Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

Deze video toont een methode om de dynamica van weefselherstel vast te leggen op een stereomicroscoop met behulp van time-lapse beeldvorming. Dit wordt bereikt door eerst de zebravisembryo's te laten groeien tot larvale stadia wanneer de staartvin voldoende ontwikkeld is tot een grootte waarbij amputatie gemakkelijk kan worden uitgevoerd. Dit wordt meestal bereikt na het uitkomen.

De tweede stap is om de staartvin te amputeren met behulp van een injectienaald. De derde stap is om de larven in een beeldvormingskamer te monteren en een time-lapse film op een stereomicroscoop vast te leggen. De laatste stap is om de regeneratie van de staartvin te kwantificeren met behulp van beeldanalysesoftware zoals Bit Plains S of de open source software Image J.Mijn lab bestudeert wondgenezing en weefselregeneratie met behulp van zebravissen als model.

Vandaag demonstreren we een methode die de dynamica van deze processen in real time vastlegt met behulp van brightfield stereomicroscopie. Vandaag demonstreren we een methode die de vroege processen van weefselregeneratie vastlegt met behulp van de larvale staartvin van de zebravis. De gepresenteerde beeldvormingsmethode biedt een mogelijkheid om gedrag op weefselschaal te observeren en te analyseren in een eenvoudige microscoopopstelling, die gemakkelijk kan worden aangepast aan elke stereomicroscoop die is uitgerust met time-lapse mogelijkheden.

Laten we beginnen. Het laten groeien van zebravissen tot larvale stadia. Wondgenezing in de staartvin kan het beste worden waargenomen na het uitkomen, omdat de staartvin tegen die tijd voldoende ontwikkeld is en amputatie gemakkelijk kan worden uitgevoerd zonder de wervelkolom of andere weefsels te beschadigen.

Verzamel in de buurt de eitjes en incubeer ze een nacht in een incubator van 28 graden Celsius. De volgende ochtend verwijdert u de dode embryo's en spoelt u ze af met embryomedium dat 0,03% instant ocean aquariumzout bevat. Voeg indien nodig embryomedium met 0,003% pheno schildklier toe aan het bakje om pigmentatie van de larven te voorkomen.

Voor deze demonstratie laten we de embryo's zich ontwikkelen tot twee dagen na de bevruchting in de incubator wanneer de larven zijn uitgekomen van hun kons voorbereiding van de beeldvormingskamer. In deze stap bieden we twee methoden voor het construeren van de beeldvormingskamer. Methode één bestaat uit een beeldvormingskamer gemaakt van drinkwater kwaliteit PVC of Teflon buis, die verkrijgbaar is in elke bouwmarkt.

Gebruik buis met een 25 millimeter buiten- en 20 millimeter binnendiameter, omdat dit de juiste maat heeft voor bevestiging van de dekplaat. Snijd de buis om ringen van 10 millimeter dik te maken, zo gelijk mogelijk. Gebruik schuurpapier om de randen glad te maken en spoel ze af in water en ethanol.

Laat de kamer aan de lucht drogen. Methode twee bestaat uit het gebruik van een vooraf vervaardigde matte tech glasbodem, glasbovenkant beeldvormingskamer, of het maken van een beeldvormingskamer uit een kleine petrischaal. Om je eigen beeldvormingskamer te maken, gebruik je een 35 of 50 millimeter petrischaal en boor je een 10 millimeter gat in het deksel.

Breng vervolgens siliconenvet aan op de buitenkant van de dekplaat en bevestig een 25 bij 25 millimeter vierkant of ronde dekplaat aan de buitenkant met een schone pipettentip om ervoor te zorgen dat de montage agar stevig blijft zitten. Tijdens de beeldvormingsprocedure bevestigt u een fijn plastic gaas aan de binnenkant van de dekplaat. Dit kan worden bereikt door het gaas te snijden tot de grootte van de binnenringdiameter en vervolgens een klein rechthoekje van ongeveer drie keer de grootte van de larven in het midden van het gaas te snijden.

Montage en beeldvorming van de pre-letsel larven. Deze stap is geschikt voor latere kwantificering van vinregeneratie. Bereid eerst een 0,5% lage smelt agro oplossing in embryomedium voor immobilisatie van het specimen door de verdoofde larve over te brengen naar de aro-oplossing die op 42 graden Celsius is gehouden.

In een verwarmingsblok brengt u de larven over met een druppel agros naar een kleine petrischaal en plaatst u de larven op zijn zij. Gebruik een afgesloten micro loader tip, laat de aros vaststellen en voeg trica oplossing toe. Ga naar de stereomicroscoop die later zal worden gebruikt.

Voor time-lapse beeldvorming gebruiken we een zes discovery V 12 stereomicroscoop en Axio vision software voor demonstratie. Pas eerst de microscoopinstellingen aan door het juiste objectief en de vergroting voor beeldvorming te selecteren. Selecteer vervolgens de camera detectiemodus op de microscoop in de alvis software.

Selecteer de live modus om de larve op het scherm te bekijken. Open het eigenschappenvenster om de helderheid automatisch te detecteren en pas handmatig de contrast aan bij de transilluminatiebasis van de microscoop. Verplaats de larven uit het gezichtsveld en selecteer de functie voor schaduwingcorrectie.

Om achtergrondruis te minimaliseren, plaatst u de larven terug in het gezichtsveld en maakt u een momentopname. Sla het beeld op om voor te bereiden op verwonding. Verwijder de larven uit de aros door eerst de aeros van het hoofd te schrapen.

Dit stelt de larven in staat om uit de aeros te glijden door voorzichtig het hoofd van de resterende aeros te trekken amputatie test. Bereid een 1,5% aeros plaat voor met behulp van instant ocean zout oplossing. Plaats de larven onder een stereomicroscoop zijwaarts op de gesolidificeerde aros en amputeer het distale deel van de staartvin met een 23 gauge injectienaald.

Montage van de larven voor time-lapse beeldvorming. We zullen twee time-lapse beeldvormingsmethoden presenteren. In de eerste methode laten we zien hoe de larven in de kamerring kunnen worden afgebeeld na montage van de larven.

Schraap voorzichtig de gesolidificeerde agros rond het distale staartvin met een afgesloten micro loader pipettentip. Dit zorgt voor een goede wondgenezing of weefselregeneratie zonder het weefsel te beperken, probeer de vin niet herhaaldelijk te verwonden. Tijdens deze procedure verwijdert u ongewenst puin dat de beeldvormingsprocedure