignaturen. De assay onderscheidt verschillen van enkele basenparen tussen de zeer vergelijkbare transcripten van deze genen. Door batchassemblage en robotisch pipetteren zijn de assays consistent en reproduceerbaar.

High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Het algemene doel van deze procedure is het voorbereiden en uitvoeren van assayplaten met 384 wells voor high-throughput analyse van een sterk homologe groep genen, zoals de interferon-subtypes type één en drie. Dit wordt bereikt door eerst de standaard seriële verdunningsreeks voor te bereiden die wordt gebruikt bij het uitvoeren van de assayplaten. Vervolgens worden de werkvoorraadmixen van de primer-probe en de no-template control voorbereid die worden gebruikt voor het maken van de platen.Vervolgens worden de 384-wells assayplaten voorbereid met behulp van een geautomatiseerde multikanalenpipet en worden ze gedroogd voor opslag. Ten slotte worden de 384-wells assayplaten uitgelezen en geanalyseerd. Uiteindelijk wordt de high-throughput kwantitatieve real-time RT-PCR assay gebruikt om interferon-expressiesignaturen te definiëren in weefselkweekmodellen, bij het bestuderen van pathogenen of in klinische monsters in de context van infectieziekten of autoinflammatoire aandoeningen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals kwantitatieve RT-PCR, met gebruik van standaard lineaire probes of SYBR Green, is dat molecular beacon- en lock nucleic acid-fluorescentieprobes kunnen worden gebruikt om single base pair-verschillen tussen zeer vergelijkbare sequenties te onderscheiden. Ontdooi, vortex en centrifugeer kortstondig een standaard en zalmsperma- of SS-DNA. Bereid het SS-DNA-watermengsel voor de 17 standaardverdunningsreeksen door 51 µL SS-DNA te mengen met 20,3 mL water. Verdeel 190 µL van het SS-DNA-watermengsel over de eerste buis van een PCR-strip met acht buizen en 180 µL over de volgende vijf buizen.Voer een 1:20 verdunning uit door 10 µL van de 50 pM standaardvoorraad over te brengen naar de buis met 190 µL S-S-D-N-A watermix; vortex en centrifugeer kort. Voer in de PCR-strip een 1:10 verdunning uit door 20 µL van de meest recent verdunde buis over te brengen naar de volgende buis in de reeks; vortex en centrifugeer de PCR-strip kort. Herhaal de 1:10 verdunning totdat de laatste buis in de reeks de standaard heeft ontvangen.Nadat u maximaal 17 buisjes van twee milliliter heeft gelabeld, gebruikt u een elektronische multichannelpipet van 12,5 microliter om twee microliter S-S-D-N-A aan elk buisje toe te voegen, met primers en probes die zijn klaargemaakt volgens het tekstprotocol. Voeg de juiste forwardprimer, reverseprimer en probe toe aan elk primer- en probe-set working stock-buisje om de mengsels voor de no template control (NTC) working stock voor te bereiden.Breng 14,3 µL van elke primer-soneset over naar de overeenkomstige NTC-werkvoorraadmixbuis volgens deze tabel. Nadat de benodigde hoeveelheid primer-sonesets voor de NTC-werkvoorraadmixen is verwijderd, wordt 1,5 mL water toegevoegd om het eindvolume van elke werkvoorraadbuis met primer-sonesets op 1,7 mL te brengen. Bereid vervolgens een 96-wells bronplaat van de primer-sonesets en NTC-mixen.Plaats een nieuwe 96-wells plaat in een gekoeld 96-wells koelblok en wijs de wells toe aan de juiste primer-sonde-set of NTC-mix met behulp van een elektronische multikanalspipet van 250 µL. Voeg 66 µL water toe aan elke primer-sonde-set. Doseer per well 82,5 µL water in de vier doel-17 wells.Dispenseer 27,5 µL water in elke anti-C-mix. Voeg vervolgens 54 µL van de juiste primer-probes in werkvoorraad toe aan de daarvoor bestemde wells voor primer-probes. Dispenseer 67,5 µL van de target 17 primer-probe werkvoorraad in de daarvoor bestemde wells voor target 17 primer-probes.Voeg 22,5 µL van de juiste NTC-werkvoorraadmix toe aan de aangewezen wells. Gebruik vervolgens een klevende plaatafdichting om de 96-well plaat af te sluiten en centrifugeer één minuut bij 700 Gs met de 96-well adapter om te zorgen dat de inhoud zich onderin de wells bevindt. Plaats de plaat in de vortexmixer en meng één minuut bij 1000 RP.Centrifugeer de plaat vervolgens gedurende vijf minuten bij 700 Gs. Om de assay-platen met 384 putjes voor te bereiden, schakelt u de automatische multichannelpipet in en dubbeltikt u op het softwarepictogram om het protocol te openen voor het maken van interferon-assayplaten voor het instellen van het platform. Plaats een volledig gevulde doos met pipetpunten in platformpositie één, de bronplaat met 96 putjes in positie vier en een nieuwe plaat met 384 putjes in positie zes.Start de run door op de afspeelknop te drukken wanneer de run is voltooid. Tik de assayplaat met 384 putjes voorzichtig tegen een plat vlak om te garanderen dat de vloeistoffen zich onderin de putjes bevinden en breng een adhesieve plaatsegel aan nadat de plaat één minuut lang is gecentrifugeerd bij 700 Gs. Verwijder de adhesieve plaatsegel.Plaats de 384-wells assayplaat in de plaatdroger en positioneer het 384-wells manifold direct boven de wells. Zodra de inhoud van de 384-wells assayplaten droog is, brengt u een nieuwe adhesieve plaatafdichting en een rapid foil label aan en bewaart u de plaat donker bij vier graden Celsius tot het moment van laden en uitvoeren van de assayplaat.Bereid twee mengsels voor de housekeeping-gen (HKG) wells door 2 µL S-S-D-N-A te verdunnen in 84,9 µL water. Voeg vervolgens aan elke gelabelde HKG-buis 2 µL van het verdunde SSD NA, 11,8 µL water, 23 µL mastermix en 9,2 µL van de juiste 20 XHKG primer-probe set toe; vortex en centrifugeer kort. Bereid de monsters en de positieve controle cDNA door 78,8 µL mastermix en 54,8 µL water toe te voegen aan elke buis met een monster van 24 µL en aan de buis van de positieve controle. Om de mengsels voor de standaarden en NTC wells voor te bereiden die aan een gedroogde 384-well assayplaat worden toegevoegd, voegt u voor het NTC well-mengsel 165 µL water toe aan 275 µL mastermix in een 1,5 mL buis, en 52,5 µL water aan 52,5 µL mastermix in een 1,5 mL buis.Haal een eerder bereide, gedroogde 384-well assayplaat uit de koelkast (4 °C) en centrifugeer deze één minuut lang bij 700 GS. Dispenseer met de elektronische multikanalpipet van 30 µL 7,5 µL NTC. Meng elke NTC goed in de wells.Dispenseer zes microliter van de standaardmengsels en 1,5 microliter van de standaard in elke standaardput. Dispenseer vervolgens 7,5 microliter van het monster in de aangewezen putten met een elektronische multichannelpipet van 12,5 microliter. Dispenseer 2,5 microliter van de HKG primer-probe-mengsels in de aangewezen putten. Seal de plaat met optische adhesiefolie en centrifugeer deze bij 700 Gs gedurende één minuut. Vortex de verzegelde 384-putsenplaat in de vortexmixer bij 2.600 RPM gedurende twee minuten en centrifugeer vervolgens bij 700 Gs gedurende vijf minuten.Plaats tot slot de afgesloten assayplaat in het Q-R-T-P-C-R-apparaat. Open het sjabloon voor de indeling van de assay en gebruik de volgende reactiecondities. Start de run, exporteer de gegevens en analyseer deze volgens het tekstprotocol zoals weergegeven in deze figuur; expressiesignaturen van interferonen type I en III van menselijke oorsprong werden geanalyseerd in perifere mononucleaire bloedcellen of p BMCs van zes donoren die waren gestimuleerd met toll-like receptorliganden.De gegevens worden gepresenteerd als radardiagrammen op een logaritmische schaal met behulp van twee analysemethoden, waaronder de absolute CQ-waarde genormaliseerd naar het housekeeping-gen en het kopie-aantal van het template per microgram totaal RNA. De gegevens tonen aan dat menselijke interferon-expressiesignaturen opgewekt door TLR-agonisten ligand-specifieke expressiesignaturen zijn van type I en III interferon in Resus Maccas. Deze waren in dit experiment ook TLR-ligandspecifiek; PBMC van drie donoren werden gedurende drie uur gestimuleerd met drie liganden.De expressie van interferon-subtypes in ongestimuleerde cellen bij de baseline was laag, zoals hier wordt getoond. Een beperkt aantal interferon-alfa-subtypes werd tot expressie gebracht als reactie op LPS en poly IC. In contrast hiermee was de interferon-expressie als reactie op imiquimod hoog en was de subtype-expressie een brede expressie van interferon-bèta en interferon.Lambda 1 werd versterkt door alle drie de TLR-agonisten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het voorbereiden, uitvoeren en analyseren van 3D vier-well assayplaten voor high-throughput analyse van een zeer gelijkaardige groep genen, zoals de type I en III interferon-subtypes.

high-throughput-quantitative-real-time-rt-pcr-assay-for-determining

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We zullen aantonen de opzet en analyse van pre-microRNA 96-wells-arrays voor QPCR het gebruik van een robot als door de hand met een Thermo Scientific Matrix multichannel pipet.

Profilering van de Pre-micro-RNA&#39;s en microRNA&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

This video demonstrates a quantitative method for detecting viral infection using real-time reverse transcription PCR. The reverse transcription step converts the RNA to cDNA, which is then amplified via PCR cycles. The presence of viral RNA in the sample is confirmed by analyzing the amplification and dissociation curves of DNA obtained from the PCR.

Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR for Diagnosing Viral Infections

This video demonstrates secreted embryonic alkaline phosphatase assay using HEK-Blue interferon-α/β reporter cells to quantify the type-I interferons (IFNs) released following stimulation of plasmacytoid dendritic cells by HIV-1 Infected CD4+ T cells.

Quantification of Bioactive Type-I Interferons using a Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase Reporter Assay

Circulerende microRNAs zijn onlangs naar voren gekomen als veelbelovend en nieuwe biomarkers voor verschillende vormen van kanker en andere ziekten. Het doel van dit artikel is om drie verschillende probes gebaseerde real-time PCR-platforms en methoden die beschikbaar zijn om te kwantificeren en te bepalen de overvloed aan circulerende microRNAs zijn te bespreken.

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

Er is een protocol gegeven voor het ontwikkelen van een real-time recombinase polymerase-amplificatietest om de initiële concentratie van DNA-monsters te kwantificeren met behulp van een thermische cycler of een microscoop en een stage-heater. Ook beschreven is de ontwikkeling van een interne positieve controle. Scripts zijn gegeven voor het verwerken van ruwe real-time fluorescentiegegevens.

Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

Ontworpen chromosomen van het Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, kunnen worden onderscheiden van hun natuurlijke tegenhangers met behulp van een PCR-gebaseerde genotyperingstest genaamd PCRTagging, die een aanwezigheid/afwezigheid-endpoint heeft. Hier beschrijven we een high-throughput real-time PCR detectiemethode voor PCRTag genotypering.

qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering

Dit manuscript beschrijft de experimentele procedure en software analyse voor een bidirectionele integratie site analyse die tegelijkertijd upstream en downstream vector-host junction DNA kan analyseren. Bidirectionele PCR producten kunnen worden gebruikt voor elk downstream sequencing platform. De resulterende gegevens zijn bruikbaar voor een high-throughput, kwantitatieve vergelijking van geïntegreerde DNA-doelen.

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van de ontwikkeling en validatie van een enkel molecuul matrix digitale Analyse ELISA, waarmee de ultra gevoelige detectie van alle IFN-α subtypen in menselijke specimens.

Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α

Leer een high-throughput qRT-PCR assay voor interferon expressieprofielen met geautomatiseerde pipettering. Deze methode discrimineert enkelvoudige basenpaarverschillen voor nauwkeurige immunologische analyse.

High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen (Video) | JoVE Journal

High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen

Meer video's verkennen