Name: Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca 2+ Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Leer twee-fotonmicroscopie voor vasculaire biologie om intracellulair calcium en stikstofoxide in endotheelcellen en gladde spiercellen van geïsoleerde rattenaorta te meten. Deze methode biedt hoge resolutie voor signaalwaarneming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. William Cashdollar en de Northwestern Mutual Foundation Imaging Center op het Bloed Research Institute of Wisconsin voor hulp met de imaging studies. We danken ook Dr. Daria Ilatovskaya voor kritische lezing van dit manuscript en behulpzaam discussie. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health Subsidies HL108880 (AS) en DP2-OD008396 (AMG).

De hieronder beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan het Medical College of Wisconsin en waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren. 1. Isolatie van de Rat Aorta <ol><li> Verdoven ratten met isofluraan (5% inductie, 1,5 tot 2,5% onderhoud) of een andere IACUC goedgekeurde methode. </li><li> Plaats de rat in een liggende positie. Om de buikorganen bloot een kleine ventrale middellijn incisie door de huid en het subcutane abdominale weefsel. Met gaasjes voorzichtig buigen de darmen om de aorta en vena cava bloot te leggen zoals weergegeven in figuur 1. </li><li> Kort Blunt ontleden de aorta van het bindweefsel en de vena cava. Met hechtmateriaal, afhechten de aorta zo dicht mogelijk bij de nieren. Ontleden ongeveer 1-2 cm van de aorta en plaats deze in een 15 ml conische tuworden met normale fysiologische zoutoplossing (PSS, in mM: 140 NaCl, 1,2 MgCl2, 2 CaCl2, 4,5 KCl, 6 glucose, 10 HEPES) op ijs. </li><li> Zodra de aorta is geïsoleerd, euthanaseren van de dieren volgens de goedgekeurde IACUC protocollen. Bij de voltooiing van alle niet-survival procedures euthanaseren diep verdoofde dieren door thoracotomie inducerende pneumothorax aan de humane ondergang van het dier te waarborgen. 3 </li><li> Met behulp van een dissectie microscoop, fijne punt pincet en microscissors ontleden het vet en bindweefsel af van de aorta. Zodra de aorta is schoon, snijd de aorta in de lengte en plaats het in de PSS op ijs voor later. </li></ol> 2. Dye laden en Incubation <ol><li> Pipetteer 7 pi van 1 mM Fluo-04:00 kleurstof, die wordt geleverd in DMSO gebaseerde oplossing, in afzonderlijke buizen die 500 ul werden afgedekt met aluminiumfolie. Bewaar in de vriezer bij -20 ° C tot de kleurstof eigenschappen in de tijd behouden. Let op: dus deze gealiquoteerdsingen moet stabiel zijn gedurende tenminste zes maanden. </li><li> Voor gebruik kan de kleurstof oplossing opwarmen tot KT alvorens te openen. Bereid werkende oplossingen direct voor het gebruik. Laat de verdunde reagens voor later gebruik opslaan. </li><li> Voeg 7 ul-klare 1 mM Fluo-04:00 kleurstof opgelost in DMSO oplossing tot 450 ul van PSS die geen calcium. Voeg 40 ul van niet DMSO gebaseerde 10% Pluronic Acid oplossing voor het laden cocktail om verspreiding van de acetoxymethyl (AM) esters en verbeterd laden van de calcium kleurstof. </li><li> Plaats de ontleed aorta in de 500 ul buizen met het laden cocktail (zoals beschreven in 2.3) gedurende 1 uur. Bedek alle buizen met folie en plaats op een draaiende schudder bij RT. </li><li> NO productie in de bloedvaten te controleren, gebruiken DAF-FM diacetaat kleurstof. Incubeer de aorta in een oplossing die 450 ul PSS, 40 ui pluronzuur en 5 ui 10 mM DAF FM-diacetaat. Vergelijkbaar met de calcium incubatie protocol (in 2.3 beschreven), plaatst u de aortaper 500 pl buis met de NO-kleurstofoplossing bedekt met folie en plaats op een roterende schudder gedurende 30 minuten bij 4 ° C gevolgd door volgende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Wanneer NO productie wordt gemeten met de endotheliale NO synthase blocker, L-NAME, NO productie blokkeren als controle zoals getoond in figuur 4B. Voor die procedure, toe te voegen aan cocktail (zoals beschreven in 2.5) 100 nM L-naam voor de laatste 30 min incubatie (bij RT). </li></ol> 3. Laser Scanning Twee foton microscopie Protocol <ol><li> Na 1 uur incubatie, was de aorta 2-3 maal in schone PSS op extracellulaire kleurstof te verwijderen. </li><li> Breng de aorta naar een gesiliconiseerd schaaltje met hetzij normale PSS of Ca2 + -vrije buffer (afhankelijk van het experimentele protocol). Pin de aorta beneden op de siliconenlaag de adventitia in contact met de silicone (bijv endotheliale lumen blootgesteld aan de schotel opening) middels μ-vormige pinnen. Als alternatief gebruik maken van een Slice Anchorraster of lijm aan het weefsel te herstellen. Opmerking: Om stress en mogelijke mechanische artefacten, de overdracht te verminderen en vast te aorta in Ca 2+ -vrije oplossing en wacht 5-10 minuten vóór het begin van het experiment. </li><li> Sluit een peristaltische pomp of een injectiespuit naar de siliconen-gecoate plaat voor automatische of handmatige toepassing van geneesmiddelen of voor het veranderen van de extracellulaire oplossing. </li><li> Zet de schaal onder de neus stuk van de rechtopstaande twee-foton microscoop en installeer en plaats een 25 × (NA 1,05 en werkafstand 2 mm) water-immersie objectief boven het monster. Opmerking: Als deze specifieke lens niet verkrijgbaar objectieve vervaardigd voor twee foton beeldvorming omdat het signaalresolutie drastisch vergeleken met een gewone doel kan verhogen. </li><li> Activeer de twee foton laser met de software (de laser begint te pompen en branden). Stem de laser excitatie tot 820 nm. </li><li> Met behulp van epifluorescentie, zoek de aorta en de focus van de doelstelling ophet endotheel oppervlak met grove afstelling. </li><li> Schakel de microscoop in twee foton laser scanning modus, zodat de excitatie laser geblokkeerde modus, de niet descanned detectors zijn ingeschakeld en de emissiefilters geschikt is voor de verwachte emissiespectra geïnstalleerd. Opmerking: Hier, de FV10-MRL / R (495-540 nM) gebruikt. </li><li> Start levende scannen met ongeveer 5% laservermogen en fijn richten van de doelstelling om de endotheelcellen zichtbaar. Opmerking: de endotheelcellen zal een sterke fluorescerende signaal vertonen bij incubatie in normale PSS. Dit zal merkbaar zwakker zijn wanneer de schepen worden geïncubeerd in calcium-vrije buffer. De endotheelcellen aanwezig bovenop de geopende aorta en de gladde spiercellen te zien net onder de endotheelcellen (zie figuur 2) zijn. Doordat bloedvaten niet glad en zelfs, zullen er plaatsen waar zowel gladde spiercellen en endotheelcellen aanwezig zijn. &lt;/ Li&gt; <li> Zodra de cellen zijn in focus, het programma van de microscoop software om opeenvolgende beelden in snelle scan mode (rasterscan, 512 x 512 pixel scherm met een frame collectie frequentie van 1,1 s) te verzamelen. Parallel met Fluo-04:00 fluorescentie, verzamel overgedragen lichtbeelden om veranderingen in vat krimp op te sporen en beter te visualiseren de experimentele condities. </li><li> Na het verzamelen van de baseline signaal beelden, veranderen de Ca 2+ ion-concentratie in de externe oplossing of langzaam farmacologische stimulus agenten passen met behulp van de peristaltische pomp, terwijl beeldvorming. Let op de fluorescerende toename signaal binnen de beladen cellen. Opmerking: Endotheelcellen reageren op veranderingen in stroom, waardoor het aanbeveling lage laminaire toepassingen en testen voertuig te gebruiken voor het aanbrengen van farmacologische activators Ca2 + of NO signalering. Intracellulaire calcium aan nM concentratie waarden opnieuw te berekenen in schepen geladen met Fluo-4 (dissociatieconstante voor Fluo-4 is 345 nm), kan fluorescentie-intensiteit worden vastgelegd bij aanvang en na toevoeging van ionomycine en MnCl2. 4 </li></ol> 4. Beeldverwerking en Berekeningen <ol><li> Download en installeer Fiji beeldverwerking pakket. </li><li> Open het beeldbestand in Fiji. Bij het importeren van het bestand, splitsen de kanalen (doorgelaten licht en fluorescerende signaal) wanneer daarom wordt gevraagd. Uitsluitend het fluorescentiesignaal van de gegevensanalyse. </li><li> Binnen de Fiji-programma, klikt u op het tabblad te analyseren en scroll naar beneden om de optie gereedschappen. Onder de optie gereedschappen, vindt het tabblad ROI manager zegt en klik op het; Een nieuw venster verschijnt. </li><li> Na deze, klikt u op de set metingen onder het tabblad te analyseren. Selecteer de specifieke metingen van belang. Voor de calcium voorbijgaande metingen, gebruik maken van de grijze waarde optie gemiddelde. </li><li> Met de ronde trace tool, beginnen aan de regio&#39;s van belang (ROI) te traceren en klik op &quot;add&quot; op de ROI manager scherm voor elke ROI. Zodra alle cellen van belang zijn getraceerd, in de ROI manager venster selecteert Multi Measure onder de &quot;meer&quot; tab. Vergeet niet om ofwel sla de metingen direct of kopiëren en plakken van al deze metingen in een spreadsheet. </li><li> Open * .txt bestand of Excel spreadsheet van Fiji en de overdracht van de nummers naar een nieuwe Origin werkblad. Let op: U kunt ook gebruik maken van een programma zoals Sigma Plot of Prism voor verdere analyse. </li><li> Binnen het programma Origin gebruiken Plot → Line + Symbol menu voor een overzicht van alle voorbijgaande reacties te observeren. Schakel het reageert cellen. </li><li> Herberekenen trace nummer om tijdschaal (X-as), gebruik Column → Stel Kolom Waarden en vermenigvuldig de kolom trace nummer om de afbeelding collectie frequentie (in ons geval 1.1s). </li><li> Gebruik Analyse → Statistieken over Rijen voor alle geselecteerde opnames te berekenen Mean (Y-as) en Standard Error trace. Plot laatste grafiek voor de huidige groep cellen Plot → Line + Symbol. </li><li> Het mean calcium transient berekening wordt beschreven als volgt. <ol><li> Voor de totale calcium vrijlating binnen de Origin-programma, klik op Grafiek, gebruik dan het menu Analyse → Calculus → integreren. Totaal integraal van oppervlakte onder curve verschijnt in Resultaat Log. </li><li> Voor voorbijgaande kinetiek, klik op Grafiek, gebruik dan het menu: Analyse → Niet-lineaire Curve Fit → Select Data Set (kies een X-as variëren van maximaal tot het einde van voorbijgaande reactie). Start Fitting → Select Function → exponentiële Decay 1 → Gereed. Opmerking: exponentiële montage verschijnt in Graph raam en Resultaat Log. Verkregen gegevens (waarden) vertegenwoordigen in totaal hoeveelheid calcium vrijgegeven, en kinetiek van de kanalen bemiddelde de voorbijgaande reactie. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+2-photon+microscopy+to+understand+albuminuria%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Clin.+Climatol.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Using 2-photon microscopy to understand albuminuria.</a> Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).</li>
<li>Burford, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+podocyte+calcium+in+glomerular+injury+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease.</a> J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).</li>
<li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H%282%29O%282%29+release+in+freshly+isolated+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIlatovskaya%2C+DV+%22J+Vis.+Exp%22">J Vis. Exp</a>. In Press, (2015).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+superoxide+and+angiotensin+II+suppression+in+salt-induced+changes+in+endothelial+Ca2%2B+signaling+and+NO+production+in+rat+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Plekha7+attenuates+salt-sensitive+hypertension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).</li>
<li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318, 558-561 (1985).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elastin+network%3A+its+relationship+with+collagen+and+cells+in+articular+cartilage+as+visualized+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy.</a> J. Anat. 215, 682-691 (2009).</li>
<li>Sathanoori, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+modulates+endothelial+KLF2+through+activation+of+P2X4%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4.</a> Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).</li>
<li>Hall, A. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Multiphoton+Microscopy%3A+Focusing+Light+on+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury.</a> Physiology. 29, 334-342 (2014).</li>
<li>Campese, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+sensitivity+in+hypertension.+Renal+and+cardiovascular+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications.</a> Hypertension. 23, 531-550 (1994).</li>
<li>Cowley, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+nongenetic+determinants+of+salt+sensitivity+and+blood+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure.</a> Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).</li>
<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypertension+susceptibility+loci+on+rat+chromosome+12%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12.</a> Hypertension. 60, 942-948 (2012).</li>
<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+multiple+causative+genes+at+a+single+GWAS+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus.</a> Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).</li>
<li>Mattson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mutation+of+recombination+activating+gene+1+in+Dahl+salt-sensitive+rats+attenuates+hypertension+and+renal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).</li>
<li>Rudemiller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD247+modulates+blood+pressure+by+altering+T-lymphocyte+infiltration+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney.</a> Hypertension. 63, 559-564 (2014).</li>
<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXM+-+a+new+tool+for+mapping+breast+cancer+risk+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment.</a> Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Experimentele Overzicht. Om beter inzicht in de bijdrage van calcium en NO om vasculaire fysiologie, werd een nieuwe methode ontwikkeld voor het meten van [Ca 2+] i en NO binnen gladde spier en endotheelcellen van geïsoleerde intacte aorta. Samen Dit protocol omvat de volgende kritische stappen: 1) Mechanische isolatie en bereiding (niet enzymatische afbraak) van het vat. Het is belangrijk dat het weefsel gezond en intact zoveel mogelijk optimale fysiologische opname bekomen houden. 2) Inc...

Calcium is een essentiële tweede messenger in vasculaire cellen zoals endotheelcellen en gladde spiercellen. Het is de primaire stimulus voor vasculaire contractie en speelt een belangrijke rol bij vaatverwijding, inclusief de effecten bij NO productie in het endotheel. Door de beperkingen van beeldvormende technieken, is het vrijwel onmogelijk om calcium handling te observeren binnen de intacte vat. De ontwikkeling van twee foton imaging systemen en de creatie van nieuwe calcium of NO etikettering kleurstoffen, maakt het mogelijk om de afbeelding op een voldoende diepte en resolutie om te beginnen met calcium dynamiek en NO productie in het vaatstelsel te begrijpen. Twee foton microscopie is onlangs toegepast in weefsels, organen en zelfs hele dierstudies vanwege zijn superieure vermogen om diep weefsels met lage achtergrond fluorescentie en hoge signaal gevoeligheid. 1,2 De smalle spectrum van twee foton excitatie bij het ​​Illumination knooppunt en het gebruik van niet descanned detectors zijn de redenen waarom er twee foton microscopie superieur aan traditionele confocale microscopie. Confocale microscopie kan geen beelden van hoge kwaliteit op de nodige weefsel diepte te wijten aan de auto-fluorescentie en de verstrooiing van out-of-focus licht in de confocale pinhole. Daarom hebben we een methode waarbij twee foton microscoop te meten [Ca 2+] i signalerings- en NO productie in intacte individuele bloedvat cellen met een hoge resolutie en een lage signaal-ruisverhouding ontwikkeld.

<table><tbody><tr><td>DAF-FM</td><td>Life Technologies</td><td>D-23842</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &micro;l in DMSO</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>L-NAME</td><td>Tocris</td><td>0665</td><td></td></tr><tr><td>Olympus upright microscope</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee-OL&nbsp;</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td>Ti:saffier laser 690nm &mdash; 1040nm</td></tr><tr><td>Filters</td><td>Olympus</td><td>FV10-MRL/R&nbsp;</td><td>495 tot 540 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>25&times; water-immersion objectieflens</td><td>Olympus</td><td>XLPL25XWMP</td><td>N.A. 1.05 en werkafstand 2 mm</td></tr><tr><td>Slice Anchor grid&nbsp;</td><td>Warner Instrument&nbsp;</td><td>SHD-27LH</td><td></td></tr><tr><td>Andere basisreagentia&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

twee-foton imaging van intracellulaire ca<sup&gt; 2+</sup&gt; behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd rat aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is een belangrijke regulator van veel fysiologische processen in vasculaire weefsels. De meeste endotheel- en gladde spier functies sterk afhankelijk van veranderingen in intracellulair calcium ([Ca2 +] i) en stikstofoxide (NO). Om te begrijpen hoe de [Ca 2+] i, NO en downstream moleculen worden behandeld door een bloedvat in reactie op vasoconstrictoren en vaatverwijders, ontwikkelden we een nieuwe techniek dat calcium-etikettering van toepassing is (of NO-etikettering) kleurstoffen met twee foton microscopie calcium handling (of NO-productie) in geïsoleerde bloedvaten te meten. Hier beschreven is een stap-voor-stap procedure die laat zien hoe een aorta te isoleren uit een rat, label calcium of NO in het endotheel of gladde spiercellen, en het beeld calcium transiënten (of NO-productie) met behulp van een twee-foton microscoop volgende fysiologische of farmacologische stimuli. De voordelen van de werkwijze zijn multi-fold: 1) Het is mogelijk om gelijktijdigely meten calcium transiënten in zowel endotheelcellen en gladde spiercellen in reactie op verschillende stimuli; 2) Het maakt het mogelijk om beeld endotheelcellen en gladde spiercellen in hun natieve omgeving; 3) Deze methode is zeer gevoelig voor intracellulair calcium of NO veranderingen en genereert hoge resolutiebeelden voor nauwkeurige metingen; en 4) beschreven benadering kan worden toegepast op de meting van andere moleculen, zoals reactieve zuurstofsoorten. Samengevat, de toepassing van twee foton laseremissie microscopie calcium transiënten en NO productie in de endotheel- en gladde spiercellen van een geïsoleerde bloedvat verschaft hoogwaardige kwantitatieve gegevens en bevorderd ons begrip van de mechanismen reguleren bloedvaten te controleren.

Om de bijdrage van calcium vasculaire fysiologie (vasodilatatie en vasoconstrictie) nauwkeurig te beoordelen, werd een protocol ontwikkeld om calcium kleurstoffen laden in zowel endotheelcellen en gladde spiercellen in geïsoleerde intacte aorta. De algemene experimentele opstelling getoond in figuur 1, toont de basisstrategie voor isolatie en bereiding van het vaartuig voor de beeldvorming. Kort na isolering van de aorta van de rat, moet worden gereinigd van vet en bindweefsel en in langsrichting doorge...

Vasculaire celfunctie is afhankelijk van de activiteit van intracellulaire boodschappers. Hier wordt een ex vivo twee-foton beeldvormingsmethode beschreven die de meting van intracellulaire calcium- en stikstofmonoxideniveaus mogelijk maakt in reactie op fysiologische en farmacologische stimuli in individuele endotheel- en gladde spiercellen van een geïsoleerde aorta.

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van calcium of stikstofmonoxide in een vers geïsoleerd bloedvat met behulp van tweefotonmicroscopie. Dit wordt eerst bereikt door mechanische isolatie en preparatie van het bloedvat. Vervolgens wordt het bloedvat geïncubeerd in de calciummarkeringskleurstof of een NO-markeringskleurstof met oniczuur.Vervolgens wordt het vat met een raster en pinnen op een met silicone gecoate schaal gefixeerd om een stabiel beeld te garanderen tijdens twee-foton-imaging. Ten slotte wordt de twee-foton-imaging uitgevoerd en worden de resultaten gekwantificeerd. Deze video laat de stijging van de intracellulaire calciumsignalering in endotheelcellen van geïsoleerde bloedvaten zien als reactie op veranderingen in de extracellulaire calciumconcentratie.Uiteindelijk stelt deze methode onderzoekers in staat om veranderingen in calcium of stikstofoxide in endotheelcellen of gladde spiercellen van een vers geïsoleerd bloedvat te monitoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat deze een betere signaalresolutie en preciezere metingen van de intracellulaire processen in vasculaire weefsels kan bieden. Hier werd deze technologie toegepast in combinatie met klassieke, niet geometrische stijven, om calciumtransiënten en de productie van stikstofoxide in individuele cellen op een geïsoleerde holle orca te meten.Wij geloven dat deze techniek zal bijdragen aan onze kennis over het mechanisme dat de intracellulaire calcium- en oxideniveaus reguleert binnen de verschillende vasculaire celtypen. Tweefoton-excitatiemicroscopie van levende cellen, met name in intacte weefsels zoals bloedvaten, biedt de voordelen van een signaal met hoge resolutie en een lage achtergrondfluorescentie buiten het brandpunt. De nauwe lokalisatie van de tweefoton-excitatie verlicht een enkel brandpuntsvolume in het weefsel, wat de absorptie buiten het brandpunt aanzienlijk vermindert en de lichtverstrooiing beperkt, waardoor we de dynamiek van fluoroforen kunnen in beeld brengen in sterk autofluorescerende weefsels die collageen- en elastinevezels bevatten.Nadat een rattaorta is geïsoleerd volgens het tekstprotocol onder een dissectiemicroscoop, gebruikt u fijne pincetten en microscharen om het vet- en bindweefsel van de aorta te verwijderen. Zodra deze schoon is, snijdt u het orgaan in de lengte door en brengt u het over naar een fysiologische zoutoplossing voor later gebruik. Om de loadingscocktail te bereiden, voegt u 7 µL van een kant-en-klare 1 mM fluo-4 AM-kleurstof- en DMSO-oplossing toe aan 450 µL calciumvrije PSS.Voeg vervolgens 40 µL van een niet op DMSO gebaseerde 10%onic acid-oplossing toe aan de लाद-cocktail om de acetmethylesters te helpen dispergeren en de lading van de calciumkleurstof te verbeteren. Plaats de gedissecteerde aorta's in 500 µL buisjes die de लाद-cocktail bevatten. Bedek de buisjes met aluminiumfolie en plaats deze gedurende één uur op een rotator bij kamertemperatuur.Nadat het tekstprotocol is gevolgd om het aortaweefsel op het oppervlak van een met silicone gecoate schaal vast te pinnen, plaatst u de schaal onder het neusstuk van een rechtopstaande tweefotonmicroscoop en installeert en positioneert u een 25 x waterimmersie-objectief boven het preparaat. Installeer een overeenkomstig emissiefilter in de poort van de microscoop. Activeer met behulp van de software de tweefoton-infraroodlaser en stem de laser-excitatie af op 820 nanometer onder transmissielicht. Lokaliseer de aorta met behulp van de grove objectiefinstelling en focus het objectief op het endotheeloppervlak.Zet de microscoop in de tweefoton-laserscanmodus en controleer of de excitatielaser mode-locked is. De niet-DS-gescande detectoren worden geactiveerd bij een laservermogen van ongeveer 5 tot 10%. Start de live-scanning.Stel tot slot het objectief af om de endotheel- of gladspiercellen scherp te stellen. Leg opeenvolgende beelden vast volgens de experimentele protocoltekst. Sla de beelden op in een formaat dat metadata bevat om beeldverwerking en berekeningen uit te voeren; download en installeer hiervoor het beeldverwerkingspakket Fiji, dat is uitgebracht onder de general public license.Open met behulp van de software een afbeeldingsbestand. Splits vervolgens, wanneer daarom wordt gevraagd, de kanalen voor doorgelaten licht en fluorescentie, zodat alleen de fluorescentiekanalen worden gebruikt voor de data-analyse binnen het Fiji-programma. Klik op het tabblad 'analyze' en scrol naar beneden naar de optie 'tools'.Klik vervolgens op het tabblad ROI manager, waarna er een nieuw venster verschijnt. Klik daarna onder het tabblad analyze op set measurements en selecteer de specifieke metingen van belang. Voor de metingen van de calciumtransiënten.Gebruik de optie 'mean gray value'. Begin vervolgens met de cirkelvormige traceertool de regio's van belang (ROI's) te traceren en klik in de ROI-manager op 'add' voor elke gekozen ROI. Zodra alle relevante cellen zijn getraceerd, selecteert u onder het tabblad 'more' in de ROI-manager de optie 'multi mesure'.Sla tenslotte de metingen direct op of kopieer en plak ze in een spreadsheet en voer de berekeningen uit volgens het tekstprotocol. Door het in deze video beschreven protocol te gebruiken, zijn de endotheelcellen van de aorta eenvoudig te lokaliseren vanwege hun vorm en sterke fluorescentiesignaal. Gladde spiercellen zullen ook zichtbaar zijn in hetzelfde gezichtsveld als de endotheelcellen, wat zal leiden tot een beter begrip van hoe de twee celtypen gezamenlijk maar onafhankelijk reageren op verschillende agonisten en stimuli, om zo het nut van deze methode aan te tonen.Metingen van de respons op acetylcholine of CHA, een potente calciumafhankelijke vasodilator van het endotheel, werden bepaald zoals hier getoond; na toevoeging van een CH neemt de fluorescentie van endotheelcellen toe in vergelijking met cellen in PSS alleen, wat duidt op een snelle stijging van het intracellulaire calciumgehalte dat langzaam terugkeert naar de basislijn. Dit protocol is ook geschikt voor de detectie van endotheelstikstofmonoxideproductie. In dit experiment werden aortale endotheelcellen geladen met DAF FM DAcetaat.De productie van Dye ENO nam op een calciumafhankelijke wijze toe als reactie op een CH-stimulatie, en deze respons werd geblokkeerd met de endotheliale OCH-synthaseremmer L name. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de cardiovasculaire fysiologie. Het gebruik van de hier beschreven experimentele procedure, samen met diverse beschikbare genetisch gemodificeerde diermodellen, biedt nieuwe perspectieven voor de FAR FSA-toepassing van twee-fotonmicroscopie in fundamenteel en translationeel onderzoek.Het gebruik van deze benadering kan u een diepgaand begrip en mechanistisch inzicht geven in specifieke intracellulaire signaleringsroutes binnen de bloedvatcellen. Na het bekijken van deze video leert u hoe u deze techniek kunt toepassen voor real-time monitoring van de calcium- en stikstofoxideniveaus binnen de individuele cellen van vers geïsoleerde bloedvaten.

two-photon-imaging-intracellular-ca2-handling-nitric-oxide-production

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Focus Ca 2 + Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel

Hier een nieuwe regio van belang analyse protocol gebaseerd op het sorteren van best-fit ellipsen toegewezen aan regio's positief signaal binnen twee-dimensionale time beeld lapse sequenties wordt aangetoond. Dit algoritme kan onderzoekers in staat te stellen volledig kunnen onderzoeken fysiologische Ca 2 +-signalen met een minimale input van de gebruiker en vooringenomenheid.

Geautomatiseerde analyse van Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalen in reeksen afbeeldingen

In dit artikel beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige manier aangepast met de fluorescentie kleurstof diaminofluorescein 2-diacetaat (DAF-2DA) en dihydroethidium (DHE) voor en face gelijktijdige detectie en visualisatie van intracellulaire stikstofoxide (NO) en superoxide anion (O 2 .- ) respectievelijk in vers geïsoleerde intacte aorta's van een obesitas muismodel.

En Face Detection van stikstofoxide en superoxide in endotheellaag van Intact slagaders

Momenteel worden de meeste beschikbare calciumindicatoren gebruikt om cytoplasmatische calciumtransienten te kwantificeren als indirecte maatstaven voor calcium dat vrijkomt uit het sarcoplasmatisch reticulum in gekweekte gladde spiercellen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een specifieke FRET-gebaseerde indicator die directe meting van calciumsignalen binnen het sarcoplasmatisch reticulum lumen mogelijk maakt.

Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

Vasculaire calcificatie is een belangrijke voorspeller van en bijdrager aan hart- en vaatziekten bij mensen. Dit protocol beschrijft methoden voor het induceren van calcificatie van gekweekte primaire vasculaire gladde spiercellen en voor het kwantificeren van calcificatie en macrofagenlast in dierlijke aorta's met behulp van near-infrared fluorescentiebeeldvorming.

Verkalking van vasculaire gladde spiercellen en Imaging van Aorta verkalking en Ontsteking

Dit manuscript wordt beschreven in vitro videomicroscopie protocollen voor de beoordeling van de vasculaire functie in rat weerstand van de cerebrale bloedvaten. Het manuscript wordt ook beschreven technieken voor het evalueren van microvessel dichtheid met fluorescently geëtiketteerde lectine en weefsel perfusie met behulp van Laser Doppler flowmetrie.

Evaluatie van vasculaire controlemechanismen met behulp van videomicroscopie van geïsoleerde resistentie slagaders van ratten

Dit manuscript wordt een eenvoudig protocol voor de isolatie van de arteriolen uit het netvlies rat die kunnen worden gebruikt in elektrofysiologische, calcium beeldvorming en druk myography studies beschreven.

Isolatie van retinale arteriolen voor Ex Vivo cel fysiologie Studies

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de coronaire microcirculatie in levend murinehartweefsel te bestuderen door ex vivo monitoring van de arteriële perfusiedruk en -stroom die de druk handhaaft, evenals vasculaire boomcomponenten, waaronder de capillaire bedden en pericyten, omdat de septale slagader wordt ingeblikt en onder druk staat.

Dynamische meting en beeldvorming van haarvaten, slagaders en pericyten in muishart

Leer twee-fotonmicroscopie voor vasculaire biologie om intracellulair calcium en stikstofoxide in endotheelcellen en gladde spiercellen van geïsoleerde rattenaorta te meten. Deze methode biedt hoge resolutie voor signaalwaarneming.

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca 2+ Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta (Video) | JoVE Journal

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca

Meer video's verkennen