Name: Inkapseling Thermogenic preadipocyten voor transplantatie in VetWeefsel Depots (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer de inkapseling van thermogene preadipocyten voor transplantatie in vetweefseldepots bij muizen. Deze methode verbetert energiedissipatie en ondersteunt onderzoek naar obesitasbehandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Jennifer Petrosino en David DiSilvestro bedanken voor redactionele hulp. Dit onderzoek werd gesteund door Award nummer 20020728 van de Amerikaanse Raad van het Ei en Award nummer 10040042 van Novo Nordisk Pharmaceuticals, alsmede door de Food Innovation Center, Bureau voor Internationale Zaken, Center for Advanced Functional Foods Research en Ondernemen op OSU evenals de National Science Foundation verleent de EEG-0914790 (LJL). De beschreven werd ondersteund door Award Number R21OD017244 (OZ) en UL1RR025755 (OSUCCC) van het National Center for Research Resources project, gefinancierd door het Bureau van de directeur, National Institutes of Health (OD) en ondersteund door de NIH Roadmap for Medical Research en NCI P30CA16058. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Center for Research Resources of de National Institutes of Health.

Het studieprotocol werd goedgekeurd door de Ohio State University ethische commissies. Dierproeven werden goedgekeurd door IACUC protocol. Alle procedures werden uitgevoerd onder het niveau 2 bioveiligheid kast met laminaire stroming. We volgden alle standaard veiligheidseisen en procedures. De micro-inkapseling techniek voor bereiding van microcapsules werd uitgevoerd zoals beschreven 17, 18. 1. Voorbereidingen van Materialen <ol><li> Maak 10 ml van 2% natriumalginaat-oplossing in een autoclaaf behandeld fysiologische zoutoplossing (0,9% NaCl in water). Bereid 0,05% PLL oplossing in fysiologische zoutoplossing. Bereid deze oplossingen de dag vóór en roer &#39;s nachts. Filtreer de oplossing met 0,22 urn filter vóór gebruik. </li><li> Bereid 50 mM natriumcitraat en 100 mM CaCl 2 in 0,9% NaCl oplossingen autoclaaf hen. </li><li> Autoclaaf alle oplossingen, naalden, elektroden, en bekers. Grondig schone naalden met draden om te voorkomen dat verstopping. </li><li> De geschikte hoeveelheid cellen te gebruiken voor de capsules (102 microcapsules zijn noodzakelijk voor elke cm 2 goed en er ongeveer 500 cellen per capsule 18). Gebruik 1 ml natrium alginaat per twee miljoen cellen. </li><li> Bereid een &quot;Fibroblast Growth Medium&quot; met 10% kalfsserum en 100 U / ml penicilline / streptomycine in een hoge glucose (4500 mg / l glucose) Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM). <ol><li> Bereid een &#39;differentiatiemedium I &quot;met 10% foetaal runderserum, 10 ug / ml insuline, 1 uM dexamethason, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methyl- xanthine, en 100 U / ml penicilline / streptomycine in DMEM. </li><li> Bereid een &quot;differentiatiemedium II &#39;met 10% foetaal runderserum, 10 ug / ml insuline en 100 U / ml penicilline / streptomycine in DMEM. </li></ol></li><li> Bereid lysis buffer die een proteaseremmer tablet per 10 ml Radio-immunoprecipitatie assay buffer (RIPA buffer). </li></ol> 2. Alginaat Microbeads Voorbereiding (figuur 1A) <ol><li> Verwijder oude medium uit celkweek kolf. Cellen spoelen met 10 ml PBS. Breng cellen in suspensie met 0,25% trypsine-EDTA (2 ml per één samenvloeiing T175 kolf). </li><li> Tellen cellen in celsuspensie met een hemocytometer. Gebruik 10 ml aliquot van de celsuspensie en tel cellen volgens instructies van de fabrikant. Centrifugeer de overige cellen in medium centrifugatie bij 480 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 min. </li><li> Suspendeer de celpellet in natriumalginaat zoals beschreven in stap 1.4. Breng de natriumalginaat-celoplossing een 5 ml spuit. </li><li> Verwijder luchtbellen uit de oplossing, voeg een 23-gauge naald en keren de injectiespuit een 1 ml luchtzak creëren. </li><li> Plaats een kleine beker (180 ml) met 144 ml van 100 mM CaCl2 oplossing onder de naald uitloop van de encapsulator. Bevestig de elektrode naar de encapsulator met de punt approximdellijk 2,5 cm boven het oppervlak van de 100 mM CaCl 2-oplossing. </li><li> Plaats stevig de spuit met het natriumalginaat-celoplossing in de injectiepomp. De rubberen buis de opening van de spuit. Duw de zuiger totdat de natriumalginaat-cel-oplossing komt halverwege de buis. Stel de spanning 5,4 kV. Stel de 12,06 mm diameter op de injectiepomp. Pas de snelheid tot 3 ml / uur. Start de pomp. Zet de encapsulator en de spanning te handhaven op 5,4 kV. </li><li> Sluit het venster van de motorkap en geen onnodige trillingen tot het einde van de vorming van de alginaat microbolletjes. Immers oplossing gaat door de naald, stollen de alginaat bolvormige microbolletjes in 100 mM CaCl 2-oplossing gedurende nog 20 min voor het bekleden met PLL. </li></ol> 3. Coating Microkralen met PLL (Figuur 1B) <ol><li> Verwijder de beker die de natriumalginaat-cell bolvormige microbolletjes en breng deze microbEADS in een 50 ml centrifugebuis. Verwijder CaCl 2-oplossing uit de microkorrel pellet. </li><li> Was de alginaat-cell bolvormige microbolletjes door toevoeging van 30 ml 0,9% NaCl. Schud de buis met de hand voorzichtig. Verwijder 0,9% NaCl met 25 ml pipet nadat de microbolletjes hebben neergeslagen door zwaartekracht. Herhaal nog twee keer voor een totaal van 3 wasbehandelingen. </li><li> Gebruik 10 ml van 0,05% PLL oplossing voor elke 1 ml van natriumalginaat-oplossing. Voeg 0,05% PLL en vortex bij 1000 omwentelingen per minuut gedurende 10 min. Opmerking: Meestal 10 min is voldoende voor PLL coating. </li><li> Na PLL jas is gevormd, verwijdert u de PLL-oplossing en was de capsules 3 keer zoals beschreven in 3.2. </li></ol> 4. Verwijdering van Alginate Core (figuur 1C) <ol><li> Voeg 30 ml van 50 mM natriumcitraat-oplossing. Wacht 5 minuten of totdat alle natriumalginaat opgelost. Was capsules driemaal zoals beschreven in stap 3.1.1. </li><li> Verwijder het 0,9% NaCl, voeg 20 ml kweekmedium aan de 50 ml buisgeheel overgaat capsules bevatten de cellen een celkweekkolf. Behandel ingekapselde cellen onder standaard celcultuur omstandigheden 18. </li></ol> 5. In vitro toepassingen voor xenograft en gastheercel interactie of Kinetiek van Afbraakproduct Influx / Efflux tussen cellen te bestuderen (figuur 2) <ol><li> Cultuur gastheercellen op 24 well plaat tot samenvloeiing voor co-culturen. Gebruik de &#39;Fibroblast Growth Medium&#39; te kweken preadipocyten. </li><li> Transfer microcapsules in 24 wells plaat met confluent gastheercellen. Microcapsules met een monolaag te bereiken (102 microcapsules / cm2 goed) toe te voegen. </li><li> Opwekken pre-adipocytdifferentiatie met Differentiatie Medium I. Elke 48 uur, verandering media om Differentiatie Medium II voor zes dagen. Lyse cellen in RIPA-buffer. Gebruik 50 ug eiwit per voorwaarde om eiwitexpressie te analyseren met behulp van Western blot. </li></ol> 6. In vivo toepassing voor treatment of Obesity (figuur 3) <ol><li> Meng 4% isofluraan met zuurstof voor anesthesie en 2% isofluraan met zuurstof onderhoud van anesthesie. Bevestig adequate verdoving diepte door teen knijpen. <ol><li> Breng anti-jeuk zalf op de ogen van de hoornvliezen beschermen tegen uitdrogen. </li></ol></li><li> Gebruik ingekapselde cellen die permanent zijn gelabeld met kunstmatige fluorescentie-eiwit, zoals groene fluorescentie eiwit (GFP). </li><li> Gebruik een 3 ml spuit en een 20 gauge naald om ingekapselde cellen te injecteren. <ol><li> Injecteer 0,5 x 10 6 cellen gesuspendeerd in 0,2 ml PBS in elk IAB depot vet dat zich in het gebied tussen een intraperitoneale gonaden en nieren zoals getoond in figuur 3. Met dit volume PBS en aantal cellen voor muizen met een gemiddeld gewicht van 40 g. Stel celaantal en het volume in muizen die een ander gewicht of voor de bepaling van de dosis-afhankelijke effecten. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Vogeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+chronic+conditions%3A+prevalence%2C+health+consequences%2C+and+implications+for+quality%2C+care+management%2C+and+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+general+internal+medicine%22%5BJournal%5D)">Multiple chronic conditions: prevalence, health consequences, and implications for quality, care management, and costs.</a> Journal of general internal medicine. 22, Suppl 3. 391-395 (2007).</li>
<li>Vija, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+Stem+cell+therapy+perspectives+for+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+%26+metabolism%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: Stem cell therapy perspectives for type 1 diabetes.</a> Diabetes & metabolism. 35, 85-93 (2009).</li>
<li>Acarregui, A., Orive, G., Pedraz, J. L., Hernandez, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+applications+of+encapsulated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic applications of encapsulated cells.</a> Methods in molecular biology. 1051, 349-364 (2013).</li>
<li>Chang, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semipermeable+Microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Semipermeable Microcapsules.</a> Science. 146, 524-525 (1964).</li>
<li>Elliott, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+encapsulated+porcine+islets+from+a+type+1+diabetic+patient+9.5+yr+after+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Live encapsulated porcine islets from a type 1 diabetic patient 9.5 yr after xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 14, 157-161 (2007).</li>
<li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210, 908-910 (1980).</li>
<li>Vos, P., Spasojevic, M., Faas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+diabetes+with+encapsulated+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Treatment of diabetes with encapsulated islets.</a> Advances in experimental medicine and biology. 670, 38-53 (2010).</li>
<li>Cotton, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+challenges+in+cell-encapsulation+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering challenges in cell-encapsulation technology.</a> Trends in biotechnology. 14, 158-162 (1996).</li>
<li>Yach, D., Stuckler, D., Brownell, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiologic+and+economic+consequences+of+the+global+epidemics+of+obesity+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiologic and economic consequences of the global epidemics of obesity and diabetes.</a> Nature medicine. 12, 62-66 (2006).</li>
<li>Ng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+prevalence+of+overweight+and+obesity+in+children+and+adults+during+1980-2013%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013.</a> Lancet. 384, 766-781 (2014).</li>
<li>Kissebah, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+body+fat+distribution+to+metabolic+complications+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Relation of body fat distribution to metabolic complications of obesity.</a> The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 54, 254-260 (1982).</li>
<li>Bray, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+central+adiposity+and+body+mass+index+to+the+development+of+diabetes+in+the+Diabetes+Prevention+Program%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+clinical+nutrition%22%5BJournal%5D)">Relation of central adiposity and body mass index to the development of diabetes in the Diabetes Prevention Program.</a> The American journal of clinical nutrition. 87, 1212-1218 (2008).</li>
<li>Klein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+subcutaneous+adipocytes+really+good+for%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+dermatology%22%5BJournal%5D)">What are subcutaneous adipocytes really good for.</a> Experimental dermatology. 16, 45-70 (2007).</li>
<li>Tran, T. T., Yamamoto, Y., Gesta, S., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+subcutaneous+fat+transplantation+on+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of subcutaneous fat transplantation on metabolism.</a> Cell metabolism. 7, 410-420 (2008).</li>
<li>Seale, P., Kajimura, S., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+brown+adipocyte+development+and+physiological+function--of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of brown adipocyte development and physiological function--of mice and men.</a> Genes & development. 23, 788-797 (2009).</li>
<li>Kozak, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+brown+fat+activity+and+body+weight+regulation+in+mice%3A+lessons+for+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in brown fat activity and body weight regulation in mice: lessons for human studies.</a> Biochimica et biophysica acta. 1842, 370-376 (2014).</li>
<li>Zhang, X., He, H., Yen, C., Ho, W., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biodegradable%2C+immunoprotective%2C+dual+nanoporous+capsule+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A biodegradable, immunoprotective, dual nanoporous capsule for cell-based therapies.</a> Biomaterials. 29, 4253-4259 (2008).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prolonged+survival+of+fibroblasts+with+forced+lipid+catabolism+in+visceral+fat+following+encapsulation+in+alginate-poly-L-lysine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The prolonged survival of fibroblasts with forced lipid catabolism in visceral fat following encapsulation in alginate-poly-L-lysine.</a> Biomaterials. 33, 5638-5649 (2012).</li>
<li>Chang, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells+with+emphasis+on+bioencapsulation+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+annual+review%22%5BJournal%5D)">Artificial cells with emphasis on bioencapsulation in biotechnology.</a> Biotechnology annual review. 1, 267-295 (1995).</li>
<li>Chang, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+artificial+cells%3A+microencapsulation+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+journal%22%5BJournal%5D)">Hybrid artificial cells: microencapsulation of living cells.</a> ASAIO journal. 38, 128-130 (1992).</li>
<li>Koo, J., Chang, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+erythropoietin+from+microencapsulated+rat+kidney+cells%3A+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+artificial+organs%22%5BJournal%5D)">Secretion of erythropoietin from microencapsulated rat kidney cells: preliminary results.</a> The International journal of artificial organs. 16, 557-560 (1993).</li>
<li>Weidenauer, U., Bodmer, D., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulation+of+hydrophilic+drug+substances+using+biodegradable+polyesters.+Part+I%3A+evaluation+of+different+techniques+for+the+encapsulation+of+pamidronate+di-sodium+salt%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microencapsulation%22%5BJournal%5D)">Microencapsulation of hydrophilic drug substances using biodegradable polyesters. Part I: evaluation of different techniques for the encapsulation of pamidronate di-sodium salt.</a> Journal of microencapsulation. 20, 509-524 (2003).</li>
<li>Smidsrod, O., Skjak-Braek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+as+immobilization+matrix+for+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Alginate as immobilization matrix for cells.</a> Trends in biotechnology. 8, 71-78 (1990).</li>
<li>Lewinska, D., Rosinski, S., Werynski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+process+conditions+during+impulsed+electrostatic+droplet+formation+on+size+distribution+of+hydrogel+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+cells%2C+blood+substitutes%2C+and+immobilization+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Influence of process conditions during impulsed electrostatic droplet formation on size distribution of hydrogel beads.</a> Artificial cells, blood substitutes, and immobilization biotechnology. 32, 41-53 (2004).</li>
<li>Chan, E. S., Lee, B. B., Ravindra, P., Poncelet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+models+for+shape+and+size+of+ca-alginate+macrobeads+produced+through+extrusion-dripping+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+colloid+and+interface+science%22%5BJournal%5D)">Prediction models for shape and size of ca-alginate macrobeads produced through extrusion-dripping method.</a> Journal of colloid and interface science. 338, 62-72 (2009).</li>
<li>Bhujbal, S. V., Paredes-Juarez, G. A., Niclou, S. P., de Vos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+mechanical+stability+of+alginate+beads+applicable+for+immunoisolation+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+behavior+of+biomedical+materials%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the mechanical stability of alginate beads applicable for immunoisolation of mammalian cells.</a> Journal of the behavior of biomedical materials. 37, 196-208 (2014).</li>
<li>Gushchina, L. V., Yasmeen, R., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+vitamin+A+supplementation+in+obese+mice+regulates+tissue+factor+and+cytokine+production+in+a+sex-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">Moderate vitamin A supplementation in obese mice regulates tissue factor and cytokine production in a sex-specific manner.</a> Archives of biochemistry and biophysics. 539, 239-247 (2013).</li>
<li>Ziouzenkova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinaldehyde+represses+adipogenesis+and+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinaldehyde represses adipogenesis and diet-induced obesity.</a> Nature. 13, 695-702 (2007).</li>
<li>Yasmeen, R., Jeyakumar, S. M., Reichert, B., Yang, F., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+vitamin+A+to+autocrine+regulation+of+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">The contribution of vitamin A to autocrine regulation of fat depots.</a> Biochimica et biophysica acta. 1821, 190-197 (2012).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-133a+regulates+adipocyte+browning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">miR-133a regulates adipocyte browning in vivo.</a> PLoS genetics. 9, e1003626(2013).</li>
<li>Rao, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meteorin-like+is+a+hormone+that+regulates+immune-adipose+interactions+to+increase+beige+fat+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis.</a> Cell. 157, 1279-1291 (2014).</li>
<li>Kir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-derived+PTH-related+protein+triggers+adipose+tissue+browning+and+cancer+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia.</a> Nature. 513, 100-104 (2014).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten zijn gedeclareerd.

Verschillende werkwijzen zijn gebruikt om cellen, met inbegrip van drogen, extrusie en emulsie 19 te kapselen. In deze werkwijze worden de alginaatparels geëxtrudeerd door een naald, vervolgens met PLL en het alginaat kern wordt ontbonden de inkapseling te voltooien. Hoewel deze methode is gebruikt voor jaren, de vorming van de bolletjes met de gewenste grootte en bolvorm blijft een uitdaging. De grootte van de capsules is sterk afhankelijk van de viscositeit van natriumalginaat-oplossing, de extruder diamete...

Toenemend aantal chronische ziekten 1 heeft studies gestimuleerde op transplantatie van de therapeutische celpopulaties 2. Syngene of allogene stamcellen zijn de meest gebruikte celtypen voor deze toepassingen 2. Echter, deze behandelingen geen controle van differentiatie en migratie van stamcellen na implantatie mogelijk te maken en zijn niet kostenefficiënt. Transplantatie van genetisch gemodificeerde cellen met voordelige functies anticipeert verbeteren van de behandeling van vele ziekten. Echter, genetische modificaties cel herkend door het immuunsysteem van de gastheer derhalve deze behandelingen vereisen immunosuppressie 3. Het inkapselen van cellen die insuline is ontwikkeld door Dr. Chang 4. De techniek is gebaseerd op het inkapselen van cellen in alginaat druppels die worden ondergedompeld in een calciumchlorideoplossing. Alginaat moleculen omvatten mannuronzuur (M) en guluronzuur (G) en kunnen worden verbonden door Ca 2+. Na gelering worden de korrels gesuspendeerd a poly-L-lysine (PLL) oplossing. Tijdens deze stap, PLL bindt aan G en M in het alginaat moleculen die het membraan van de capsule vaststelt. De porositeit van het membraan van de capsule kan worden gemoduleerd door het variëren van de M en PLL concentraties, de incubatietijd en temperatuur. De binding van de PLL ook afhankelijk van de soort en concentratie van alginaat. Alginaat matrices verknoopt met Ca2 + -ionen zijn instabiel bij fysiologische omgeving of gemeen bufferoplossingen met een hoge concentratie fosfaat en citraat-ionen. Deze buffers kunnen halen Ca 2+ van het alginaat en vloeibaar te maken de kern. Vloeibaar maken van het alginaat kern biedt ruimte binnen de capsules voor cellulaire beweging en groei. Cellen ingekapseld in polyanionische alginaat met polykation poly-L-lysine (APL) impermeabel voor immunoglobulinen maar instroom van nutriënten en efflux van toxines. Deze eigenschappen APL&#39;s mogelijk te maken op de lange termijn survival van ingekapselde cellen na transplantatie in genetisch verschillende hosts. Elliott et al. Beschreven de overleving functioneren ingekapselde varkens pancreas cellen in een menselijke patiënt negen jaar na implantatie 5. Inkapseling technieken kunnen worden ingedeeld in microinkapseling (3-800 urn) en macro-inkapseling (groter dan 1000 urn). Microcapsules zijn duurzamer dan macrocapsules 6. Sinds de ontdekking door Dr. Chang en collega&#39;s in 1964, is mikroinkapseling wijd gebruikt voor het inkapselen van anabole cellen produceren insuline, andere hormonen, en bioactieve moleculen 7. Deze behandelingen geconfronteerd met verschillende uitdagingen in de gastheerweefsel inclusief fibrose en immuunrespons 8. Aanvankelijk zijn de bijwerkingen die verband houden met de kwaliteit van biopolymeren opgelost. Echter, transplantatie van anabole cellen initieert steeds neveneffecten, zoals fibrose ten gevolge van hormonale overproductie buiten een gespecialiseerde klier. In de afgelopen decennia, obesitas en type 2 diabetes heeft epidemische proporties 9 bereikt. Meer dan 30% van de volwassen mensen wereldwijd zijn overgewicht en obesitas 10. Toegenomen intra-abdominale (IAB) vetvorming verhoogt incidentie van chronische ontsteking en bevordert Type 2 diabetes, hart- en vaatziekten, bepaalde vormen van kanker en andere morbidities 11-13. Verschillende lijnen van bewijs suggereerde dat pathogenese geassocieerd met IAB vet kan worden afgewend door specifieke adipocyten. Recente studies hebben aangetoond dat transplantatie van subcutane adipocyten in IAB gebied kan verbeteren metabolisme en obesitas en insulineresistentie afname van knaagdieren in vivo 14. Effectieve vermindering van obesitas en insuline resistentie is geassocieerd met thermogene adipocyten energie kunnen absorberen in de vorm van warmte 15,16. Thermogene modificatie van adipocyten kan worden bereikt door stabiele transfectiegenen die deelnemen aan de mitochondriële ontkoppeling proton, zoals ontkoppelingseiwit 1 (UCP1) of genen die expressie van UCP1 en andere thermogene genen 15,16. Onze recente studies aangetoond dat tekort aan aldehyde dehydrogenase 1 a1 (Aldh1a1) tot een thermogene verbouwing van lab vet dat obesitas en insulineresistentie vermindert in deze muizen 17,18. Met name, inkapseling van thermogene Aldh1a1 deficiënte (Aldh1a1 - / -) preadipocytes medieert hetzelfde therapeutisch effect bij IAB vet in obese wildtype muizen, wat suggereert nieuwe therapeutische mogelijkheden voor de behandeling van lab vet 18. In experimentele instellingen ingekapselde cellen kunnen de onderzoekers effecten van specifieke celpopulaties te bestuderen op een kosteneffectieve wijze 19. Hier bespreken we de methode van inkapseling van een thermogene katabole cellijn en zijn laboratorium en therapeutische toepassing in een muismodel van obesitas. Het protocol beschrijft trie fasen microcapsule productie (Figuur 1): de vorming van het alginaat microkorrels (figuur 1A), de vorming van polykation poly-L-lysine (PLL) membraan op het oppervlak van de microbolletjes (figuur 1B), en het verwijderen van de alginaat kernen (figuur 1C).

<table><tbody><tr><td>Encapsulation device (VAR V1)</td><td>Nisco</td><td>LIN-0042</td><td>Geen</td></tr><tr><td>KD scientific spuitpomp</td><td>KD scientific</td><td>780100Y</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Olympus microscoop&nbsp;</td><td>Olympus Optical</td><td>IX70-S8F2</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Natriumalginaat</td><td>Sigma</td><td>MKBP8122V</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide (PLL)</td><td>Sigma</td><td>020M5006V</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma</td><td>SLBJ2662V</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Natriumcitraat tribasisch dihydraat</td><td>Sigma</td><td>030M0200</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>SLBD2595V</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1093</td><td>Geen</td></tr><tr><td>ATGL primaire antilichaam (van konijn)</td><td>Cell Signaling</td><td>2138S</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Secundair antilichaam (anti konijn)</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Radio-immunoprecipitatie assay (RIPA) buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>D25Y6Z</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma</td><td>RNBD2893</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Cortizone 10 anti-jeukzalf</td><td>Cortizone 10</td><td>C4029138</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Serum van pasgeboren kalf (CS)</td><td>Sigma</td><td>N4762</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>Geen</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Insulin (runder)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Protease remmer cocktail tabletten</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Geen</td></tr></tbody></table>

inkapseling thermogenic preadipocyten voor transplantatie in vetweefsel depots

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Celinkapselende werd ontwikkeld om levende cellen te vangen binnen semi-permeabele membranen. De geënte ingekapselde cellen kunnen laagmoleculaire metabolieten wisselen in weefsels van de behandelde gastheer voor overleving op lange termijn realiseren. Het halfdoorlaatbare membraan maakt geënt ingekapselde cellen om afstoting te voorkomen door het immuunsysteem. De inkapselingsprocedure is ontworpen om een ​​gecontroleerde afgifte van bioactieve stoffen, zoals insuline, andere hormonen en cytokinen mogelijk. Hier beschrijven we een werkwijze voor het inkapselen van katabole cellen, welke lipiden om warmte en energiedissipatie (thermogenese) in de intra-abdominale vetweefsel van obese muizen verbruikt. Inkapseling van thermogene katabole cellen kunnen eventueel van toepassing zijn op de preventie en behandeling van obesitas en type 2 diabetes. Een andere mogelijke toepassing van katabole cellen kunnen detoxificatie van alcoholen of andere toxische metabolieten en milieuverontreinigende stoffen.

Figuur 1 laat zien dat elke stap van microbeads productie onder de microscoop kan worden gecontroleerd. Figuur 2A laat zien hoe co-cultuur adipocyten met een monolaag van ingekapselde cellen. Figuur 2B is een representatief voorbeeld van een kwantitatief onderzoek met adipocyte / microcapsules co-culturen die werden in hoofdstuk 5. Lysaten beschreven van adipocyten werden geanalyseerd met behulp van Western blot. Ingekapselde cellen werden niet geanalyseerd in dit exper...

Hier presenteren we een protocol voor het inkapselen van katabolische cellen, die lipiden consumeren voor warmteproductie in intra-abdominaal vetweefsel en de energiedissipatie bij obese muizen verhogen.

Inkapseling Thermogenic preadipocyten voor transplantatie in VetWeefsel Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de inkapseling van een thermogene katabole cellijn en de toepassingen hiervan in vitro en potentieel in vivo. Ter voorbereiding op deze procedure wordt een natriumalginaat-celsuspensie bereid en overgebracht naar een spuit van vijf milliliter. De volgende stap is het gebruik van een inkapselingsapparaat om de alginaat-microbeads te produceren.De microbeads worden vervolgens gecoat met een polyonische poly-L-lysine-oplossing, waarna de alginaatkern wordt verwijderd om een semipermeabel membraan rond een celsuspensie te vormen. De laatste stap is om de ingekapselde cellen samen te kweken met andere cellijnen of ze in het vetweefsel van muizen te injecteren. Uiteindelijk laat immuunbloedanalyse een hogere lipolytische activiteit zien in adipocyten die zijn samen gekweekt met aldehydedehydrogenase-deficiënte adipocyten in microcapsules.Hoewel immunohistochemie een succesvolle transplantatie van ingekapselde cellen in het vetweefsel van muizen aantoont, kan deze methode inzicht verschaffen in thermogenese en vetweefsel. Het kan ook worden toegepast op andere bestaande diermodellen om een kostenefficiënt experimenteel modelsysteem te bieden voor het testen van cel-subsets in vivo. Voor biomedische ontdekkingen moeten alle procedures worden uitgevoerd in een biosafety cabinet niveau 2 met laminaire luchtstroom.Verwijder eerst het oude medium uit de kweekfles met cellen en spoel de preadipocyten met 10 milliliters PBS. Verwijder de PBS en resuspendeer de cellen in twee milliliters 0,25% tripsin EDTA. Neem een aliquot van 10 microliter uit de celsuspensie en tel de cellen met een hemocytometer.Voeg volgens de instructies van de fabrikant DMEM toe aan de resterende cellen om de ideale hoeveelheid cellen te verkrijgen en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 480 ×g bij kamertemperatuur. Nadat de benodigde hoeveelheid cellen is bepaald volgens de aanwijzingen in de protocoltekst, suspenderen we de celpellet in een geschikt volume van een 2% natriumalginaatnetoplossing. Breng de celoplossing van natriumalginaat over in een spuit van vijf milliliter.Verwijder eventuele luchtbellen uit de oplossing en keer de spuit om om een luchtbel van één milliliter te creëren. Plaats ter voorbereiding op de inkapseling een klein bekerglas met 144 milliliters van een 100 millimolaire calciumchloride-oplossing. Bevestig onder de naaldopening van het inkapselingsapparaat de elektrode aan het inkapselingsmateriaal, waarbij de punt zich ongeveer 2,5 centimeters boven het oppervlak van de calciumchloride-oplossing bevindt.Plaats de spuit met de natriumalginaat-celoplossing stevig in de spuitenpomp. Bevestig de rubberen slang aan de opening van de spuit. Duw de zuiger in tot de natriumalginaat-celoplossing halverwege de slang is.Stel de spanning in op 5,4 kilovolt en stel de diameter op de spuitpomp in op 12,06 millimeter. Stel de snelheid in op drie milliliter per uur. Start de pomp, schakel de inkapseling in en houd de spanning constant op 5,4 kilovolt.Sluit het raam van de zuurkast en vermijd onnodige trillingen tot de vorming van de alginaat-microbeads voltooid is. Nadat de gehele oplossing door de naald is gestroomd, laat u de bolvormige alginaat-microbeads nog 20 minuten uitharden in de calciumchloride-oplossing voordat ze worden gecoat met polyanionisch polylysine of PLL. Zodra de bolvormige natriumalginaat-microbeads zijn uitgehard, verwijdert u het bekerglas met de microbeads uit het inkapselingsapparaat.Breng de microkorrels over naar een centrifugebuis van 50 milliliter. Verwijder de calciumchlorideoplossing uit het microkorrelpellet. Was de microkorrels door 30 milliliter van een 0,9% natriumchlorideoplossing toe te voegen en de buis voorzichtig met de hand te schudden.Laat de microbeads door zwaartekracht bezinken. Gebruik vervolgens een pipet van 25 milliliter om de natriumchloride-oplossing op deze wijze te verwijderen. Was de microbeads in totaal drie keer.Voeg vervolgens de 0,05% PLL-oplossing toe aan de microbeads. Gebruik 10 milliliters PLL-oplossing voor elke ene milliliter natriumalginaatoplossing. Vortex 10 minuten bij 1000 rotaties per minuut, wat doorgaans voldoende is voor de PLL-coating.Nadat de vorming van de PLL-coating is bevestigd, wordt de PLL-oplossing verwijderd en worden de capsules drie keer gewassen met een 0,9% natriumchloride-oplossing zoals eerder beschreven. Om eerst de alternatieve kern uit de PLL-gecoate microbeads te verwijderen, worden 30 milliliter van een 50 millimolaire natriumcitraatoplossing aan de 50 milliliter buis toegevoegd. Wacht vijf minuten of totdat alle natriumalginaat is opgelost. Was de capsules drie keer met een 0,9% natriumchloride-oplossing zoals eerder beschreven.Na de derde wasbeurt met 20 milliliters kweekmedium in de buis, worden alle capsules die de cellen bevatten overgebracht naar een cellentkweekfles; behandel de ingekapselde cellen onder standaard cellentkweekcondities. De gastcellen voor deze procedure moeten worden gekweekt in 24-wells platen tot ze confluent zijn. Gebruik fibroblastgroeimedium, bereid zoals beschreven in het bijbehorende protocol.Tekst voor het kweken van preadipocyten. Breng de microcapsules over naar de 24-wells plaat met confluente gastcellen; voeg microcapsules toe om een monolaag in elke well te verkrijgen. Induceer de differentiatie van de preadipocyten met differentiatiedium 1 en incubeer gedurende 48 uur.Vervang na 48 uur het medium door differentiatie-medium twee. Vervang het medium vervolgens met vers differentiatie-medium twee. Elke 48 uur worden de eiwitten uit de cellen geanalyseerd via western blot.Elke stap van de productie van microbeads kan onder de microscoop worden waargenomen. Een alginaat-microbead wordt getoond bij een 20-voudige vergroting. Voorafgaand aan de PLL-coating, na coating met PLL en na het oplossen van de ginnet-kern in een kwantitatieve studie werd de expressie van adipose triglyceride lipase of ATGL vergeleken tussen drie T3L1-adipocyten die gecocultiveerd waren met acellulaire wildtype of aldehyde dehydrogenase 1A1-deficiënte adipocyten-bevattende microcapsules.De hogere expressie van ATGL in adipocyten die werden gecocultiveerd met een L-DHOnA1-deficiënte adipocyt in microcapsules duidt op een hogere lipolytische activiteit. In een in vivo-studie werden GFP-gelabelde ingekapselde cellen geïnjecteerd in het intra-abdominale vetdepot van muizen. 80 dagen later vertoonde het geïnjecteerde vetkussentje gediscoloreerde clusters van ingekapselde cellen.Een in paraffine ingebedde sectie van het intra-abdominale vetdepot, gekleurd met hematoxyline en eosine, toont clusters van geïmplanteerde microcapsule-ingekapselde cellen en adipocyten van de gastheer. Dezelfde sectie geanalyseerd onder fluorescent licht toont GFP-gelabelde getransplanteerde cellen aan de binnenzijde van ronde intacte capsules. De expressie van GFP is tevens een indicator voor de cellevensvatbaarheid na de ontwikkeling ervan.Deze inkapselingsmethode maakte het voor onderzoekers op het gebied van metabole ziekten mogelijk om mogelijke behandelingen voor obesitas, insulineresistentie bij diabetes type 2, ontstekingen en kanker in modelorganismen te onderzoeken.

encapsulation-thermogenic-preadipocytes-for-transplantation-into

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Primaire witte preadipocyten geïsoleerd van wit vetweefsel in muizen kunnen worden onderscheiden in beige / brite cellen. Hier wordt gepresenteerd is een betrouwbare cellulaire modelsysteem om de moleculaire regulatie van "bruinen" van wit vet te bestuderen.

Isolatie en differentiatie van Stroma vasculaire cellen te Beige / Brite Cellen

De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

Hier presenteren we menselijke vetweefsel enzym-vrije micro-fragmentatie met behulp van een gesloten systeem apparaat. Deze nieuwe methode maakt het verkrijgen van sub-millimeter clusters van vetweefsel geschikt voor in vivo transplantatie, in vitro cultuur, en verdere celisolatie en karakterisering.

Menselijke vetweefsel micro-fragmentatie voor Celfenotyping en Secretome karakterisatie

We presenteren een eenvoudige methode om zeer levensvatbare adipose voorlopercellen te isoleren van epididymale vetkussens van muizen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering.

Voorbereiding van adipose voorlopercellen van muis epididymale vetweefsels

Dit rapport beschrijft een protocol voor de gelijktijdige isolatie van primaire bruine en witte preadipocyten van pasgeboren muizen. Geïsoleerde cellen kunnen in cultuur worden gekweekt en worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in volgroeide witte en bruine adipocyten. De methode maakt genetische, moleculaire en functionele karakterisering van primaire vetcellen in cultuur mogelijk.

Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen

Deze met vet bedekte eilandjestransplantatiemethode is geschikt voor de detectie van geënte eilandjes in de intraperitoneale holte. Met name vereist het niet het gebruik van biobindingsmiddelen of hechten.

Met vet bedekte eilandjestransplantatie met behulp van epididymaal wit vetweefsel

Preadipocyten worden geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier bruin vetweefsel van pasgeboren muizen en gedifferentieerd tot cellen die lipidedruppeltjes accumuleren, moleculaire markers tot expressie brengen en de mitochondriale morfologie van volwassen bruine vetcellen vertonen. Deze cellen worden verder geanalyseerd door middel van immunofluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren, kweken en fenotyperen van microvasculaire endotheelcellen uit menselijk onderhuids vetweefsel (hSATMVEC's). Daarnaast beschrijven we een experimenteel model van hSATMVEC-adipocyte overspraak.

Bestudering van overspraak van vet-endotheelcellen en adipocyten in menselijk onderhuids vetweefsel

De grootte en kwetsbaarheid van rijpe vetcellen hebben de technieken en hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor hun studie en isolatie beperkt. Hier wordt een protocol beschreven voor de isolatie van rijpe muizenadipocyten, dat gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende vetdepots en muizendiëten.

Isolatie en kweek van primaire adipocyten van muizen van magere en zwaarlijvige muizen

Leer de inkapseling van thermogene preadipocyten voor transplantatie in vetweefseldepots bij muizen. Deze methode verbetert energiedissipatie en ondersteunt onderzoek naar obesitasbehandeling.

Inkapseling Thermogenic preadipocyten voor transplantatie in VetWeefsel Depots

Meer video's verkennen