Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

Het algemene doel van de volgende procedure is om kanker stamcellen in vitro te vermenigvuldigen met behulp van een anchorage-onafhankelijke kweektechniek en vervolgens de metabolische effecten van nieuwe kanker stamcelgerichte therapieën te testen. Dit wordt bereikt door eerst een menselijk pancreasadenocarcinoomweefselmonster te dissociëren in een enkele celsuspensie. In de tweede stap wordt het tumorweefsel verder gedigesteerd met enzymen en vervolgens gezaaid op een gelatineplaat. Om de fibroblastcellenpopulatie te verwijderen, worden de geïsoleerde kankercellen vervolgens gezaaid in een ultra-lage hechting multi-well plaat en behandeld met het geneesmiddel van belang om de metabolische activiteit en formatie van de tumorbollen te beoordelen.

Uiteindelijk kan het geneesmiddel van belang worden gebruikt in immuungecompromitteerde muizen met patiëntafgeleide xenografts om de effecten van het geneesmiddel in vivo te valideren. Deze methode is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van kanker stamcelbiologie en dient als een eerste stap voor het ontwikkelen van nieuwe kanker stamcelgerichte therapieën. Het demonstreren van de procedure zal ik zijn, een junior onderzoeker aan het Center for Stem Cells in Cancer and Aging bij het Breast Cancer Institute en Tini Cruz, een promovendus uit mijn laboratorium om kanker stamcellen te isoleren van een pancreas ductaal adenocarcinoom in een steriele bioveiligheidskast.

Gebruik een steriele scalpel en pincetten om de menselijke tumor te snijden in een 60 bij 15 millimeter kweekbakje dat één milliliter steriele PBS bevat, en voeg nog drie tot vier milliliter PBS toe zoals nodig is totdat het weefsel volledig gedissocieerd is. Breng de weefselsuspensie over in een steriele conische buis en voeg PBS toe tot een eindvolume van vijf milliliter. Homogeniseer vervolgens het monster mechanisch met een dissociatiecentrifuge en verteer het gehomogeniseerde weefsel met collagenase bij 37 graden Celsius.

Na een uur centrifugeren, de cellen opnieuw opschorten, het pellet op te schorsen in 10 milliliter compleet medium. Filter de celsuspensie door een 40 micrometer zeef en draai de cellen weer neer. Dit keer, opnieuw opschorten het pellet op in vijf milliliter van een CK Na vijf minuten bij kamertemperatuur, verwijder de rode bloedcel lyse buffer door centrifugatie en resuspendeer het pellet in kanker stamcelmedium.

Vervolgens incubeer de cellen op een gelatine gecoate schotel bij 37 graden Celsius om de meeste snel hechtende fibroblastcellen te verwijderen. Na een uur, herstel het supernatant en kwantificeer het aantal levensvatbare pancreaskankercellen om de vorming van de tumorbollen voor kanker te vergemakkelijken. Verdund de cellen in het juiste volume kanker stamcelmedium tot een eindconcentratie van twee keer 10 tot de derde cellen per milliliter en koel ze een paar minuten op ijs.

Vervolgens, na het toevoegen van 500 microliter PBS aan de eerste en laatste rijen van een 24 ultra-lage hechting cellenplaat, resuspendeer de cellen door pipettering en zaai een milliliter cellen per put in de lege putten van de plaat. Behandel vier putten met cellen met het geneesmiddel van belang en ten minste vier negatieve controleputten met voertuig. Vervolgens incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende één week.

Elke dag weer, voeg vers behandeling toe aan ons voertuig voor elk van de putten. Op dag vijf of zeven, beoordeel het aantal gevormde tumorbollen met een geautomatiseerde celteller die de identificatie van grotere structuren mogelijk maakt voor seriële verpakking van de tumorbollen. Op dag zeven, gebruik een 40 micrometer celzeef om de bollen te oogsten.

Vervolgens draai de bollen neer en incubeer ze in één milliliter trypsine gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius om het pellet in een enkele celsuspensie te dissociëren. Vervolgens worden de cellen gedurende nog eens zeven dagen uitgebreid zoals zojuist is gedemonstreerd om de bollen voor te bereiden op de meting van hun reactieve zuurstofsoorten of ROS productie na dissociatie zoals zojuist is gedemonstreerd, draai de bollen neer en resuspendeer het pellet in HBSS met de juiste sonde. Na een 20 minuten incubatie in het donker bij 37 graden Celsius, plaats de cellen op ijs tot analyse door middel van flowcytometrie om de bollen voor te bereiden op de meting van hun zuurstofconsumptie.

Bedek eerst een 96-well kweekplaat met cel- en weefselkleefstof gedurende minimaal 20 minuten bij kamertemperatuur. Dissocieer vervolgens de bollen en trypsine zoals gedemonstreerd. Was vervolgens de plaat twee tot drie keer met water om de overtollige kleefplate te verwijderen, de enkele cellen bij drie keer 10 tot de vijfde cellen per put.

In 150 microliter zuurstofconsumptie assaymedium met glucose en natriumpyruvaat hechten de cellen aan de bodem van de putten door centrifugatie tot 100 keer G is bereikt. Laat de centrifuge stoppen met de break off. Draai vervolgens de oriëntatie van de plaat om en herhaal de draaiing.

Nu incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius zonder koolstofdioxide. Laad ondertussen de cartridge-imports van de assay. A, B en C. Injecteer 25 microliter van een drie, zes en negen millimolar concentratie van het geneesmiddel van belang respectievelijk en importeer D bij 25 microliter van een één micromolar concentratie van de mitochondriale remmer rone.

Wanneer de cellen klaar zijn, kalibreer de cartridge en laad de celkweekplaat. Voer tenslotte de assay uit met het standaardprotocol van mixen en meten. In deze representatieve experimenten verminderde de behandeling van pancreaskanker stamcellen met metformine sterk de grootte en het aantal van de tumorbollen. Verder werden deze reducties getoond door secundaire en tertiaire bollenculturen.

Zelfs wanneer alleen de primaire bollencultuur met metformine was behandeld, zou Metformine als een mitochondriale remmer werken. Inderdaad, in dit experiment werd waargenomen dat het geneesmiddel een snelle en dosisafhankelijke afname van zuurstofconsumptie in de tumorcellen induceerde die correleert met zijn capaciteit om ROS productie te induceren. Belangrijk is dat met metformine behandelde muizen een kortdurige maar significante reductie vertoonden in de progressie van pancreasadenocarcinoom vergeleken met controledieren.

Na he