Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

Deze video demonstreert een methode om de dynamiek van weefselherstel op een stereomicroscoop vast te leggen met behulp van time-lapse-beeldvorming. Dit wordt bereikt door zebravisembryo's eerst te laten uitgroeien tot larvale stadia, wanneer de staartvin voldoende is ontwikkeld tot een grootte waarbij amputaties gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd. Dit gebeurt gewoonlijk na het uitkomen.

De tweede stap is het amputeren van de staartvin met een injectienaald. De derde stap is het plaatsen van de larven in een beeldkamer en het maken van een time-lapse film met een stereomicroscoop. De laatste stap is het kwantificeren van de regeneratie van de staartvin met behulp van beeldanalyse-software zoals Bit Plains S of de opensource-software Image J. Hallo. Mijn laboratorium bestudeert wondherstel en weefselregeneratie met zebrafish als model.

Vandaag demonstreren we een methode waarmee de dynamiek van deze processen in realtime wordt vastgelegd met behulp van brightfield stereomicroscopie. Vandaag demonstreren we een methode die de vroege processen van weefselregeneratie vastlegt met behulp van de larvale staartvin van de zebravis. De gepresenteerde beeldvormingsmethode biedt de mogelijkheid om gedragingen op het niveau van het gehele weefsel te observeren en te analyseren in een eenvoudige microscoopopstelling, die gemakkelijk aanpasbaar is aan elke stereomicroscoop die is uitgerust met time-lapse mogelijkheden.

Laten we beginnen. Het opkweeken van zebravissen tot het larvale stadium. Wondgenezing in de staartvin kan het beste worden geobserveerd na de uitkomstfase, aangezien de staartvin tegen die tijd voldoende is ontwikkeld en amputaties eenvoudig kunnen worden uitgevoerd zonder het ruggenmerg of andere weefsels te beschadigen.

Verzamel de eitjes in de directe nabijheid en broed ze gedurende de nacht in een incubator op 28 °C uit. Verwijder de volgende ochtend de dode embryo's en spoel ze met embryo-medium dat een 0,03% instant ocean aquariumzoutoplossing bevat. Indien nodig kan er embryo-medium met 0,003% fenothyroïd aan de schaal worden toegevoegd om pigmentatie van de larven te voorkomen.

Voor deze demonstratie laten we de embryo's in de incubator ontwikkelen tot twee dagen na de bevruchting, wanneer de larven uit hun eitjes zijn gekomen voor de voorbereiding van de beeldvormingskamer. In deze stap beschrijven we twee methoden voor het constructeren van de beeldvormingskamer. De eerste methode bestaat uit een beeldvormingskamer gemaakt van PVC- of Teflon-buizen van drinkwaterkwaliteit, die in elke bouwmarkt verkrijgbaar zijn.

Gebruik slang met een buitendiameter van 25 millimeter en een binnendiameter van 20 millimeter, aangezien dit de juiste maat heeft voor de bevestiging van het dekglas. Snijd de slang in ringen van 10 millimeter dik, waarbij u ze zo gelijkmatig mogelijk maakt. Gebruik schuurpapier om de randen glad te maken en spoel deze vervolgens af met water en ethanol.

Laat de lucht in de kamer drogen. Methode twee bestaat uit het gebruik van een vooraf vervaardigde matte tech glasbodem, een beeldvormende kamer met glazen bovenkant, of het maken van een beeldvormende kamer van een kleine Petrischaal. Om uw eigen beeldvormende kamer te maken, gebruikt u een Petrischaal van 35 of 50 millimeter en boort u een gat van 10 millimeter in het deksel.

Breng vervolgens siliconenvet aan op de buitenkant van het dekglas en bevestig een vierkant of rond dekglas van 25 bij 25 millimeter aan de buitenkant met een schone pipetpunt om ervoor te zorgen dat de montageagar stevig bevestigd blijft. Bevestig tijdens de beeldgevingsprocedure een fijn plastic gaas aan de binnenkant van het dekglas. Dit kan worden gedaan door het gaas op de maat van de diameter van de binnenring te snijden en vervolgens een kleine rechthoek van ongeveer drie keer de grootte van de larven in het midden van het gaas uit te snijden.

Het mounten en afbeelden van de larven vóór de beschadiging. Deze stap is geschikt voor latere kwantificering van de vinuitergroei. Bereid eerst een 0,5% low-melt agarose-oplossing in embryo-medium voor de immobilisatie van het specimen door de geanestheseerde larve over te brengen naar de agarose-oplossing die op 42 °C is gehouden.

Breng de larven met een druppel agros in een verwarmingsblok over naar een kleine Petrischaal en positioneer de larven op hun zijde. Laat het agros stollen met behulp van een afgedekte micro loader-tip en voeg trica-oplossing toe. Ga vervolgens naar de stereomicroscoop die later zal worden gebruikt.

Voor time-lapse imaging gebruiken we ter demonstratie een zes discovery V 12 stereomicroscoop en Axio vision software. Pas eerst de instellingen van de microscoop aan door het juiste objectief en de juiste vergroting voor de beeldvorming te selecteren. Selecteer vervolgens de detectiemodus van de camera op de microscoop in de alvis software.

Selecteer de live-modus om de larve op het scherm te bekijken. Open het eigenschappenvenster om de helderheid automatisch te detecteren of het contrast handmatig aan te passen bij de transilluminatiebasis van de microscoop. Verplaats de larven uit het gezichtsveld en selecteer de functie voor schaduwcorrectie.

Om achtergrondruis te minimaliseren, plaatst u de larven terug in het gezichtsveld en maakt u een momentopname. Sla de afbeelding op ter voorbereiding op de verwonding. Verwijder de larven uit de aros door eerst de aeros van de kop af te schrapen.

Hierdoor kunnen de larven uit de agar glippen door de kop voorzichtig weg te trekken van de resterende agar amputatie-assay. Bereid een agarplaat van 1,5% met een instant ocean zoutoplossing. Plaats de larven onder een stereomicroscoop zijlings op de gestolde agar en amputeer het distale deel van de staartvin met een spuitnaald van 23 gauge.

Het monteren van de larven voor time-lapse imaging. We presenteren twee methoden voor time-lapse imaging. In de eerste methode laten we zien hoe de larven in de kamerring kunnen worden afgebeeld na het monteren van de larven.

Schraap de gestolde agros rond de distale staartvin voorzichtig weg met een dopje voorzien micro loader pipetpunt. Dit maakt een goede wondgenezing of weefselregeneratie mogelijk. Probeer de vin niet herhaaldelijk te beschadigen door het weefsel niet vast te klemmen. Verwijder tijdens deze procedure ongewenste resten die de beeldvormingsprocedure hinderen uit de kamer door de oude oplossing te vervangen.

Breng met een verse Trica-oplossing siliconenvet aan op de bovenkant van de kamer en vul de kamerring met verse Trica-oplossing. Plaats een glazen objectglas bovenop om de kamer af te sluiten volgens methode twee. In deze methode laten we zien hoe de larven in een Petrischaal met glazen bodem kunnen worden afgebeeld.

Bevestig de larven op het deksglas, plaats het dekglas en vul het deksel met trica-oplossing. Schraap de agros van de staartvin af.

Breng vervolgens siliconenvet aan op de bovenrand van de onderste kamer en vul de kamer met trica-oplossing. Giet de trica-oplossing voorzichtig uit het deksel en draai het deksel om om de larve in de trica-oplossing van de onderste kamer te dompelen, wat onder een lichte hoek kan gebeuren. Om luchtbellen te voorkomen, wordt de kamer afgesloten met het siliconenvet voor time-lapse imaging om te garanderen dat een juiste temperatuur van 28 °C wordt gehandhaafd.

Stel een verwarmde incubatiekamer samen bestaande uit karton en bubbeltjesplastic voor isolatie en een bedrade koepel, zoals gebruikt voor het uitbroeden van kippeneieren, als warmtebron. Plaats de incubatiekamer rond de microscoop en stel de temperatuur in op 28 °C. Open de voorkant van de verwarmde incubatiekamer en plaats de beeldkamer op de microscoop gedurende ongeveer 10 tot 20 minuten of totdat de temperatuur is gestabiliseerd.

Plaats het preparaat met het dekglas naar boven, richting het objectief. Positioneer de larvale vin zodanig dat twee derde van het gezichtsveld onbezet blijft, om ervoor te zorgen dat de groei en regeneratie van de vin gedurende de beeldgevingsprocedure kan worden vastgelegd. Selecteer in het tabblad Zack en de slice-modus de opties voor Z-stapeling (Z stack) en time-lapse, zonder dat de larven in het 60 multi-dimensionale acquisitievenster van de software opnieuw gepositioneerd hoeven te worden.

Selecteer de plakdikte en kies vervolgens de start-stopmodus. Definieer de bovenste en onderste posities van de stack in de time-lapse tabel. Selecteer het interval en de duur van de movie, en druk vervolgens op de startknop om de opname te beginnen.

Controleer binnen het eerste uur de X- en Z-grenzen van de larven. Positioneer de larven indien nodig gedurende de tijd opnieuw, aangezien ze kunnen zijn verschoven door groei of verschillen in de samenstelling van de agar. Sla het bestand op aan het einde van de time-lapse opname en ga verder met de post-processing en de data-analyse van de kwantificatiestap.

In deze sectie bespreken we verschillende manieren om de gegevens te analyseren die zijn gegenereerd met methode één imas. Eerst bespreken we hoe de vinnengroei kan worden bepaald met imas-software. Open de time-lapse film in de Amaris-software en sla de bestanden op in het MRS-bestandsformaat.

Om de softwareprestaties te verbeteren, selecteert u het orthogonale aanzicht om de film als een projectie weer te geven. Om de vinlengte te meten, selecteert u de optie voor het toevoegen van nieuwe meetpunten in de werkbalk linksboven. Selecteer onder de lijst voor het configureren van zichtbare statistische waarden de statistische waarden die in de lijnmodus moeten worden weergegeven.

Selecteer onder het tabblad instellingen de optie 'pairs' in de eigenschappen van de labels, selecteer 'name' en 'distance' om de afstand tussen punten A en B naast de meetlijn weer te geven, schakel over naar de bewerkingsmodus en houd de shift-toets ingedrukt om het eerste punt bij de distale vin te selecteren. Gebruik vervolgens dezelfde configuratie om het tweede punt aan het distale uiteinde van de no accord te selecteren. De afstand wordt in de afbeelding weergegeven en kan worden geëxporteerd onder het tabblad statistieken.

Selecteer de knop 'Export all' rechtsonder. Als alternatief voor de optie meetpunten kan de slice viewer worden gebruikt om afstanden te meten in de slice-weergavemodus. Scroll naar de gewenste positie en klik met de linkermuisknop op de eerste en tweede posities; de afstand wordt vervolgens weergegeven.

Deze optie maakt echter geen export van gegevens mogelijk. We bespreken nu kort hoe de vinoffervlakte kan worden bepaald met de opensourcesoftware Image J. Open de TimeLapse-film in Image J met behulp van een plugin die het Zeiss Axio vision-bestandsformaat herkent.

Laad alternatief een ongecomprimeerde TIFF-sequentie. Dit zorgt ervoor dat de bestandsinformatie wordt opgeslagen onder analyze select set scale om de afstand, pixels en bekende afstand te definiëren, indien deze niet in het bestand bewaard zijn gebleven. Stel daarnaast de eenheidslengte in op micrometers.

Selecteer in de werkbalk het tool voor vrije selectie en omtrek de wond door de linkermuisknop ingedrukt te houden terwijl u langs de wondranden tekent.

Klik onder 'analyze' op de optie 'measure' om de representatieve resultaten van het wondoppervlak weer te geven. Amputatie van de vin leidt tot een gedeeltelijke regeneratie gedurende 36 uur na de amputatie. De oppervlaktemetingen van de vin laten zien dat vinnamputatie een afname van het vinweefsel veroorzaakt tot ongeveer 14 uur na de amputatie, vermoedelijk als gevolg van celdood, gevolgd door een geringe regeneratielengte.

Een vergelijking tussen de geamputeerde en geregenereerde vin laat een 2,48-voudige toename in vinlengte zien binnen 36 uur. Amputatie triggert aanvankelijk een purse-string-effect, gekenmerkt door contracties via actin-myosine-kabels die aanwezig zijn in de vinvouwcellen, welke uit de amputatiewond treden en vervolgens worden verwijderd. De lichaamslengte neemt aanvankelijk toe, maar de vin regenereert niet.

Tijdens de vroege fasen. Ongeveer 14 uur na de amputatie begint de vin uit te groeien van proximale naar distale posities. Samenvattend tonen onze resultaten aan dat amputatie wondcontractie induceert, wat essentieel kan zijn voor het bevorderen van cel-extrusie.

Zodra het proces is voltooid, begint de vin te regenereren. De ontwikkelingsgebonden vinvorming lijkt plaats te vinden. Onafhankelijk van dit proces hebben wij een methode gepresenteerd die het mogelijk maakt om de dynamische processen van weefselherstel bij levende zebravissenlarven te observeren.

Deze procedure vereist bepaalde aspecten die wij hebben getest om het resultaat te optimaliseren. Een duidelijk voordeel van de gepresenteerde beeldgevingsmethode is dat deze eenvoudig aanpasbaar is aan elke stereomicroscoop die is uitgerust met een CCD-camera en TimeLapse-software. Het biedt daarnaast een kosteneffectief alternatief voor het duurdere confocale beeldgevingssysteem.

Hoewel deze methode geen fluorescentie of celdetectie gebruikt, kan deze voor dergelijke toepassingen worden uitgebreid door gebruik te maken van een geautomatiseerd systeem voor shuttercontrole en deconvolutiesoftware voor nabewerking van beelden, om de processen van wondherstel en regeneratie verder te observeren met subcellulaire resolutie. Deze methode kan studenten een beter inzicht geven in de fundamentele biologische processen die ten grondslag liggen aan weefselherstel en regeneratie. De optische helderheid, het gemak waarmee embryonale en larvale zebravisjes kunnen worden gebruikt en de aanpasbaarheid van het systeem aan elke stereomicroscoop maken het geschikt voor het onderwijzen van basisbiologie van gewervelden in een klasomgeving.