Inkapseling Thermogenic preadipocyten voor transplantatie in VetWeefsel Depots

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de inkapseling van een thermogene katabole cellijn en de toepassingen hiervan in vitro en potentieel in vivo. Ter voorbereiding op deze procedure wordt een natriumalginaat-celsuspensie bereid en overgebracht naar een spuit van vijf milliliter. De volgende stap is het gebruik van een inkapselingsapparaat om de alginaat-microbeads te produceren.

De microbeads worden vervolgens gecoat met een polyonische poly-L-lysine-oplossing, waarna de alginaatkern wordt verwijderd om een semipermeabel membraan rond een celsuspensie te vormen. De laatste stap is om de ingekapselde cellen samen te kweken met andere cellijnen of ze in het vetweefsel van muizen te injecteren. Uiteindelijk laat immuunbloedanalyse een hogere lipolytische activiteit zien in adipocyten die zijn samen gekweekt met aldehydedehydrogenase-deficiënte adipocyten in microcapsules.

Hoewel immunohistochemie een succesvolle transplantatie van ingekapselde cellen in het vetweefsel van muizen aantoont, kan deze methode inzicht verschaffen in thermogenese en vetweefsel. Het kan ook worden toegepast op andere bestaande diermodellen om een kostenefficiënt experimenteel modelsysteem te bieden voor het testen van cel-subsets in vivo. Voor biomedische ontdekkingen moeten alle procedures worden uitgevoerd in een biosafety cabinet niveau 2 met laminaire luchtstroom.

Verwijder eerst het oude medium uit de kweekfles met cellen en spoel de preadipocyten met 10 milliliters PBS. Verwijder de PBS en resuspendeer de cellen in twee milliliters 0,25% tripsin EDTA. Neem een aliquot van 10 microliter uit de celsuspensie en tel de cellen met een hemocytometer.

Voeg volgens de instructies van de fabrikant DMEM toe aan de resterende cellen om de ideale hoeveelheid cellen te verkrijgen en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 480 ×g bij kamertemperatuur. Nadat de benodigde hoeveelheid cellen is bepaald volgens de aanwijzingen in de protocoltekst, suspenderen we de celpellet in een geschikt volume van een 2% natriumalginaatnetoplossing. Breng de celoplossing van natriumalginaat over in een spuit van vijf milliliter.

Verwijder eventuele luchtbellen uit de oplossing en keer de spuit om om een luchtbel van één milliliter te creëren. Plaats ter voorbereiding op de inkapseling een klein bekerglas met 144 milliliters van een 100 millimolaire calciumchloride-oplossing. Bevestig onder de naaldopening van het inkapselingsapparaat de elektrode aan het inkapselingsmateriaal, waarbij de punt zich ongeveer 2,5 centimeters boven het oppervlak van de calciumchloride-oplossing bevindt.

Plaats de spuit met de natriumalginaat-celoplossing stevig in de spuitenpomp. Bevestig de rubberen slang aan de opening van de spuit. Duw de zuiger in tot de natriumalginaat-celoplossing halverwege de slang is.

Stel de spanning in op 5,4 kilovolt en stel de diameter op de spuitpomp in op 12,06 millimeter. Stel de snelheid in op drie milliliter per uur. Start de pomp, schakel de inkapseling in en houd de spanning constant op 5,4 kilovolt.

Sluit het raam van de zuurkast en vermijd onnodige trillingen tot de vorming van de alginaat-microbeads voltooid is. Nadat de gehele oplossing door de naald is gestroomd, laat u de bolvormige alginaat-microbeads nog 20 minuten uitharden in de calciumchloride-oplossing voordat ze worden gecoat met polyanionisch polylysine of PLL. Zodra de bolvormige natriumalginaat-microbeads zijn uitgehard, verwijdert u het bekerglas met de microbeads uit het inkapselingsapparaat.

Breng de microkorrels over naar een centrifugebuis van 50 milliliter. Verwijder de calciumchlorideoplossing uit het microkorrelpellet. Was de microkorrels door 30 milliliter van een 0,9% natriumchlorideoplossing toe te voegen en de buis voorzichtig met de hand te schudden.

Laat de microbeads door zwaartekracht bezinken. Gebruik vervolgens een pipet van 25 milliliter om de natriumchloride-oplossing op deze wijze te verwijderen. Was de microbeads in totaal drie keer.

Voeg vervolgens de 0,05% PLL-oplossing toe aan de microbeads. Gebruik 10 milliliters PLL-oplossing voor elke ene milliliter natriumalginaatoplossing. Vortex 10 minuten bij 1000 rotaties per minuut, wat doorgaans voldoende is voor de PLL-coating.

Nadat de vorming van de PLL-coating is bevestigd, wordt de PLL-oplossing verwijderd en worden de capsules drie keer gewassen met een 0,9% natriumchloride-oplossing zoals eerder beschreven. Om eerst de alternatieve kern uit de PLL-gecoate microbeads te verwijderen, worden 30 milliliter van een 50 millimolaire natriumcitraatoplossing aan de 50 milliliter buis toegevoegd. Wacht vijf minuten of totdat alle natriumalginaat is opgelost. Was de capsules drie keer met een 0,9% natriumchloride-oplossing zoals eerder beschreven.

Na de derde wasbeurt met 20 milliliters kweekmedium in de buis, worden alle capsules die de cellen bevatten overgebracht naar een cellentkweekfles; behandel de ingekapselde cellen onder standaard cellentkweekcondities. De gastcellen voor deze procedure moeten worden gekweekt in 24-wells platen tot ze confluent zijn. Gebruik fibroblastgroeimedium, bereid zoals beschreven in het bijbehorende protocol.

Tekst voor het kweken van preadipocyten. Breng de microcapsules over naar de 24-wells plaat met confluente gastcellen; voeg microcapsules toe om een monolaag in elke well te verkrijgen. Induceer de differentiatie van de preadipocyten met differentiatiedium 1 en incubeer gedurende 48 uur.

Vervang na 48 uur het medium door differentiatie-medium twee. Vervang het medium vervolgens met vers differentiatie-medium twee. Elke 48 uur worden de eiwitten uit de cellen geanalyseerd via western blot.

Elke stap van de productie van microbeads kan onder de microscoop worden waargenomen. Een alginaat-microbead wordt getoond bij een 20-voudige vergroting. Voorafgaand aan de PLL-coating, na coating met PLL en na het oplossen van de ginnet-kern in een kwantitatieve studie werd de expressie van adipose triglyceride lipase of ATGL vergeleken tussen drie T3L1-adipocyten die gecocultiveerd waren met acellulaire wildtype of aldehyde dehydrogenase 1A1-deficiënte adipocyten-bevattende microcapsules.

De hogere expressie van ATGL in adipocyten die werden gecocultiveerd met een L-DHOnA1-deficiënte adipocyt in microcapsules duidt op een hogere lipolytische activiteit. In een in vivo-studie werden GFP-gelabelde ingekapselde cellen geïnjecteerd in het intra-abdominale vetdepot van muizen. 80 dagen later vertoonde het geïnjecteerde vetkussentje gediscoloreerde clusters van ingekapselde cellen.

Een in paraffine ingebedde sectie van het intra-abdominale vetdepot, gekleurd met hematoxyline en eosine, toont clusters van geïmplanteerde microcapsule-ingekapselde cellen en adipocyten van de gastheer. Dezelfde sectie geanalyseerd onder fluorescent licht toont GFP-gelabelde getransplanteerde cellen aan de binnenzijde van ronde intacte capsules. De expressie van GFP is tevens een indicator voor de cellevensvatbaarheid na de ontwikkeling ervan.

Deze inkapselingsmethode maakte het voor onderzoekers op het gebied van metabole ziekten mogelijk om mogelijke behandelingen voor obesitas, insulineresistentie bij diabetes type 2, ontstekingen en kanker in modelorganismen te onderzoeken.