Name: Gebruik van de zachte agar Colony Formation Assay aan Remmers van tumorigeniciteit in borstkankercellen Identificeer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Leer de zachte agar kolonievormingsassay om tumorigeniciteit in borstkankercellen te evalueren met behulp van BB-Cl-amidine. Deze methode kwantificeert celproliferatie in semi-vaste matrices.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn Dr. Richard Cerione, Dr. Marc Antonyak en Kelly Sullivan, Cornell University, dankbaar voor hun technische advies, en Dr. Gerlinde Van de Walle, Cornell University, voor het delen van hun Olympus CKX41 omgekeerde microscoop.

1. Bereiding van 3% 2-hydroxyethyl Agarose <ol><li> In een schone, droge 100 ml glazen fles, voeg 0,9 g 2-hydroxyethyl agarose (Agarose VII), gevolgd door 30 ml gedestilleerd water. </li><li> Magnetron het mengsel gedurende 15 sec en zachtjes wervelen. Herhaal deze stap ten minste nog drie keer tot de agarose poeder volledig oplost. </li><li> Autoclaaf de oplossing bevattende fles voor 15 min. </li><li> Laat de agarose oplossing afkoelen tot kamertemperatuur vóór verder gebruik. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur. </li></ol> 2. Bereiding van de onderste laag: 0,6% agarosegel <ol><li> Pre-warm verscheidene 5 ml en 10 ml pipetten in een 37 ° C incubator om te voorkomen dat de agarose stollen in de pipet bij het hanteren. </li><li> Gedeeltelijk draai de fles deksel en een magnetron de vooraf gemaakte 3% 2-hydroxyethyl agarose oplossing voor 15 sec. Vervolgens voorzichtig zwenken de oplossing en magnetron nog eens 15 sec. LET OP: Wees voorzichtig bij het wervelende de agarose oplossing omdat de oplossing stijgt bij blootstelling aan lucht en kan overslaan. </li><li> Als er overblijvende vaste gel in de fles, magnetron gedurende enkele seconden. </li><li> Houd de fles met de agarose oplossing in een 45 ° C waterbad tijdens de volgende stappen om de agarose oplossing voorkomen stollen voortijdig. </li><li> Warm MCF10DCIS media in een 37 ° C waterbad. Opmerking: MCF10DCIS media bestaat uit DMEM / F12, 5% paardenserum, 5% penicilline streptomycine. </li><li> Overdracht 3 ml van 3% agarose-oplossing met de voorverwarmde pipetten in een steriele 50 ml conische buis. </li><li> Onmiddellijk toevoegen 12 ml warm MCF10DCIS media en voorzichtig omkeren van de conische buis om de agarose met de media te mengen. Probeer om geen luchtbellen te vormen zoals het zal interfereren met de kolonie later tellen. </li><li> Voeg voorzichtig 2 ml van dit mengsel in elk putje van een 6-well cultuur plaat zonder vormen eventuele luchtbellen. </li><li> Incubeer de 6-well cultuur plaat horizontally op een vlakke ondergrond bij 4 ° C gedurende 1 uur om het mengsel stollen. </li><li> Nadat het mengsel vast wordt, plaatst de plaat in een 37 ° C incubator gedurende 30 minuten. De onderste laag is nu klaar voor gebruik. </li></ol> 3. Bereiding van de Cell-bevattende laag: 0,3% agarosegel <ol><li> Trypsinize MCF10DCIS cellen en verdun ze een celconcentratie van 4 x 10 4 / ml. </li><li> Neem 2 ml van 3% agarose behulp voorverwarmd pipetten en over in een steriele 50 ml conische buis. </li><li> Onmiddellijk toevoegen 8 ml MCF10DCIS media om de conische buis en voorzichtig omkeren aan de agarose met de media te mengen. Vermijd de vorming van eventuele luchtbellen. </li><li> Neem 2 ml van de MCF10DCIS cellen (4 x 10 4 / ml) en behandel met BB-CLA (0 uM (DMSO) en 1 uM). </li><li> In een 1: 1 verdunning, meng de cellen met 0,6% agarose. </li><li> Neem 1 ml van de cel-agarose mengsel en voeg voorzichtig op de onderste laag van de 6-well kweek plate (2 x 10 4 cellen / ml). </li><li> Plaats de 6-well kweekplaat horizontaal op een vlakke ondergrond bij 4 ° C gedurende ten minste 15 minuten om de toplaag te stollen. </li><li> Nadat het mengsel vast wordt, plaatst de plaat in een 37 ° C incubator gedurende een week vóór het toevoegen van de voeding laag. </li></ol> 4. Voorbereiding van de Feeder laag: 0,3% agarosegel <ol><li> Magnetron de vooraf gemaakte 3% 2-hydroxyethyl agarose oplossing voor 15 sec. Zwenk de oplossing en een magnetron voor nog eens 15 sec. </li><li> Equilibreer de agarose oplossing fles in een 45 ° C waterbad. </li><li> Verwarm de MCF10DCIS media in een 37 ° C waterbad. </li><li> Meng 1 ml 3% agarose oplossing 9 ml warm MCF10DCIS media in een 50 ml conische buis en voorzichtig omkeren om de agarose met de media te mengen. Vermijd de vorming van luchtbellen. </li><li> Behandel het mengsel BB-CLA (0 uM (DMSO) of 1 uM). </li><li> Voeg voorzichtig 1 ml van dit mengsel (zonder voorming bellen) in elk putje van de 6-well kweekplaat die de bodem en zachte lagen. </li><li> Plaats de 6-well kweekplaat horizontaal op een vlakke ondergrond bij 4 ° C gedurende ten minste 15 minuten om het mengsel stollen. </li><li> Nadat de feeder layer stolt, plaats de plaat in een 37 ° C incubator. </li><li> Herhaal deze procedure voeren wekelijks door overlaying 1 ml 0,3% agarose / medium / behandeling oplossing op de bestaande feeder laag om de cellen te vullen met nieuwe media tot kolonievorming wordt waargenomen. Opmerking: Agar in de zachte feeder lagen is zeer zacht en daarom wordt de extra voedingsstoffen uit de voederlaag gemakkelijk diffunderen in de cel-bevattende laag op de cellen te bereiken. </li></ol> 5. Data Collection <ol><li> Na 2,5 weken van celgroei in zachte agar, tel het aantal kolonies in elk putje met behulp van een lichtmicroscoop. Om kwantificering te vergemakkelijken, drukt u een raster op een transparantie en bevestig het rooster aan de6-putjesplaat te bepalen waar de cellen tijdens het tellen. Aangezien kolonie grootte (zoals gekwantificeerd door de diameter van elke kolonie) variëren, vooraf instellen verwijzing koloniegrootte te bepalen welke kolonies worden gescoord. Bijvoorbeeld omvatten kolonie groottes van 70 micrometer of groter de gegevensanalyse. </li><li> Bewaar de monsters bij 4 ° C tot verdere vorming kolonie toekomstige tellen te voorkomen. Sluit de 6-well kweekplaat met Parafilm te voorkomen dat de gel uitdroogt. </li></ol>

<ol><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197, 461-463 (1977).</li>
<li>Wang, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signaling+regulating+anchorage-independent+growth+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells.</a> Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).</li>
<li>Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+peptidylarginine+deiminase+enzymes+in+disease+and+female+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction.</a> J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).</li>
<li>Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+peptidylarginine+deiminase+enzymes+and+protein+citrullination+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis.</a> Biochem Res Int. , 895343(2012).</li>
<li>McElwee, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PADI2+as+a+potential+breast+cancer+biomarker+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target.</a> BMC Cancer. 12, 500(2012).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+disrupts+NET+formation+and+protects+against+kidney%2C+skin+and+vascular+disease+in+lupus-prone+MRL%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice.</a> Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).</li>
<li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).</li>
<li>Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+evaluation+of+human+tumor+chemosensitivity+in+the+soft-agar+assay+and+its+clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).</li>
<li>Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+tumor+colony+growth+in+soft+agar+by+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Cloning%22%5BJournal%5D)">Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum.</a> Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).</li>
<li>Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+soft+agar+assay+for+identification+of+anticancer+compound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound.</a> J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De mate van kolonievorming in zachte agar varieert afhankelijk van het celtype 9. Daarom is het aantal cellen te beginnen moet worden geoptimaliseerd en aangepast. Voorgestelde start bereik ligt tussen 5 x 02-01 oktober x 10 4 cellen per putje met behulp van een 6-wells plaat. Bovendien varieert koloniegrootte afhankelijk van de groeisnelheid van elke cel. Daarom wordt een vooraf gedefinieerde een cut-off voor kolonie maat die u nodig individuele kolonies voor downstream kwantitatieve an...

Zowel niet-getransformeerde (normale) als getransformeerde cellen kunnen gemakkelijk prolifereren in een 2D-monolayercultuur. Deze vorm van adherante celgroei verschilt aanzienlijk van wat zich voordoet in vivo waar, bij afwezigheid van mitogene stimulatie, cellen niet vaak snel delen binnen hun micro-omgeving. De zachte agartest daarentegen is anders dan 2D-kweeksystemen omdat het de tumorigeniteit kwantificeert door de mogelijkheid van een cel te meten om te prolifereren en kolonies te vormen in suspensie binnen een semi-solide agarosegel1. In deze omgeving zijn niet-getransformeerde cellen niet in staat om snel te propageren bij afwezigheid van verankering aan de extracellulaire matrix (ECM) en ondergaan apoptose, een proces dat bekend staat als anoikis. Daarentegen verliezen cellen die een kwaadaardige transformatie hebben ondergaan hun verankeringsafhankelijkheid door activering van signaalroutes zoals fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt en Rac/Cdc42/PAK. Daarom zijn deze cellen in staat om te groeien en kolonies te vormen binnen de semi-solide zachte agarmatrix2.
Een veelvoorkomend gebruik van de zachte agartest is om te testen of specifieke verbindingen, zoals PADI-remmers, in staat zijn om tumorgroei in vitro te onderdrukken. In het algemeen zijn kolonietelling of koloniegroottes kwantitatieve uitkomsten van de test die vergeleken kunnen worden tussen controle- en behandelingsgroepen om verschillen in cellulaire tumorigeniteit te beoordelen. Daarom kan er, als men vaststelt dat kolonievorming omgekeerd gecorreleerd is met een toenemende drugconcentratie, de conclusie worden getrokken dat de drug een effectieve remmer van tumorigeniteit in vitro is. Aan de andere kant, als de drug geen invloed heeft op de kolonievorming, dan is de drug ofwel niet in de juiste dosering ofwel is het geen effectieve tumorigene remmer. Afgezien van het gebruik van een zachte agartest om het anti-tumoreffect van een drug te testen, kan deze test ook worden gebruikt om de relatie tussen een specifiek gen en tumorigenese te onderzoeken. Bijvoorbeeld, het effect van het onderdrukken van PADI2-expressie op tumorigeniteit kan worden aangepakt door PADI2-specifieke siRNA-behandeling.
PADI's zijn calciumafhankelijke enzymen die eiwitten post-translationeel wijzigen door positief geladen arginineresiduen om te zetten in neutraal geladen citrulline in een proces dat bekend staat als citrullinering of deiminatie3-5. We hebben onlangs ontdekt dat peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) mogelijk functioneert als een nieuwe borstkanker-biomarker en dat PADI-remmers kandidaat-therapieën vertegenwoordigen voor vroegstadium borstkanker6. Bijvoorbeeld, we hebben eerder aangetoond dat een 'pan-PADI'-remmer, Cl-amidine, de proliferatie van borstkankercellen onderdrukt met behulp van 2D-monolagen en dat de remmer de groei van 3D-tumorsferoïden onderdrukt6. In dit rapport breiden we deze studies uit, en benadrukken we het nut van de zachte agartest, door de werkzaamheid van een nieuwe PADI-remmer, BB-CLA, te testen bij het onderdrukken van de groei van MCF10DCIS-borstkankerkolonies7. We merken op dat we MCF10DCIS-cellen hebben gebruikt voor dit experiment omdat ze oncogeen zijn afgeleidingen van niet-getransformeerde humane MCF10A-cellen en omdat ze hoge steady state-niveaus van PADI2-eiwit bevatten8. We veronderstellen dat PADI2-enzymatische activiteit een sleutelrol speelt in de tumorigeniteit van deze cellijn en dat BB-CLA-gemedieerde remming van PADI2-activiteit kankerprogressie zal onderdrukken.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Axiopot</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>1021859251</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Donor Equine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346-81-1</td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik van de zachte agar colony formation assay aan remmers van tumorigeniciteit in borstkankercellen identificeer

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Gezien de inherente moeilijkheden bij het onderzoeken van de mechanismen van tumorprogressie in vivo, blijven op cellen gebaseerde assays, zoals de soft agar kolonievormingstest (hierna genoemd de soft agar test), die het vermogen van cellen om te prolifereren in semi-solide matrixen meet, een handelsmerk van kankeronderzoek. Een belangrijk voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele 2D monolaag of 3D sferoïde celkweekassays is de nauwe mimicry van de 3D cellulaire omgeving zoals die in vivo wordt gezien. Belangrijk is dat de soft agar test ook een ideaal hulpmiddel biedt om de effecten van nieuwe verbindingen of behandelingscondities op celproliferatie en migratie rigoureus te testen. Bovendien maakt deze test de kwantitatieve beoordeling van het celtransformatiepotentieel mogelijk binnen de context van genetische verstoringen. We hebben recentelijk peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) geïdentificeerd als een potentiële borstkankerbiomarker en therapeutisch doelwit. Hier benadrukken we de bruikbaarheid van de soft agar test voor preklinische anti-kankerstudies door de effecten van de PADI-remmer, BB-Cl-amidine (BB-CLA), op de tumorigeniteit van humane ductale carcinoom in situ (MCF10DCIS) cellen te testen.

De zachte agar kolonievorming test kan worden gebruikt voor een groot aantal toepassingen documenteren van de tumorigeniciteit van kankercellen. Een groot voordeel van deze techniek is dat de halfvaste matrix selectief bevordert de groei van cellen die kunnen prolifereren in een verankering-onafhankelijke wijze. Deze eigenschap is vooral vertoond door kankercellen, maar niet normale cellen. We gebruiken voornamelijk deze techniek om de effectiviteit van tumorgroei inhibitie testen van drugs en testen op het effect van o...

Hier documenteren we het gebruik van de zachte agar-kolonievormingstest om de effecten van een peptidylarginine deiminase (PADI) enzymremmer, BB-Cl-amidine, op de tumorigeniteit van borstkanker in vitro te testen.

Gebruik van de zachte agar Colony Formation Assay aan Remmers van tumorigeniciteit in borstkankercellen Identificeer

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Het algemene doel van deze procedure is om kwantitatief het effect van een behandeling op het vermogen van cellen om te prolifereren in semi-solide matrices te bepalen, aangezien een verhoogd vermogen een kenmerk is van de tumorigeniciteit van cellen. Met behulp van de soft agar assay wordt de tumorigeniciteit gemeten via het vermogen van een cel om kolonies te vormen binnen een semi-solide AROS-gel. Omdat niet-getransformeerde cellen niet in staat zijn om zich snel voort te planten in deze omgeving, wordt de semi-solide AROS-gel geconstrueerd door eerst een bodemlaag van 0,6% AROS te maken. Vervolgens wordt bovenop de bodemlaag een celhoudende laag van 0,3% AROS-gel toegevoegd.In deze assay worden de experimentele cellen behandeld met een remmer van het peptidyl-arginine-deiminase- of PAD-enzym, ontwikkeld door Dr. Subramanian. Elke week wordt er een extra voedingslaag toegevoegd, bestaande uit een 0,3% agarosegel met of zonder behandeling. De laatste stap is het tellen van het aantal kolonies groter dan 70 µm voor analyse.Uiteindelijk wordt geïnverteerde microscopie gebruikt om het verschil in het aantal koloniën tussen de controlegroep en de behandelingsgroep aan te tonen. Hallo, mijn naam is Achi Huta. Ik ben een promovendus in het lab van dr. Scott Kros aan het Baker Institute for Animal Health.Aan de Cornell University kan een assay voor de vorming van zachte tijgerkolonies helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de kankerbiologie, zoals het beoordelen van de tumorgeniciteit van een breed scala aan kankercellen met betrekking tot hun gevoeligheid voor geneesmiddelen, hormonen en een veelheid aan andere behandelcondities. Begin deze procedure door 3% twee-hydroxyethyl-aros voor te bereiden in een schone, droge glazen fles van 100 milliliter. Voeg 0,9 gram twee-hydroxyethyl-aros toe, gevolgd door 30 milliliter gedestilleerd water.Verwarm het mengsel 15 seconden in de magnetron en draai voorzichtig rond. Herhaal deze stap totdat het AROS-poeder volledig is opgelost. Autoclaveer vervolgens de fles met de oplossing gedurende 15 minuten.Laat de agros-oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Voorafgaand aan de volgende stap worden diverse pipetten van vijf milliliter en 10 milliliter voorverwarmd in een incubator van 37 °C om te voorkomen dat de aros in de pipet stolt. Draai de flesdop gedeeltelijk los en verwarm de kant-en-klare 3% twee HYDROXYETHYL aro-oplossing 15 seconden in de magnetron.Wals vervolgens voorzichtig met de oplossing en verwarm deze nogmaals 15 seconden in de magnetron. Wees voorzichtig bij het walsen van de ARO-oplossing, omdat de oplossing stijgt bij blootstelling aan lucht en kan overstromen als er residuen van vaste gel in de magnetronfles zitten. Houd de fles met de ARO-oplossing tijdens de volgende stappen nog enkele seconden in een waterbad van 45 °C om te voorkomen dat de agro-oplossing voortijdig stolt.Breng vervolgens 12 milliliter van het voorverwarmde medium met behulp van de Prewarm-pipetten over naar een steriele conische buis van 50 milliliter. Voeg onmiddellijk drie milliliter van de 3%aros-oplossing toe en keer de conische buis voorzichtig om om de aros met het medium te mengen. Voeg daarna voorzichtig twee milliliter van dit mengsel toe aan elke put van een zes-putsen kweekplaat, zonder luchtbellen te vormen.Incubeer de six-well cultuurplaat horizontaal op een vlak oppervlak bij 4 °C gedurende één uur om het mengsel te laten stollen. Nadat het mengsel is gestold, plaatst u de plaat gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C. De onderste laag is nu klaar voor gebruik.Een uitdagend aspect van deze procedure is om ervoor te zorgen dat alle cellen gelijkmatig worden verdeeld en dat de gesmolten agar-schil niet stolt vóór toevoeging aan elke put, zodat de cellen in het medium zijn gemengd voordat de vloeibare agri-gel wordt toegevoegd. Daarnaast worden de pipetten vooraf voorverwarmd om te voorkomen dat de oplossingen stollen tijdens het hanteren. Om de celbevattende laag voor te bereiden, worden MCF 10 DCIS-cellen eerst getrypsiniseerd en verdund tot een celconcentratie van 40.000 cellen per milliliter; neem vervolgens acht milliliter medium op met voorverwarmde pipetten en breng dit over naar een steriele conische buis van 50 milliliter.Voeg onmiddellijk twee milliliters 3%aros toe aan de conische buis en keer deze voorzichtig om om de aros met het medium te mengen. Vermijd de vorming van luchtbellen. Neem vervolgens twee milliliters van de cellen en behandel deze met twee micromolair BB chloramine in DMSO of met alleen DMSO als controle na de behandeling; meng de cellen vervolgens in een één-op-één verdunning met 0,6%aros om een uiteindelijke concentratie van één micromolair BB chloramine te verkrijgen.Neem vervolgens één milliliter van het cell aros-mengsel en voeg dit voorzichtig toe aan de onderste laag van de zeswells kweekplaat. Plaats de zeswells kweekplaat horizontaal op een vlak oppervlak bij 4 °C gedurende ten minste 15 minuten om de bovenlaag te laten stollen. Nadat het mengsel is gestold, wordt de plaat een week in een incubator bij 37 °C geplaatst voordat de voedingslaag wordt toegevoegd.Begin de voorbereiding van de voedingslaag door de vooraf bereide 3% twee-hydroxyethyl-agro-oplossing in de magnetron te verhitten zoals eerder beschreven en de fles met agro-oplossing te equilibreren in een waterbad van 45 °C. Meng één milliliter van de 3% agro-oplossing met negen milliliter warm medium in een conische buis van 50 milliliter en keer de buis voorzichtig om om de agro-oplossing met het medium te mengen. Voorkom de vorming van luchtbellen. Nadat het mengsel is behandeld met BB-chloramine, voegt u voorzichtig één milliliter van het mengsel toe aan elke well van de zes-wells cultuurplaat die de bodem- en zachte lagen bevat.Plaats de zeswell-kweekplaat vervolgens horizontaal op een vlak oppervlak bij 4 °C gedurende ten minste 15 minuten om het mengsel te laten stollen. Nadat de feederlaag is gestold, wordt de plaat in een incubator bij 37 °C geplaatst. Herhaal deze voedingsprocedure wekelijks door één milliliter 0,3% agros medium behandelingsoplossing over de bestaande feederlaag aan te brengen om de cellen aan te vullen met nieuw medium, totdat er kolonievorming wordt waargenomen.Na twee en een halve week celgroei in de soft agar wordt het aantal kolonies in elke well geteld. Om de kwantificering te vergemakkelijken, wordt met behulp van een lichtmicroscoop een raster op een transparantie geprint en aan de six-wellplaat bevestigd om de locatie van de cellen tijdens het tellen te bepalen. De kolonieomvang wordt gekwantificeerd aan de hand van de diameter van elke kolonie en zal variëren; definieer vooraf een referentiegrootte van de kolonie om te bepalen welke kolonies worden geteld.Bijvoorbeeld, in dit geval worden koloniesizes van 70 µm of groter meegenomen in de data-analyse. Seal na het tellen de zeswell-kweekplaat met parafilm om te voorkomen dat de gels uitdrogen. Bewaar de monsters bij 4 °C om verdere kolonievorming te voorkomen en voor toekomstige tellingen.De resultaten tonen aan dat BB-chloramine de vorming van kolonies afgeleid van MC 10 DCIS-cellen significant remt in de aanwezigheid van een pad-remmer. Er was sprake van een afname in zowel de kolonievorming als de koloniegrootte vergeleken met de DMSO-controle. De grootte van de kolonies voor met BB-chloramine behandelde MCF 10 DCIS-cellen lag hoofdzakelijk binnen het bereik van 20 tot 100 micrometers.Hoewel de grootte van de kolonies voor de DMSO-controle een groter bereik van 70 tot 150 micrometer vertoonde na twee en een halve week groei, werden kolonies groter dan 70 micrometer geteld en geanalyseerd. Er was een gemiddelde van ongeveer 3.500 kolonies in de DMSO-controle, terwijl er slechts ongeveer 2000 kolonies werden gezien in de groep behandeld met BB-chloramine. Na twee en een halve week soft-agarosekweek vertegenwoordigt dit een afname van 44% in de gemiddelde kolonievorming in aanwezigheid van één micromolaire BB-chloramine, wat wijst op een significante tumorigene remming van borstkankercellen door de PAD-remmer.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om vooraf alle reagentia en apparatuur voor te verwarmen om te voorkomen dat de oplossingen stollen tijdens de hantering, en bedankt voor het kijken.

utilization-soft-agar-colony-formation-assay-to-identify-inhibitors

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

Deze video beschrijft een zachte agar kolonievormingstest om de effecten van een PADI-enzymremmer en BB-Cl-amidine op borstkankertumorigeniciteit in vitrote testen. Deze test maakt ook de kwantitatieve beoordeling van het celtransformatiepotentieel in de context van genetische verstoringen mogelijk.

Soft Agar Colony Formation Assay: een methode om effecten van nieuwe verbindingen op de proliferatie van kankercellen te testen

This video describes the colony formation assay, which helps determine lung cancer cells' ability to proliferate indefinitely and form individual colonies. We can analyze the effect of an anticancer agent on the colony-forming cells by analyzing the changes in the number and/or size of the resulting colonies.

Colony Formation Assay: Assessing the Efficacy of Anticancer Agents on Colony-Forming Lung Cancer Cells

This video describes the protocol for methyl cellulose-based colony formation unit or CFU assay, which helps identify and count the number of colonies formed by leukemic cells in response to the treatment with anticancer compounds.

Methyl Cellulose-Based CFU Assay: A Method to Determine the Effect of Anti-cancer Compounds on Colony Formation in Leukemic Cells

De zachte agar-kolonievormingstest is een methode die wordt gebruikt om cellulaire ankeronafhankelijke groei in vitro te bevestigen. Het doel van dit protocol is om een strenge methode te illustreren voor de detectie van het tumorigene potentieel van getransformeerde cellen en de tumoronderdrukkende effecten van eiwitten op getransformeerde cellen.

De Soft Agar Kolonie Formatie Assay

Deze procedure zal demonstreren hoe we de anti-NFκB en anti-kanker stamcel activiteit van een aspirine-fumaraat prodrug hebben gesynthetiseerd en gekarakteriseerd.

Synthese en karakterisering van een Aspirine-fumaraat Prodrug dat NFKB Activity and Breast Kanker stamcellen Remt

Het is vaak noodzakelijk om te beoordelen van de potentiële cytotoxiciteit van een reeks van verbindingen op gekweekte cellen. Hier beschrijven we een strategie om betrouwbaar op te schermen voor giftige stoffen in een 96-well formaat.

Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer

De in vitro Cell Invasion assay wordt gebruikt om het potentieel van kanker metastasen te meten door het cellulaire potentieel voor invasie en migratie te kwantificeren met behulp van celkweek inserts met eiwit matrix. Cellen worden uitgedaagd om te migreren door de eiwit matrix en een poreus membraan, naar een chemoaantretant, en vervolgens gekwantificeerd door lichte microscopie.

Het gebruik van muizen-borstkanker tumor cellen in een in vitro invasie assay als een maat voor oncogene Celgedrag

Dit protocol biedt experimentele in vitro tools om de transformatie van menselijke borstcellen te evalueren. Gedetailleerde stappen naar de follow-up cel proliferatie tarief, verankering-onafhankelijke groeicapaciteit, en de distributie van cellijnen in 3D-culturen met kelder membraan matrix worden beschreven.

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Het huidige protocol beschrijft het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van cel-levensvatbaarheidstests en microscopische onderzoeken.

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

Dit experimentele protocol biedt een stabiele, kosteneffectieve en efficiënte methode die lncRNA-knockdown combineert met kolonievormende assays om het effect van lncRNA op de proliferatie van osteosarcoomcellen te kwantificeren.

Kolonievormingstest Detecteer de proliferatieve capaciteit van LncRNA-knockdown osteosarcoomcellen

Leer de zachte agar kolonievormingsassay om tumorigeniciteit in borstkankercellen te evalueren met behulp van BB-Cl-amidine. Deze methode kwantificeert celproliferatie in semi-vaste matrices.

Gebruik van de zachte agar Colony Formation Assay aan Remmers van tumorigeniciteit in borstkankercellen Identificeer

Meer video's verkennen