Name: Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Leer hoe je pancreaskankerstamcellen kweekt met een ankeronafhankelijke cultuurtechniek om metabole effecten van nieuwe therapieën te testen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar gerichte behandelingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het huidige onderzoek werd gesteund door een ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233.460), het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap (FP7 / 2007-2013) onder subsidieovereenkomst Geen 256.974 (EPC-TM-NET) en No 602.783 (CAM-PAC ), de Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 &amp; PI12 / 02.643), en het Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanje). E. Lonardo werd ondersteund door Roche Fellowship. M. Cioffi werd gesteund door de La Caixa predoctorale Fellowship Programme.

Human PDAC tumoren werden verkregen met schriftelijke toestemming (Comunidad de Madrid, Spanje (CP CNIO-CTC-11 -. CI 11/103-E) Implantatie van de menselijke pancreas tumoren in immunodeficiënte muizen behoeft de goedkeuring van Institutional Review Board, alsook institutionele . Animal Care en gebruik Comite (IACUC) De procedures van de pancreas tumor xenograft muismodellen moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en nationale regelgeving (hier ethische commissie van het Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanje; Protocol PA 34_2012). 1. Cultuur Media <ol><li> Bereid compleet medium. <ol><li> Aangevuld RPMI-medium met 10% FBS, 100 eenheden / ml penicilline / streptomycine. 500 ml RPMI voeg 55 ml hitte geïnactiveerd FBS en 6 ml penicilline / streptomycine (10.000 U / ml, 100X). </li><li> Bewaar de compleet medium bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereid CSCs Medium. <ol><li> Vul het serumvrije DMEM / F12 medium met 100 eenheden / ml penicilline / streptomycine en 2 mM glutamine. </li><li> Bewaar de CSC medium bij 4 ° C. B27 (01:50) en 20 ng / ml bFGF zijn onlangs toegevoegd aan het medium vóór elk experiment. Opmerking: De toevoeging van B27 is aangetoond dat de tumor bol vorming vergroten en verscheidene passages van bol culturen 32 ondersteunen. De samenstelling van het medium is een cruciale stap en worden getest voor elk celtype in kweek. We raden het testen zelf-vernieuwing en differentiatie capaciteit van bollen en expressie van CSC markers door flowcytometrie analyseren (dwz CD133 + en CD44 +). </li></ol></li><li> Bereid Extracellulair Flux Assay Medium. <ol><li> Dit specifiek medium is basaal DMEM 5030 met vitaminen, aminozuren en andere supplementen, maar ontbreekt glutamine, glucose, pyruvaat en bicarbonaat. </li><li> Voor de actuele test vult deze medium met 2 mM glutamine, 8 mM glucose en 2 mM natrium- pyruvaat om een ​​volledige mitochondriale metabolische activiteit. Opmerking: De afwezigheid van natriumbicarbonaat essentieel om extracellulaire verzuring van groeiende cellen in kweek nauwkeurig te meten, omdat regelmatig medium bevattende bicarbonaat buffer pH variaties tijdens de assay. Bovendien is het gebruik van een basaal medium kan een strakke regeling van de concentratie van L-glutamine (L-alanyl-glutamine) glucose of natriumpyruvaat noodzakelijk voor verschillende assay omstandigheden en / of toepassingen. </li></ol></li></ol> 2. Sphere vormen Assay en Analyse LET OP: Alle weefselkweek protocollen en manipulaties moeten worden uitgevoerd met steriele technieken met grote aandacht met schone, wasmiddel zonder, steriel glaswerk. Voor het gebruik, pre-warm alle middelgrote en oplossing in een 37 ° C waterbad (als alternatief kunt u gebruik maken van medium en oplossingen voorverwarmd bij RT). Verkrijgen Human PDAC tumoren zoals eerder beschreven 21. <ol><li> Isolatie van CSCs van Human PDAC (Figuur1) <ol><li> In een steriele bioveiligheid kast overdragen humane PDAC weefsel om een ​​60 x 15 mm kweekschaal met 1 ml steriel 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Hak de tumor in kleine stukjes (1-5 mm) met een steriele scalpel en pincet. </li><li> Voeg 1 ml steriel 1X PBS aan de kweekschaal en herhaal tritureren stap totdat het weefsel volledig gedissocieerd regelmatig vergt 3-4 ronden. Breng de weefselsuspensie (top tot een eindvolume van 5 ml met 1 x PBS) in een steriele buis en mechanisch homogeniseren met een dissociator zoals gentleMACS. </li><li> Incubeer het gehomogeniseerde weefsel met collagenase (gebruik 2,5 mg / ml collagenase in 1X PBS) gedurende 60 min bij 37 ° C en centrifugeer 5 min bij 900 x g. Decanteer het supernatant en resuspendeer de celpellets in 10 ml compleet medium. Filter de celsuspensie door een 40 urn zeef en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 900 x g. </li><li> Giet het supernatant en resuspendeer depellet met 5 ml van rode bloedcellen lysis buffer (ammonium-chloride-kalium, ACK) en incubeer de </li><li> Resuspendeer de pellet in CSCs medium plaat op een met gelatine beklede schotel en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Deze stap zal er gewoonlijk fibroblastcellen die snel hechten aan de plaat te verwijderen. </li><li> Verwijder de plaat uit de incubator en zorgvuldig te herstellen cel schorsing en kwantificeren van het aantal levensvatbare (trypan blauw-negatief) cellen met behulp van een hemocytometer. Daartoe meng de suspensie en pipet 20 ul van de suspensie in een Eppendorf buis. Voeg 20 pl (1: 1 verhouding) van trypan blauw om de cellen in de microcentrifugebuis en meng. Pipetteer ongeveer 10 gl van het mengsel op de hemocytometer. </li><li> Tel alle duidelijke cellen binnen de vier kwadranten hoek van de telkamer voor levensvatbare celgetal. Opmerking: De levensvatbaarheid en de opbrengst aan cellen aanzienlijk kan variëren tussen tumormonsters. Voor PDAC monsters levensvatbaarheid varieert regelmatig between 45-70%, en weefsel stukken uit microscopische tumor monster met een diameter van 3-5 mm moet wijken voor ongeveer 5x10 6 levensvatbare cellen. </li></ol></li><li> Sphere Formation Assay en behandeling met metformine <ol><li> Neem het vereiste aantal cellen en voeg de juiste hoeveelheid CSCs medium tot een celconcentratie van 2000 cellen / ml te bereiden. Laat de celsuspensie niet te houden op het ijs niet langer dan 1 uur en goed gemengd voorafgaand aan de beplating. </li><li> Voeg 500 pi 1X PBS aan de eerste en de laatste rij van een 24-wells plaat bevochtiging om te helpen minimaliseren medium verdamping. Zaad de cellen in ultra-low attachment cellen platen bij een dichtheid van 2000 cellen per putje in 1 ml tumor sphere medium (2.000 cellen / ml). Opmerking: Het aantal cellen voor tumor bol vorming assays kunnen variëren tussen tumortypes. </li><li> Behandel minstens 4 putten met het voertuig (negatieve controle) en 4 putten bij elke toegewezen behandeling, bijv., 3 mM van metformine. Place de cellen in een incubator ingesteld op 37 ° C en leveren de cellen met 5% CO2 gedurende één week. OPMERKING: De drager dient niet om de ongestoorde vorming van tumor bolletjes mogelijk worden gewijzigd, maar kan worden aangevuld met groeifactoren dagelijks omdat ze niet stabiel in kweekmedium. </li><li> Om de dag toe te behandelen, bijv., 3 mM metformine of voertuig aan elk van de wells. Beoordelen van het aantal gevormde tumor bolletjes na 5 en / of 7 dagen door toepassing van een geautomatiseerde celtelinrichting die zorgt voor het tellen van grotere structuren (Figuur 2). OPMERKING: alleen tumor gebieden met ten minste 40 urn worden beschouwd en kunnen worden gecategoriseerd als klein (40-80 urn) of grote (80-120 pm), respectievelijk. De resultaten zijn weergegeven als het percentage tumor bollen gedeeld door het aanvankelijke aantal cellen gezaaid (bijvoorbeeld 2000 cellen). </li></ol></li><li> Serial passage van de Eerste Generatie Tumor Spheres <ol&gt; <li> Na 7 dagen incubatie oogsten de tumor bolletjes met een 40 um cel zeef en centrifugeer ze gedurende 5 min bij 900 x g bij kamertemperatuur. </li><li> Distantiëren de pellet van tumor sferen enkele cellen met behulp van trypsine, en opnieuw vouw de verkregen cel celsuspensie nog eens 7 dagen, zoals hierboven is beschreven (zie 2.2). </li></ol></li></ol> 3. Metabolisme Analyse (ROS productie en Oxygen Consumption) <ol><li> ROS productie <ol><li> In dit protocol hebben we carboxy-DCFDA als voorbeeld gebruikt om ROS productie te meten, omdat het is een betaalbare, snelle en meest gebruikte probe voor ROS detectie. Er zijn echter diverse andere sensoren en methoden die kunnen worden gebruikt voor deze test. </li><li> Behandel tumor gebieden met metformine zoals beschreven in 2.2 Voor de toegewezen tijd. Aan het einde van de behandeling, oogst tumor bolletjes met een 40 urn zeef cel, centrifuge de cellen bij 900 g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet in 1 ml trypsin. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. </li><li> Zodra cellen singularized, centrifugeer bij 900 xg en resuspendeer de cellen in HBSS dat 2,5 uM carboxy-DCFDA. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij 37 ° C in het donker. </li><li> Voorafgaand aan Flowcytometrieanalyse beschermen gekleurde cellen van licht als carboxy-DCFDA foto-geoxideerd geven van vals-positieve resultaten kunnen worden. Plaats de buizen op ijs tot analyse. OPMERKING: carboxy-DCFDA fluorescerend na reactie met een verscheidenheid van reactieve zuurstof en stikstof species, gedetecteerd in FL1 (ex 488nm, em 520 nm..). </li></ol></li><li> Zuurstof Verbruik Measurement <ol><li> Voor dit protocol, zullen we de extracellulaire Flux Analyzer systeem van Seahorse Biosciences, als voorbeeld. Coat de gewenste celkweek plaat met een oplossing van 22,4 ug / ml van cellen en weefsels kleefstof voor 20 min bij kamertemperatuur. Spoel de putjes met water 2-3 maal voor de cellen te zaaien. </li><li> Aan het einde van de behandeling, oogst tumor bollen met een 40 pm celzeef Centrifugeer de cellen bij 900 g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet in 1 ml trypsine. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. </li><li> Plaat singularized cellen in de celkweek plaat bij een dichtheid van 30.000 cellen / putje voor een 96 putjesplaat (eindvolume: 150 pi). Resuspendeer de cellen in Zuurstofverbruik assay medium bevattende 8 mM glucose en 2 mM natrium- pyruvaat. </li><li> Centrifugeer de cellen op de bodem van de put door middel van spin centrifugeren van de putjes tot 100 xg bereikt is en laat de centrifuge stoppen met de rem uitgeschakeld. Keer de oriëntatie van de plaat en herhaal het proces. Breng de plaat tot een 37 ° C incubator zonder toevoeging van CO2 gedurende 30 minuten. </li><li> Ondertussen bereidt de cartridge voor de test. Elk goed heeft 4 verschillende injectoren te laden (25 ul / poort): <ol><li> Poort A: metformine. Tot een uiteindelijke concentratie van 3 mM te verkrijgen in de put, stelt een 8x oplossing (24 mM) en het uiteindelijke volume wordt 175ul na injectie van de haven A. </li><li> Poort B: metformine. Om 3 mM voegen en het verkrijgen van een eindconcentratie van 6 mM in de put, stelt een 9x oplossing (27 mM) en het uiteindelijke volume 200 pl na injectie van port B. </li><li> Port C: metformine. Om 3 mM voegen en een eindconcentratie van 9 mM verkrijgen in de put, stelt een 10x oplossing (30 mM) en het uiteindelijke volume wordt 225 gl na injectie van port C. </li><li> Port D: rotenone 11 uM, 1 uM te verkrijgen als uiteindelijke concentratie in de put (11x). Opmerking: rotenone eventuele resterende mitochondriale activiteit volledig remt. </li></ol></li><li> Kalibreren van de cartridge en laadt de celkweek plaat. Voer de test met de standaard protocol van het mengen en meten. </li><li> Bereken het percentage remming van de totale mitochondriale respiratie bereikt metformine als het percentage remming verkregen met rotenon (ingesteld op 100%). </li></ol></li></ol> 4.Xenograft Model voor menselijk alvleesklier- in Immunogecompromitteerde Muizen OPMERKING: Bestel voldoende aantallen vrouwelijke athymische naakt of andere, meer immunogecompromitteerde muismodellen zoals NOD-SCID, SCID-beige of NSG voor de experimenten 33. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten voor het experiment en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik. Voor subcutane tumoren gebruikten we minimaal 4 muizen per staat met een tumor per flank in totaal 8 tumors. <ol><li> Xenograft Transplantatie <ol><li> Bereid tumor stukken uit de menselijke alvleesklier exemplaren kankerweefsel. Breng de tumor in een petrischaal en ontleden van het weefsel in kleine stukjes (2 mm in diameter, ~ 8 mm 3) met een scalpel en pincet om het weefsel vast te houden. Dompel de verkregen stukjes in geleiachtige eiwitmengsel oplossing op ijs bewaard. </li><li> Verdoven muizen met behulp van 1-3% isofluorane of andere inhalatieve of injecteerbare anesthetica. OPMERKING: Voordat u begint met een chirurgische procedure, ervoor te zorgen dat de muizen volledig zijn bewustzijn verloor door het stimuleren van de buikhuid of sleept met een paar splinter tang. Breng oogzalf tot droog voorkomen. </li><li> Als de verdoving eenmaal in werking is getreden, veeg de achterkant van de muizen met-ethanol bevat huid antiseptische. Dien buprenorfine (0,05 mg / kg BW) vóór een chirurgische ingreep postoperatieve analgesie waarborgen. </li><li> Til het rugvel met een tang, maak een 0,7-1,0 cm lange incisie met steriele micro schaar en vervolgens bot bereidt een subcutane pocket, waarbij een stuk van patiënt afgeleide pancreaskanker weefsel is geplaatst (~ 8 mm 3). </li><li> Sluit de wond met 1-2 huid nietjes. Verwijder ze na 7 dagen. Breng de muizen om hun kooien en bewaar ze op een verwarming pad of onder een warmtelamp totdat ze weer volledig actief. </li><li> Na tumor implantatie, bewaken de muizen ten minste twee keer per week voor de groei van de tumor en de algemene tekenen van voortvloeiende morbiditeit zoals gegolfde bont, hunched houding en immobiliteit. </li><li> Wanneer tumoren een gemiddelde grootte van 200 mm3 hebben bereikt, worden muizen gerandomiseerd respectievelijke behandelingen. Dien voertuig of metformine dagelijks via ip injecties (150 mg / kg BW) of via het drinkwater (150 mg / kg BW) met vergelijkbare effecten van de behandeling. </li><li> Monitor tumorlast met een schuifmaat en bereken tumorvolume keer per week (meting van tumorvolume = 1/2 lengte x ademhaling x breedte). </li><li> Offer de muizen eenmaal tumoren 1 cm in diameter hebben bereikt of muizen beginnen enige tekenen van ernstige pijn of ziekte zoals hierboven gespecificeerd. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Whipple, C. A., Young, A. L., Korc, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KrasG12D-driven+genetic+mouse+model+of+pancreatic+cancer+requires+glypican-1+for+efficient+proliferation+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A KrasG12D-driven genetic mouse model of pancreatic cancer requires glypican-1 for efficient proliferation and angiogenesis.</a> Oncogene. 31 (20), 2535-2544 (2012).</li>
<li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li>
<li>Rahib, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projecting+cancer+incidence+and+deaths+to+2030%3A+the+unexpected+burden+of+thyroid%2C+liver%2C+and+pancreas+cancers+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States.</a> Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).</li>
<li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 62 (1), 10-29 (2012).</li>
<li>Burris, H. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+survival+and+clinical+benefit+with+gemcitabine+as+first-line+therapy+for+patients+with+advanced+pancreas+cancer%3A+a+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas cancer: a randomized trial.</a> J Clin Oncol. 15 (6), 2403-2413 (1997).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erlotinib+plus+gemcitabine+compared+with+gemcitabine+alone+in+patients+with+advanced+pancreatic+cancer%3A+a+phase+III+trial+of+the+National+Cancer+Institute+of+Canada+Clinical+Trials+Group%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Erlotinib plus gemcitabine compared with gemcitabine alone in patients with advanced pancreatic cancer: a phase III trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group.</a> J Clin Oncol. 25 (15), 1960-1966 (2007).</li>
<li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+III+randomized+comparison+of+gemcitabine+versus+gemcitabine+plus+capecitabine+in+patients+with+advanced+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase III randomized comparison of gemcitabine versus gemcitabine plus capecitabine in patients with advanced pancreatic cancer.</a> J Clin Oncol. 27 (33), 5513-5518 (2009).</li>
<li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> N Engl J Med. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li>
<li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> N Engl J Med. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li>
<li>Gourgou-Bourgade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+FOLFIRINOX+compared+with+gemcitabine+on+quality+of+life+in+patients+with+metastatic+pancreatic+cancer%3A+results+from+the+PRODIGE+4%2FACCORD+11+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Impact of FOLFIRINOX compared with gemcitabine on quality of life in patients with metastatic pancreatic cancer: results from the PRODIGE 4/ACCORD 11 randomized trial.</a> J Clin Oncol. 31 (1), 23-29 (2013).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Garcia-Silva, S., Frias-Aldeguer, J., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+%26+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Stem cells & pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 13 (2), 110-113 (2013).</li>
<li>Hermann, P. C., Mueller, M. T., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+stem+cells--insights+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer stem cells--insights and perspectives.</a> Expert Opin Biol Ther. 9 (10), 1271-1278 (2009).</li>
<li>Hermann, P. C., Huber, S. L., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+cancer+stem+cells%3A+a+new+target+for+anti-cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Metastatic cancer stem cells: a new target for anti-cancer therapy.</a> Cell Cycle. 7 (2), 188-193 (2008).</li>
<li>Hermann, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+cancer+stem+cells+determine+tumor+growth+and+metastatic+activity+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of pancreatic cancer stem cells.</a> Cancer Res. 67 (3), 1030-1037 (2007).</li>
<li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li>
<li>Gallmeier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ataxia+telangiectasia-+and+Rad3-related+function+abrogates+the+in+vitro+and+in+vivo+tumorigenicity+of+human+colon+cancer+cells+through+depletion+of+the+CD133%28%2B%29+tumor-initiating+cell+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ataxia telangiectasia- and Rad3-related function abrogates the in vitro and in vivo tumorigenicity of human colon cancer cells through depletion of the CD133(+) tumor-initiating cell fraction.</a> Stem Cells. 29 (3), 418-429 (2011).</li>
<li>Hermann, P. C., Bhaskar, S., Cioffi, M., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors.</a> Semin Cancer Biol. 20 (2), 77-84 (2010).</li>
<li>Mueller, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+targeted+treatment+to+eliminate+tumorigenic+cancer+stem+cells+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).</li>
<li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal%2FActivin+signaling+drives+self-renewal+and+tumorigenicity+of+pancreatic+cancer+stem+cells+and+provides+a+target+for+combined+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal/Activin signaling drives self-renewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Met+is+a+marker+of+pancreatic+cancer+stem+cells+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">c-Met is a marker of pancreatic cancer stem cells and therapeutic target.</a> Gastroenterology. 141 (6), 2218-2227 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li>
<li>Schepers, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+reveals+Lgr5%2B+stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337 (6095), 730-735 (2012).</li>
<li>Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+mode+of+tumour+growth+by+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the mode of tumour growth by clonal analysis.</a> Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).</li>
<li>Shaw, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+LKB1+mediates+glucose+homeostasis+in+liver+and+therapeutic+effects+of+metformin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in liver and therapeutic effects of metformin.</a> Science. 310 (5754), 1642-1646 (2005).</li>
<li>Martin-Castillo, B., Vazquez-Martin, A., Oliveras-Ferraros, C., Menendez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+and+cancer%3A+doses%2C+mechanisms+and+the+dandelion+and+hormetic+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Metformin and cancer: doses, mechanisms and the dandelion and hormetic phenomena.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1057-1064 (2010).</li>
<li>Honjo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+sensitizes+chemotherapy+by+targeting+cancer+stem+cells+and+the+mTOR+pathway+in+esophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Metformin sensitizes chemotherapy by targeting cancer stem cells and the mTOR pathway in esophageal cancer.</a> Int J Oncol. 45 (2), 567-574 (2014).</li>
<li>Wurth, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+selectively+affects+human+glioblastoma+tumor-initiating+cell+viability%3A+A+role+for+metformin-induced+inhibition+of+Akt%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability: A role for metformin-induced inhibition of Akt.</a> Cell Cycle. 12 (1), 145-156 (2013).</li>
<li>Cufi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin-induced+preferential+killing+of+breast+cancer+initiating+CD44%2BCD24-%2Flow+cells+is+sufficient+to+overcome+primary+resistance+to+trastuzumab+in+HER2%2B+human+breast+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Metformin-induced preferential killing of breast cancer initiating CD44+CD24-/low cells is sufficient to overcome primary resistance to trastuzumab in HER2+ human breast cancer xenografts.</a> Oncotarget. 3 (4), 395-398 (2012).</li>
<li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+targets+the+metabolic+achilles+heel+of+human+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metformin targets the metabolic achilles heel of human pancreatic cancer stem cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76518(2013).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+B27+supplement+on+promoting+in+vitro+propagation+of+Her2%2Fneu-transformed+mammary+tumorspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotech+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of B27 supplement on promoting in vitro propagation of Her2/neu-transformed mammary tumorspheres.</a> J Biotech Res. 3, 7-11 (2011).</li>
<li>Ishizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-initiating+cells+are+rare+in+many+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-initiating cells are rare in many human tumors.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 279-282 (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).</li>
<li>Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+characterization+of+murine+prostate+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (1), 181-186 (2007).</li>
<li>Seaberg, R. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rodent+neurogenic+regions%3A+the+ventricular+subependyma+contains+neural+stem+cells%2C+but+the+dentate+gyrus+contains+restricted+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells, but the dentate gyrus contains restricted progenitors.</a> J Neurosci. 22 (5), 1784-1793 (2002).</li>
<li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Mol Cancer Ther. 8 (2), 310-314 (2009).</li>
<li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+%27side+population%27+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A distinct 'side population' of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li>
<li>Miranda-Lorenzo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+autofluorescence%3A+a+biomarker+for+epithelial+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells.</a> Nat Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende rente te onthullen.

Met de opkomst en de daaropvolgende validatie van de CSC concept voor veel tumoren, is het gebied van de ontwikkeling van geneesmiddelen een nieuwe impuls gekregen, met het potentieel voor de ontwikkeling van efficiëntere behandelingen van kanker en vervolgens het verminderen van het risico voor de ziekte van recidive. Echter, het veld CSC is nog in een vroeg stadium en er moet meer in termen van begrip CSC oorsprong en voortplanting, en hun rol in het vormgeven van de tumor architectuur en het bevorderen van metastase te bereiken. In deze context is het gebruik van reproduceerbare en betekenisvolle CSC assays en geïnformeerde interpretatie van verkregen data vormt een essentieel onderdeel van onze kennis van CSC biologie. Van vele biologische perspectieven, heeft bol vorming ontpopt als een zeer waardevolle test; Toch gebruikers moeten zich bewust zijn van de beperkingen om hun experimentele resultaten goed te interpreteren. Een belangrijk aspect om te overwegen nog voordat de evaluatie van de bol formatiegegevens is de oorsprong van het onderzochte monster, aangezien de verkregen uit verse patiënt afgeleide monsters leidt significant verschillend van die verkregen uit gevestigde kankercellijnen zijn. Classic bol vorming assays omvatten enten cellen bij klonale dichtheid in ultralaag bevestigingsplaten en evalueren bol formatie in aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en / of basische fibroblastgroeifactor (b-FGF) verrijkt, maar serumvrij medium 21, 34. Het kweekmedium samenstelling is ook een belangrijk punt van overweging. In onze ervaring ontdekten we dat DMEM / F12 aangevuld met B27, bFGF en glutamine in de afwezigheid van serum een ​​optimaal medium te groeien, uitbreiden en onderhouden van de CSC in ongedifferentieerde omstandigheden. We vonden dat in deze cultuur toestand (gemiddeld en ophanging) de cellen brengen grote hoeveelheden kanker stamcellen markers (inclusief CD133 +, CD44 + en CD24 +) en niet-differentiatie geassocieerde eiwitten niet uitdrukken (CK-20 En CK-19). Een van de fundamentele uitgangspunten van deze assays is dat elke bol klonaal, dwz een bol gevolg van de groei van een stamcel. Echter, bollen zijn intrinsiek dynamische structuren die gevoelig zijn voor zelfs smelten bij lage dichtheid zaaien 35 zijn. Plating cellen is een cruciale stap in het protocol en de dichtheid van een cel / put kan zeker de aggregatie probleem te omzeilen. Maar zelfs voor prospectief naargelang voorouders, dit regelmatig resulteert in een zeer lage vorming sfeer te wijten aan lage intrinsieke bol vorming activiteit en kan ook worden toegeschreven aan beperkt autocriene stimulatie als gevolg van verwatering effecten. In onze ervaring zagen we dat slechts 30% van de cellen uitgeplaat kunnen bolletjes vormen. We raden het gebruik van ten minste 100 cellen / putje om consistente en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Andere kweekmethoden groei CSC zijn gebaseerd op vaste of halfvaste 3D cultures (bijvoorbeeld op basis van matrigel, collageen of methylcellulose). Deze werkwijzen zijn gebruikt voor celbeweging en daaropvolgende celaggregatie 36 beperken. Echter, elk van deze matrices beren hun eigen beperkingen. Bijvoorbeeld, matrigel een oplosbaar basale membraan geïsoleerd uit de Engelbreth-Holm-Swan (EHS) tumor en hoewel het extract lijkt de complexe extracellulaire tumoromgeving in veel weefsels, doet meerdere min of meer gedefinieerde groeifactoren die vaak maakt mechanistische bevatten studies regulerende elementen zeer moeilijk. Een ander punt van overweging is dat bol vormen capaciteit en stamcel functies niet uitwisselbaar termen 34. Hoewel bepaalde stamcellen en voorlopercellen bleken te vertonen bol vormend vermogen 37, niet bollen in vitro genereren niet in vivo stam / voorlopercellen functie uitgesloten. Bijvoorbeeld kan rustende stamcellen eenvoudigweg niet reageert op extracellulaire signalen die degeselecteerd in vitro kweekomstandigheden. Zo is op lange termijn in vitro en in vivo zelfvernieuwingscapaciteit van gezuiverd celpopulaties, bij voorkeur tijdens de seriële passage, moeten worden beoordeeld om te bewijzen of te weerleggen stamcel functie. In dit verband heeft de mogelijkheid om prospectief gelijktijdig propageren diverse populaties van stamcellen en progenitorcellen is een cruciaal aspect van de bol vormende assay en maakt deze assay zeer waardevol voor het gebied CSC; zolang de beperkingen in het achterhoofd worden gehouden voor de interpretatie van de verkregen gegevens. Sphere-vormende assays zijn op grote schaal gebruikt om achteraf te identificeren stamcellen op basis van hun vermogen tot zelfvernieuwing en differentiatie bij de enkele cel niveau in vitro. De ontdekking van merkers die de toekomstige isolering van stamcellen en hun nakomelingen toelaten uit hun in vivo niche kunnen de functionele eigenschappen van gezuiverde populaties te definiëren. De combination van bol formatie test en de FACS is een succesvolle strategie om cellen van vast weefsel isoleren of verrijken specifieke subpopulaties van PDAC in de cultuur. Zo gelijktijdige expressie van EpCAM, CD24 en CD44 definieert een subpopulatie van CSCs bijwerken zelfvernieuwing, differentiëren en start een tumor, die de heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor. Hermann et al. toonde aan dat CD133 + cellen bezaten verhoogd proliferatief vermogen en CSC voorzien 15. Andere merkers zijn ook gebruikt voor de karakterisering van CSCs: ALDH- 1 (Aldehyde dehydrogenase-1) expressie is geassocieerd met zeer tumorigene cellen in pancreaskanker 38; cellen kunnen het DNA kleurstof Hoechst 33342 uitsluiten, genaamd side population (SP) cellen, hebben bewezen vermogen om tumoren te 39 initiëren. Recent toonden we aan dat een subcellulair autofluorescentie compartiment kenmerkt een duidelijke populatie van menselijke cellen met exclusieve CSC trekken over verschillende tumortypes40. Hoewel geen van deze merkers blijkt een zuivere populatie van CSCs selectief karakteriseren steeds complexere combinaties van markers gebruikt moeten worden voor FACS zuiveren verfijnder celpopulaties. Veel vragen nog steeds over de precieze rol van CSCs in de oorsprong, progressie en resistentie van tumoren. Bijvoorbeeld, een manier om de kwestie van klonale evolutie pakken te bepalen of en hoe een CSC initieert een tumor, kon de patiënt te analyseren in verschillende stadia van de ziekte, en in het bijzonder volgen de aantallen CSCs tijdens en na de behandeling. Door het beantwoorden van deze vragen, kunnen we betekenisvolle vooruitgang van onze kennis van CSCs in solide tumoren te maken en drug therapieën om uiteindelijk te voorkomen progressie van de tumor en terugval te ontwikkelen.

Pancreatische ductale adenocarcinoma (PDAC) is een van de meest agressieve vaste tumoren. Het is momenteel de 4e meest voorkomende kanker-gerelateerde dood in de westerse samenleving en zal naar verwachting stijgen naar de 2e meest voorkomende oorzaak in de komende tien jaar (~ 400.000 sterfgevallen per jaar wereldwijd) 3 .Op moment van de diagnose 90% van de patiënten aanwezig met gevorderde ziekte, waarbij een 5-jaars overleving van minder dan 5% heeft. Deze overlevingskans is teleurstellend gebleven ondanks steeds intensief onderzoek activiteiten 4 in de afgelopen 50 jaar onveranderd. Van de resterende 10% van de patiënten die in potentie &#39;genezen&#39; ziekte door chirurgische resectie, wordt 80% sterven aan herhaling binnen 5 jaar. Al vele jaren de standaard van zorg voor gevorderde ziekte is geweest gemcitabine monotherapie, maar dit geeft slechts een marginale overlevingsvoordeel 5. Kleine verbeteringen op korte termijn overleven zijn bereikt door de toevoegingvan erlotinib 6 of capecitabine 7, maar de overlevingsvoordeel in de orde van weken de mediane algehele overleving nog ~ 6 maanden. Onlangs hebben meer bemoedigende resultaten naar voren gekomen voor gemcitabine / NAB -paclitaxel 8 en de FOLFIRINOX combinatie regime 9,10. Deze therapieën verbeteren mediane overleving met bescheiden 2 en 4 maanden respectievelijk, maar zijn zeer giftig en lange termijn overlevenden steeds hoge uitzondering. Hoewel de behandeling biedt het potentieel voor verbetering, deze zijn giftig regimes waar veel patiënten niet reageren of alleen tonen incrementele verbetering in de algemene overleving. Als gevolg daarvan, is er een dringende noodzaak om de huidige therapieën aan te vullen en om nieuwe, waarschijnlijk multimodale therapeutische benaderingen te ontwikkelen. Tumor Heterogeniteit Het wordt steeds duidelijker dat kanker heterogeniteit is niet alleen beperkt tot verschillende evolutionaire subklonen within elke tumor 11, maar ook gedreven door fenotypische en functionele heterogeniteit en plasticiteit binnen elke subkloon 12. Zogenaamde kanker stamcellen (CSC) of tumor bevorderen cellen zijn verantwoordelijk voor intraclonal heterogeniteit 13-16. Concreet CSCs vormen een subset van kankercel, waarvoor wij en anderen overtuigend bewijs heeft geleverd, tot aan de enkele cel, die zij vertegenwoordigen de wortel van de ziekte door die aanleiding geven tot alle gedifferentieerde nakomelingen binnen elke kanker subkloon 17. Wat nog belangrijker is, deze cellen zijn essentieel voor metastatisch gedrag en tevens een belangrijke bron voor terugval van ziekte na behandeling, zelfs bij relatief doeltreffend drugs kan induceren initiële tumorregressie (bijv nab -paclitaxel) 15,18-20. Het is belangrijk op te merken dat CSCs niet noodzakelijkerwijs bona fide stamcellen, noch ze ontstaan ​​uit weefsel stamcellen in vele gevallen, maar ze hebben acquired bepaalde functies van stamcellen. De meeste hiervan zijn functioneel vermeld, bijvoorbeeld CSCs zijn uitgerust met een onbepaalde zelfvernieuwingscapaciteit waardoor ze resistent zijn tegen conventionele chemotherapie, en vertonen verhoogde invasiviteit die metastatische activiteit bevordert. Functionele Cancer Stem Cell Fenotypes De functionele fenotype van CSCs is gebaseerd op hun vermogen om zichzelf te vernieuwen, dat kan in vitro worden getest met behulp van seriële bol vorming en de vorming van kolonies assays respectievelijk. Nog belangrijker, CSCs staat zelfvernieuwing beer in vivo tumorgeniciteitsonderzoek die kan worden getest door beperkende verdunning in vivo assays als de uiteindelijke functionele uitlezing voorkeur tijdens seriële transplantatie indicatief exclusieve langlopende tumorigeniciteit. Bovendien is er heterogeniteit in de CSC compartiment met een duidelijke subpopulatie van CSCs met het exclusieve mogelijkheid om aanleiding te geven tot metastasen die niet alleen eendirect gevolg van hun exclusieve in vivo tumorgeniciteit. Inderdaad, metastastitic CSCs verwerven het vermogen om de primaire tumor te ontwijken, overleven anoikis en uiteindelijk translocatie en zaden secundaire plaatsen. Deze geavanceerde functionele vermogens kunnen worden getest in vitro gebruik van gewijzigd invasie assays en in vivo assays gebruikt metastase. Targeting kankerstamcellen Wij en anderen hebben overtuigend bewijs dat behandelingen gericht op de grootste tumor van gedifferentieerde PDAC cellen, zelfs in combinatie met stroma targeting agents voorzien, niet een grote invloed op de progressie van de tumor en de daaropvolgende resultaat niet hebben, tenzij in combinatie met een CSC-targeting strategie 21, 22. Aldus, gebaseerd op de cruciale functies van CSCs in ziekteprogressie en resistentie tegen therapie, die cellen zou een essentiële component voor elke nieuwe behandeling 18,20 betekenen, maar een veel beter begrip o vereisenf van de regelgeving machinerie van CSCs. Hoewel CSCs en hun meer gedifferentieerde nakomelingen dragen identieke genetische grond staten met betrekking tot genetische veranderingen, CSCs vertonen onderscheiden en dus epigenetisch vastberaden genexpressie profielen die modules delen met pluripotente stamcellen. De meeste genen die betrokken zijn bij het genereren geïnduceerde pluripotente stamcellen (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) zijn niet alleen gekoppeld aan kanker, maar hun expressie wordt meestal beperkt tot de CSCs compartiment. Bovendien is de functionele relevantie van CSCs door het verlies-van-functie experimenten met genetische instrumenten voor het richten CSCs zijn nu stevig gevestigd de CSC concept voor verschillende soorten kanker 23-25. Terwijl de meeste van deze benaderingen zijn gebaseerd op muismodellen en zijn dus niet gemakkelijk overdraagbaar in de kliniek, ze bieden proof-of-concept voor de potentiële klinische relevantie van targeting CSCs in combinatie met bulk tumorcellen. Studeren kankerstamcellen In Vitro naar hun Achilles &#39;Heel Identificeer Om nieuwe en klinisch toepasbare manieren identificeren voor het richten CSCs, worden de functies geregeld bestudeerd in vitro en bol vorming op grote schaal gebruikt in deze context. Oorspronkelijk ontwikkeld voor het bestuderen van normale stamcellen biologie, waaronder zelfvernieuwing en differentiatie capaciteit, was dit assay later aangepast CSCs in vitro onderzoeken en is gebruikt voor het onderzoeken CSCs geïsoleerd uit PDAC 20. We hebben ontdekt dat tumor bollen gevormd uit primaire menselijke PDAC cellen dragen alle duidelijke kenmerken van CSCs, hetgeen wijst zij bona fide pancreas CSCs 21 bevatten. Zo is de tumor bol assay is een krachtig hulpmiddel voor het screenen op effectievere behandelingen in vitro, maar de resultaten verder moeten worden geëvalueerd bij strengere in vivo assays. Inderdaad, moeten de gegevens gegenereerd met deze in vitro test worden behandeld met grote voorzichtigheid als the test kan onderhevig zijn aan fouten. Zeer gestandaardiseerde protocollen, waaronder geautomatiseerde telling van gevormde bolletjes, moeten worden vastgesteld om ervoor te zorgen reproduceerbare en voorspellende data. In deze context, recent gebruikte we deze test pancreas CSCs afgeleid van een diverse set van primaire humane PDACs screenen en toonde aan dat deze cellen zeer gevoelig voor metabole herprogrammering door anti-diabetische verbinding metformine. Eerder had metformine is aangetoond dat kankercellen expansie door indirecte activering van AMP-geactiveerd proteïnekinase (AMPK) signalering en daaropvolgende remming van mTOR 26 uit waardoor eiwitsynthese en celproliferatie 27 remmen. Naast deze effecten op de tumor bulk populatie, hebben wij en anderen vonden dat metformine kan richten en zelfs elimineren de CSC subpopulatie in een aantal vaste tumoren zoals borstkanker, slokdarmkanker, glioblastoma en pancreaskanker 28-31 &lt;/ Sup&gt;. Zo metformine vertegenwoordigt een veelbelovende en veilige nieuwe therapeutische strategie voor de verschillende vormen van kanker met momenteel onvervulde medische noodzaak. Bovendien gebruiken bol vorming als een manier om verrijken CSCs we aangetoond dat primaire effecten van metformine op pancreas CSCs was onafhankelijk van AMPK activering en meestal gebruikt zijn bescheiden mitochondriale toxiciteit (via remming van complex I), die blijkbaar was letaal voor de subset van CSCs alleen. Voor deze laatste konden we hun cellulaire zuurstofconsumptie en mitochondriale ROS productie beoordeelt indicatoren van de toxiciteit van het geneesmiddel op cellulair niveau. Vervolgens kunnen deze in vitro gegevens worden gevalideerd in preklinische muismodellen en zelfs in significant verlengde overleving 31. De hier gepresenteerde methode zorgt voor de snelle generatie drug gevoeligheid profielen voor CSCs, met inbegrip van studies over de effecten ervan op CSC metabolisme. We bieden nu uitgebreid experimentele details over de gebruikte comcomplementaire in vitro en in vivo procedures.

<table><tbody><tr><td>Counting Chamber/Hemocytometer&nbsp;</td><td>Hausser Scientific Co</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement</td><td>Roche Innovatis</td><td>AG CASY Model TTC 45,60,150 &mu;m</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Dissociator&nbsp;</td><td>Miltenyi Co</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C Tubes&nbsp;</td><td>Miltenyi Co</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>24-well Ultra-low Attachment Plates&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>100-mm tissue culture dishes&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>15-ml polypropylene conical tube&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50-ml polypropylene conical tube&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml sterile tubes&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Sterile petri dishes, 10 cm dishes&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>26 G needles&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>100 ul Hamilton Syringe&nbsp;</td><td>Hamilton Syringe Co</td><td>81075</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type IV&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin solution, 100X&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Metformin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D150959-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM, 100X&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>100mM Sodium Pyruvate solution&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse Assay medium&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin solution, 0.05%&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement 50x&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium/F12&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1x Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate)&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>C-369</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70% (vol/vol)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>IsoVet, Braun</td><td>571105.8</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>35620</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Cotton tipped applicator</td><td>&nbsp;Puritan medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>XF96e Extracellular Flux analyzer</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator with CO2 input&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Splinter forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caliper</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studeren alvleesklier- stamcel kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatische ductale adenocarcinoma (PDAC) een subset van uitsluitend tumorigene kanker stamcellen (CSC), waarvan is aangetoond dat ze tumor initiatie, metastase en resistentie tegen radio- en chemotherapie rijden. Hier beschrijven we een specifieke methode voor het kweken van primaire menselijke pancreas CSCs als tumor bollen in verankering-onafhankelijke omstandigheden. Cellen worden gekweekt in serumvrij, niet hechtende voorwaarden om te verrijken CSCs terwijl de meer gedifferentieerde nakomelingen niet overleven en prolifereren gedurende de eerste tijd na zaaien van enkele cellen. Deze test kan worden gebruikt voor het schatten van het percentage CSCs in een populatie van tumorcellen. Zowel size (die kan variëren 35-250 micrometer) en aantal tumor bolletjes gevormd vertegenwoordigt CSC activiteit geherbergd in beide bulk populaties van gekweekte kankercellen of vers geoogst en gedigereerd tumors 1,2. Met behulp van deze test, we onlangs bleek dat metformine selectief ablateert pancreatic CSCs; een bevinding die vervolgens verder werd bevestigd door aan te tonen verminderde expressie van pluripotency geassocieerde genen / oppervlak markers en verminderde in vivo tumorigeniciteit van metformine behandelde cellen. Als laatste stap voor preklinische ontwikkeling we behandelde muizen met gevestigde tumoren met metformine en vond aanzienlijk verlengde overleving. Klinische studies testen het gebruik van metformine bij patiënten met PDAC zijn nog gaande (bv NCT01210911, NCT01167738 en NCT01488552). Mechanistisch, vonden we dat metformine veroorzaakt een fatale energiecrisis in CSCs door verbetering van reactieve zuurstof species (ROS) productie en reducerende mitochondriale transmembraanpotentiaal. Daarentegen werden niet-CSC niet geëlimineerd door behandeling met metformine, maar onderging omkeerbare celcyclus. Daarom onze studie dient als geslaagd voorbeeld van het potentieel van in vitro gebied formatie als screeningsmethode om verbindingen die potentieel doelwit CSC identificerens, maar deze techniek verder in vitro en in vivo geldig worden om valse ontdekkingen elimineren.

Metformine selectief richt Pancreatic CSCs We hebben eerst de functionele effecten van metformine behandeling op de in vitro zelfvernieuwingscapaciteit van CSCs onderzocht. Hiertoe we bol vorming assays uitgevoerd met primaire humane pancreatische kankercellen geïsoleerd van PDAC weefsel resectie tijdens chirurgie. We zagen dat metformine sterk verminderde de grootte van gevormde bolletjes (Figuur 1A). Dit was waarschijnlijk door remming van de groei van de nakomelingen van de CSC, waaraan nog steeds het grootste deel van de cellen gevonden in gebieden zij alleen zijn verrijkt CSCs. Inderdaad, hoe langer bolletjes gekweekt zonder passage van hoe uitgebreider de expansie van meer gedifferentieerde nakomelingen zullen zijn. Zo vonden we metformin het aantal feitelijk gevormde bolletjes ongeacht hun grootte aanzienlijk dalen, die zich op een dosis-afhankelijke wijze suggereert sterke remming van de zelfvernieuwingscapaciteit van CSC&#39;s (data niet getoond). We vonden dat metformine bij 3 mM significant af van het aantal bolletjes gevormd (Figuur 1B). Om strengere studie van de lange-termijn effecten van metformine op de zelfvernieuwingscapaciteit van CSCs, we vervolgens gepasseerd het gevormde primaire werelden in secundaire en tertiaire sferen. Hoewel slechts primaire bolletjes werden behandeld met metformine, werd de vorming van gebieden in de tweede en derde doorgangen sterk toenemende mate verminderd, wat impliceert metformine inderdaad onomkeerbaar elimineerde de meeste CSCs (figuur 1C). Aldus onze gegevens toonden significante behandelingseffecten metformine op zelfvernieuwingscapaciteit primaire alvleesklier CSCs en dus moedigde ons verder mechanistische en in vivo studies uitgevoerd. Metformine remt mitochondriale zuurstof consumptie en Induceert ROS productie Sinds metformin bleek te fungeren als een mitochondriaal gif door gedeeltelijke remming van complex I activiteit we vervolgens de acute effecten van metformine op de cellulaire zuurstofverbruik in bol afgeleide cellen onderzocht. Hiervoor hebben we gekozen cellen afkomstig van twee representatieve PDAC primaire tumoren en mat het zuurstofverbruik in de tijd na achtereenvolgende injectie van 3 mM metformine (drie injecties) en 1 uM rotenon (één injectie). Zoals getoond in figuur 2A, metformine injectie induceerde een snelle en dosisafhankelijke afname in zuurstofverbruik, die aanzienlijk tussen de verschillende tumoren varieerde. We berekenden de residuele mitochondriale activiteit na behandeling met metformine door injectie rotenon, een krachtige remmer complex I, dat in staat is volledig remmen mitochondriale zuurstofverbruik. Gevoeligheid voor metformine qua mitochondriale zuurstofverbruik gecorreleerd met het vermogen om ROS productie gedefinieerd als een verplaatsing van het gemiddelde van het p inducerenning na behandeling met metformine (Figuur 2B, linker paneel), die gemakkelijk te kwantificeren (figuur 2B, rechter paneel). Zoals verwacht, de primaire cellen die het meest gevoelig voor remming van zuurstofconsumptie waren toonde ook de sterkste toename van ROS productie na behandeling met metformine. Aldus zijn deze metabolische in vitro experimenten demonstreren dat metformine targets CSCs door remming van hun afhankelijkheid van de mitochondriale functie, resulterend in een latere toename van mitochondriale ROS productie en eventueel inductie van apoptose. Metformine Kraampjes PDAC Progression In Vivo We eindelijk onderzocht de effecten van metformine in vivo met behulp van weefsel xenografts afgeleid van verschillende patiënten met PDAC. We namen een significante vermindering van tumorprogressie voor metformine behandelde muizen in vergelijking met de controlegroep, maar tumoren nooit volledig disappeared (Figuur 3). Vervolgens, tijdens lange-termijn follow-up van alle tumoren uiteindelijk recidief suggereert metformine weerstand van cellen overleven de vroege fase van de behandeling. Toch metformine behandeling, zelfs wanneer toegepast als monotherapie, aanzienlijk uitgebreid overleving in alle muizen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig1.jpg" /> Figuur 1. Metformine selectief richt de CSC. (A) Metformine verminderde de grootte van de bollen. Representatieve beelden van bolletjes verkregen na behandeling met de aangegeven doseringen van metformine gedurende 7 dagen (rechter paneel). Kwantificering van de bol grootte (n≥6) (linker paneel), de aangegeven nummers in abscissen as vertegenwoordigen individuele tumor. (B) Bol vorming capaciteit in aanwezigheid of afwezigheid van metformine gedurende 7 dagen (n≥6), de aangegeven nummers in abscisas vertegenwoordigen individuele tumor. (C) Vertegenwoordiger grafiek van CSC zelfvernieuwingscapaciteit in secundaire en tertiaire sferen van primaire alvleesklierkanker cellen. De bollen werden alleen behandeld tijdens de eerste generatie sfeer formatie voor een totaal van 7 dagen (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig2.jpg" /> Figuur 2. Metformine Behandeling Remt Zuurstof Verbruik en induceert ROS Production. (A) Metformine Bovendien remt zuurstofverbruik (OCR) van de bol afgeleide cellen. Twee verschillende PDAC secundaire bolletjes werden behandeld met metformine en OCR veranderingen werden gemeten door extracellulaire flux analyse. Rotenone injectie werd gebruikt als controle voor de totale mitochondriale OCR consumptie.X-as de zuurstof- verbruik in pmol zuurstof / hr genormaliseerd door het eiwitgehalte in elk putje. (B) PDAC gebieden in A werden gedurende 8 uur met metformine en ROS productie is beoordeeld door flow cytometrie middels carboxy-DCFDA. Links, vertegenwoordiger flowcytometrie percelen. Recht, samenvatting van de gegevens van drie onafhankelijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig3.jpg" /> Figuur 3. Metformine Kraampjes PDAC Progression In Vivo. Twee verschillende PDAC xenograft weefsels werden geïmplanteerd in immunogecompromitteerd muizen en behandeling werd toegekend na de eerste tumor take werd geverifieerd. Muizen werden behandeld met metformine (Met) toegevoegd aan het drinkwater (150 mg / kg body weight; gebaseerd op 5 ml van het waterverbruik per dag). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Alvleesklierstamcellen (CSC's) kunnen worden uitgebreid in vitro met behulp van de verankeringsonafhankelijke sfeercultuurtechniek, wat een krachtig hulpmiddel is om CSC-biologie te bestuderen en kan dienen als de eerste stap om nieuwe CSC-gerichte therapieën te ontwikkelen. Hier wordt de methodologie voor het uitbreiden, analyseren en targeten van pancreas-CSC's geboden.

Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Het algemene doel van de volgende procedure is om kankerstamcellen in vitro te expanderen met behulp van een anchorage-onafhankelijke kweektechniek, om vervolgens de metabole effecten van nieuwe therapieën die zich richten op kankerstamcellen te testen. Dit wordt bereikt door eerst een weefselmonster van een humaan pancreasadenocarcinoom te dissociëren tot een suspensie van enkelvoudige cellen. In de tweede stap wordt het tumorweefsel verder verteerd met enzymen en vervolgens gezaaid op een gelatinplaat. Om de fibroblastpopulatie te verwijderen, worden de geïsoleerde kankercellen vervolgens gezaaid in een multi-wellplaat met ultralage hechting en behandeld met het betreffende geneesmiddel om de metabole activiteit en de vorming van tumorsferen te beoordelen.Uiteindelijk kan het betreffende geneesmiddel worden gebruikt in immuungecompromitteerde muizen met patiëntafgeleide xenografts om de effecten van het middel in vivo te valideren. Deze methode is een krachtig instrument voor het bestuderen van de biologie van kankerstamcellen en dient als eerste stap voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën die zich richten op kankerstamcellen. De procedure zal worden gedemonstreerd door mijzelf, een junior onderzoeker bij het Center for Stem Cells in Cancer and Aging aan het Breast Cancer Institute, en Tini Cruz, een promovendus uit mijn laboratorium, om kankerstamcellen te isoleren uit een pancreasductaal adenocarcinoom in een steriele veiligheidskabinet.Gebruik een steriel scalpel en een pincet om de menselijke tumor fijn te hakken in een kweekschaaltje van 60 bij 15 millimeter met één milliliter steriele PBS, en voeg indien nodig nog drie tot vier milliliter PBS toe totdat het weefsel volledig is gedissocieerd. Overbreng de weefselsuspensie naar een steriele conische buis en voeg PBS toe tot een eindvolume van vijf milliliter. Homogeniseer het monster vervolgens mechanisch met een dissociatiecentrifuge en verteer het gehomogeniseerde weefsel met collagenase bij 37 °C.Na een uur centrifugeren worden de cellen geresuspendeerd door het pellet op te lossen in 10 milliliters compleet medium. Filtreer de celsuspensie door een zeef van 40 micrometer en centrifugeer de cellen opnieuw. Resuspendeer het pellet deze keer in vijf milliliters van een CK. Na vijf minuten bij kamertemperatuur wordt de lysisbuffer voor rode bloedcellen verwijderd door centrifugatie en wordt het pellet geresuspendeerd in medium voor kankerstamcellen.Incubeer de cellen vervolgens in een met gelatine gecoate schaal bij 37 °C om de meeste snel hechtende fibroblastcellen te verwijderen. Herstel na één uur het supernatant en kwantificeer het aantal levensvatbare pancreaskankercellen om de vorming van tumorsferen voor de verrijking van kankerstamcellen te faciliteren. Verdun de cellen in het juiste volume kankerstamcelmedium tot een uiteindelijke concentratie van 2 × 10³ cellen per milliliter en koel ze enkele minuten op ijs.Voeg vervolgens 500 µL PBS toe aan de eerste en laatste rij van een 24-wells ultra low attachment cell plate, resuspendeer de cellen met een pipet en zaai één ml cellen per well in de lege wells van de plaat. Behandel vier wells met het betreffende geneesmiddel en ten minste vier negatieve controle-wells met het vehikel. Incubeer de cellen vervolgens gedurende één week bij 37 °C met 5% CO2.Voeg om de dag verse behandeling in ons vehikel toe aan elke well. Beoordeel op dag vijf of zeven het aantal gevormde tumorsferen met een automatische cel teller die de identificatie van grotere structuren mogelijk maakt voor seriële verpakking van de tumorsferen. Gebruik op dag zeven een celzeef van 40 micrometer om de sferen te oogsten.Centrifuge vervolgens de sferoïden en incubeer deze gedurende 20 minuten in één milliliter trypsine bij 37 °C om de pellet te dissociëren tot een suspensie van enkelvoudige cellen. Breid de cellen vervolgens nog zeven dagen uit, zoals zojuist gedemonstreerd, om de sferoïden voor te bereiden op de meting van hun productie van reactieve zuurstofspecies of ROS. Na dissociatie, zoals zojuist gedemonstreerd, worden de sferoïden gecentrifugeerd en wordt de pellet geresuspendeerd in HBSS met de juiste probe. Na een incubatie van 20 minuten in het donker bij 37 °C worden de cellen op ijs geplaatst tot de analyse via flowcytometrie, om de sferoïden voor te bereiden op de meting van hun zuurstofverbruik.Coat eerst een 96-well celkweekplaat met een cel- en weefseladhesief gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur. Dissocieer vervolgens de sferoïden met trypsine zoals gedemonstreerd. Was de plaat daarna twee tot drie keer met water om het overtollige adhesief te verwijderen en zaai de individuele cellen uit in een concentratie van 3 × 10⁵ cellen per well.Breng de cellen aan op de bodem van de putjes door middel van centrifugatie tot 100 ×g in 150 µL assaymedium voor zuurstofconsumptie dat glucose en natriumpyruvaat bevat. Laat de centrifuge stoppen met de rem uitgeschakeld. Keer vervolgens de plaat om en herhaal de centrifugatie.Incubeer de cellen nu gedurende 30 minuten bij 37 °C zonder koolstofdioxide. Laad ondertussen de assay-cartridge importpoorten A, B en C. Injecteer respectievelijk 25 µL van een concentratie van 3, 6 en 9 mM van het betreffende geneesmiddel, en importpoort D met 25 µL van een concentratie van 1 µM van de mitochondriële remmer rone.Wanneer de cellen gereed zijn, kalibreert u de cartridge en plaatst u de kweekplaat met cellen. Voer ten slotte de assay uit volgens het standaardprotocol voor menging en meting. In deze representatieve experimenten zorgde de behandeling van pancreaskankerstamcellen met metformine voor een sterke afname van de grootte en het aantal tumorsferen. Bovendien werden deze reducties vertoond door secundaire en tertiaire sfeerculturen.Zelfs wanneer alleen de primaire sferencultuur met metformine was behandeld, werkt metformine naar verluidt als een mitochondriale remmer. In dit experiment werd inderdaad waargenomen dat het geneesmiddel een snelle en dosisafhankelijke afname van het zuurstofverbruik in de tumorcellen induceerde, wat correleert met het vermogen om de productie van ROS te induceren. Belangrijk is dat metformine-behandelde muizen een kortstondige maar significante vermindering van de progressie van het pancreasaendenocarcinoom vertonen in vergelijking met controledieren.Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in hoe verse menselijke tumoren gedissocieerd kunnen worden. Isoleer primaire kankercellen, stel een sfeer-vormingscultuur op en evalueer de metabole activiteit van pancreas-kankerstamcellen.

studying-pancreatic-cancer-stem-cell-characteristics-for-developing

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Kankerstamcellen (CSCs) zijn geïdentificeerd in een aantal maligniteiten. In dit protocol beschrijven we een flowcytometrische methode waarbij aldehyde dehydrogenase activiteit en CD44 en CD24 expressie CSCs isoleren van menselijke pancreas adenocarcinoom xenotransplantaten. Deze levensvatbare cellen kunnen vervolgens worden gebruikt in functionele en analytische studies.

Isolatie van stamcellen uit menselijke pancreaskanker xenotransplantaten

This article describes the technique for isolating pancreatic cancer stem cells (CSCs) from human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) tissue. These CSCs are used to study the functional effects of drug treatment on the in vitro self-renewal capacity of CSCs for developing more efficient cancer treatments.

PDAC Stem Cell Isolation: A Method to Isolate Cancer Stem Cells from Pancreatic Tumors

This video demonstrates the protocol for developing pancreatic cancer stem cell spheroids in vitro. The assay can serve as a screening tool to identify compounds that potentially target cancer stem cells.

Sphere Formation Assay: An In Vitro Method to Identify Pancreatic Cancer Stem Cells and Screen Therapies

Het begrijpen van de rol van kanker-stamcel-achtige cellen bij tumorrecidieven en resistentie tegen therapieën is in het afgelopen decennium een onderwerp van groot belang geworden. Dit artikel beschrijft de isolatie en karakterisering van de subpopulatie van kanker-stamcel-achtige cellen uit hoofd-hals-plaveiselcelcarcinoom cellijnen (HNSCC).

Isolatie en karakterisering van een hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom subpopulatie hebben van Stem Cell Kenmerken

Patiënt-afgeleide organoïde culturen van pancreas ductaal adenocarcinoom zijn een snel gevestigde 3-dimensionale model dat epitheliale tumor cel compartimenten met hoge getrouwheid vertegenwoordigen, waardoor translationeel onderzoek naar deze dodelijke maligniteit. Hier bieden we gedetailleerde methoden om organoïden te vestigen en door te geven en om relevante biologische testen uit te voeren met behulp van deze modellen.

Isolatie en karakterisering van patiënt-afgeleide pancreatic Ductal adenocarcinoom Organoid modellen

In de klinische context zullen patiënten met gelokaliseerde alvleesklierkanker pancreatectomie ondergaan, gevolgd door adjuvante behandeling. Dit hier gerapporteerde protocol is bedoeld om een veilige en effectieve methode vast te stellen om dit klinische scenario bij naakte muizen te modelleren, door orthotopische implantatie van alvleesklierkanker gevolgd door distale pancreatectomie en splenectomie.

Een orthotopisch resectiemuismodel van alvleesklierkanker

Dit experimentele protocol beschrijft de isolatie van BCSC's uit borstkankercel- en weefselmonsters, evenals de in vitro en in vivo assays die kunnen worden gebruikt om bcsc-fenotype en -functie te beoordelen.

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

Preklinische modellen zijn bedoeld om de kennis van kankerbiologie te vergroten en de werkzaamheid van de behandeling te voorspellen. Dit artikel beschrijft de generatie van op zebravissen gebaseerde patiënt-afgeleide xenografts (zPDXs) met tumorweefselfragmenten. De zPDXs werden behandeld met chemotherapie, waarvan het therapeutische effect werd beoordeeld in termen van celapoptose van het getransplanteerde weefsel.

Oprichting van zebravispatiënt-afgeleide xenografts van alvleesklierkanker voor chemosensitiviteitstests

Syngenetische muis orthotopische allografts van pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC) recapituleren de biologie, fenotypen en therapeutische reacties van ziektesubtypen. Vanwege hun snelle, reproduceerbare tumorprogressie worden ze veel gebruikt in preklinische studies. Hier tonen we gemeenschappelijke praktijken om deze modellen te genereren, waarbij syngenetische murine PDAC-culturen in de alvleesklier worden geïnjecteerd.

Syngeneic Mouse Orthotopic Allografts om alvleesklierkanker te modelleren

Metaplastische cellen van de alvleesklier zijn voorlopers van kwaadaardige cellen die aanleiding geven tot pancreastumoren. Het isoleren van intacte levensvatbare alvleeskliercellen is echter een uitdaging. Hier presenteren we een efficiënte methode voor dissociatie van pancreasweefsel. De cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) of voor twee- of driedimensionale co-culturing.

Dissectie van pancreasweefsel om levensvatbare afzonderlijke cellen te isoleren

Het huidige protocol beschrijft de herprogrammering van ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC) en normale ductale epitheelcellen van de pancreas tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). We bieden een geoptimaliseerde en gedetailleerde, stapsgewijze procedure, van het bereiden van lentivirus tot het opzetten van stabiele iPSC-lijnen.

Herprogrammering van ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier naar pluripotentie

Leer hoe je pancreaskankerstamcellen kweekt met een ankeronafhankelijke cultuurtechniek om metabole effecten van nieuwe therapieën te testen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar gerichte behandelingen.

Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

Meer video's verkennen