Name: In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer bacteriële hechting aan vaatwanden onder schuifspanning bestuderen met in vitro- en in vivo-modellen. Deze methode maakt real-time visualisatie van Staphylococcus aureus-adhesie mogelijk voor infectieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; &quot;Eddy Merckx Research Grant&quot; en het &quot;Sporta onderzoek Grant&quot; voor Pediatric Cardiology, UZ Leuven, België (JC); het Centrum voor Moleculaire en Vasculaire Biologie wordt ondersteund door de Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), door de &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13) van de Universiteit van Leuven en een onderzoek subsidie ​​van Boehringer-Ingelheim.

Dierproeven werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van de KU Leuven. 1. Voorbereiding Bacteriën voor infusies in vitro en in vivo experimenten <ol><li> We gebruikten S. aureus stam Newman voor alle experimenten in dit manuscript beschreven. S. aureus Newman werd opgeslagen in Brain Heart Infusion (BHI) met 10% glycerol bij -80 ° C. </li><li> Gebruik een steriele lus te schrapen de bevroren bacteriën af en beënt in 5 ml Tryptic Soy Broth (TSB) O / N bij 37 ° C (OD 600&gt; 3). </li><li> Was de bacteriën door centrifugeren (2600 g, kamertemperatuur, 5 min) en resuspendeer de bacteriële pellet in 5 ml PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing). </li><li> Maak een 1 mg / ml oplossing van 5 (6) -carboxy-fluoresceïne N-hydroxysuccinimidylester (carboxy-fluoresceïne) in ethanol. Verdun de 1 mg / ml carboxy-fluoresceïne oplossing 150 ug / ml in laboratoriumkwaliteit water (bijvoorbeeld MilliQ water). Bescherm de buizen van lichtmet aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Centrifugeer de bacteriën (2.600 xg, RT, 5 min). Resuspendeer de bacteriële pellet in 800 pl PBS en voeg 200 pl (eindconcentratie van 30 ug / ml voor perfusie experimenten) en 400 pl (eindconcentratie 50 gg / ml in vivo experimenten) van de 150 ug / ml carboxy-fluoresceïne-oplossing. Bescherm de buizen tegen licht met aluminiumfolie en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een schudinrichting. </li><li> Na labeling, blok met 6% bovine serum albumine (BSA) oplossing in PBS. </li><li> Verdun bacteriën gebruikmakend van optische densitometrie (OD), een OD 600 van 0,65 in vitro experimenten (overeenkomend met ongeveer 3 x 10 8 kolonievormende eenheden (CFU) / ml S. aureus) en een OD 600 van 1,8 voor in vivo experimenten ( overeenkomt met ongeveer 1 x 10 9 CFU / ml S. aureus) in PBS. Bescherm de buizen van licht met aluminiumfolie en laat op ijs. </li></ol> 2. In vitro experimenten Perfusion <ol><li> Coating van dekglaasjes <ol><li> Verdun von Willebrand factor (VWF) (Haemate P, voorraadconcentratie 2400 ug / ml) in laboratoriumkwaliteit water (gedeïoniseerd gedestilleerd) tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml. </li><li> Verdun collageen in isotone glucoseoplossing (SKF, pH 2,7-2,9, zoals geleverd door de fabrikant) tot een uiteindelijke concentratie van 160 ug / ml. </li><li> Coat dekglaasjes (24 × 50 mm) met VWF of collageen druppelsgewijs 200 ul van de coating op parafilm en plaats het dekglaasje op de top van de druppel. De druppel zal verspreiden langs het oppervlak van het dekglaasje. </li><li> Incubeer het dekglaasje in een bevochtigde container voor 4 uur bij KT. Til de dekglaasjes van de parafilm met een stompe naald. Monteer het dekglaasje in het onderste gedeelte van de stromingskamer. </li></ol></li><li> Coating van Plastic Slips met endotheelcellen <ol><li> Coat plastic slips(1-well PCA celkweekkamer, Sarstedt, Duitsland) met 1 ml van een 1% gelatine-oplossing in PBS en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Seed humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) van de gelatine beklede plastic slips en groeien ze tot 70-80% confluentie. Plaats de plastic slip in het onderste gedeelte van de stromingskamer. </li></ol></li><li> Perfusie Experiment Opmerking: Een schematisch overzicht van de in vitro perfusie model is weergegeven in Figuur 1. <ol><li> Voer in vitro bacteriële adhesie studies in een micro-parallelle plaat stroming kamer bij een laminaire schuifspanning tussen 2,5 dyne / cm 2 en 20 dyne / cm 2 simuleren verschillende fysiologische stroomomstandigheden. </li><li> De stromingskamer (in-house design) bestaat uit een metalen frame en een perfusie kamer gemaakt van plexiglas (poly (methyl) methacrylaat (PMMA)). Door deze op een zeer nauwkeurige infusiepomp (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, USA), kunnen we stroming ra genererentes tussen 0,0001 pl / min en 220,82 ml / min. </li><li> Sluit de slang aan het bovendeel van de stromingskamer en injecteer medium in de buis. Plaats voorzichtig de bovenkant van de stromingskamer bovenop het onderste gedeelte en monteer de stroom kamer. Wees voorzichtig om luchtbellen te vermijden. Injecteer 1 ml van medium door de kamer om ervoor te zorgen dat de kamer niet lekt en om overtollige coating oplossing te verwijderen. Vermijd luchtbellen. </li><li> Plaats de muis in een thermisch gecontroleerde verwarmingskussen bij 37 ° C op een microscoopglaasje lade. Aangezien dit een terminal procedure, is er geen noodzaak van een strikte asceptische procedures. Een incisie nabij de halsader, verwijder voorzichtig de rechterzijde van de cervicale spier en isoleer de halsader van het omringende weefsel. </li><li> Stel de infuuspomp en fluorescentiemicroscoop. Infuuspomp instellingen zijn afhankelijk van de spuit diameter en de gewenste debiet (zie paragraaf 2.4). Vanaf nu werken in een donkere kamer. </li><li> VWF Coating: <ol><li> Vul een spuit met fluorescent gelabelde bacteriën en sluit deze aan op de inlaat buis. Vermijd luchtbellen. Start de infusiepomp gedurende 10 min. De infusietijd is afhankelijk van de afschuifsnelheid en de coating, bacteriën en middelgrote gebruikt en moeten de steady state hechting geven. </li><li> Na 10 min, wegspoelen van ongebonden bacteriën door er een spuit met PBS om de inlaatbuis en het starten van de infusiepomp. </li><li> Neem ten minste 15 foto&#39;s of films op verschillende plaatsen na het wasproces. Bacteriën zijn kleine en mogelijk moeilijk om zich te concentreren op. Voorafgaand aan het in vitro experiment stroom, kan het geschikte focal plane teruggevonden door een druppel van fluorescent gelabelde bacteriën op een dekglaasje te plaatsen en het dekglaasje in de stromingskamer. Dan, op zoek naar de juiste focal plane en sla de instellingen. OPMERKING: Bij de in vitro stroom experiment vastleggen van de beelden tijdens de wasstap (± 5 minuten na start) zorgt ervoor dat alleen designaal voor aanhangend bacteriën wordt vastgelegd. </li></ol></li><li> Collageen Coating: <ol><li> Voeg 60 ug / ml VWF aan de fluorescent gelabelde bacteriën net voor aanvang van de perfusie. Vul een spuit met fluorescent gelabelde bacteriën of fluorescent gelabelde bacteriën, aangevuld met 60 ug / ml VWF en sluit deze aan op de inlaat buis. Vermijd luchtbellen. Herhaal stap 2.3.5.2 naar 2.3.5.3 </li></ol></li><li> Endotheliale Cellen: <ol><li> Activeer de endotheelcellen door perfusie met een 0,1 mM oplossing van de Ca 2+ -ionophore A23187 (voorraadoplossing 10 mM opgelost in dimethyl- sulfoxide (DMSO)) in DMEM bij dezelfde afschuifsnelheid als bacteriële perfusie gedurende 10 min perfusie met 0,1 mM. Herhaal stap 2.3.5.2 naar 2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li> Bereken shear rate en shear stress als volgt. Afschuifsnelheid = 6Q / wh 2 Waar: Q: debiet in ml / min, w: breedte in cm, h: hoogte in cm Shear stress (τ) = shear ratex viscositeit (μ) Waar μ: medium: 0,01 dynes x sec / cm 2, volbloed: 0.04 dynes x sec / cm2 </li><li> Beeldanalyse <ol><li> Verkrijgen van live-beelden met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop met een zwart-wit camera en te ontwikkelen met behulp van beeldbewerkingssoftware. Gebruik belichtingstijd van 1,5 sec. Neem meerdere foto&#39;s (minimaal 15) willekeurig verspreid over het gecoate oppervlak van de stroom kamer en sla ze op in het juiste bestandsformaat. </li><li> Voer beeldanalyse met ImageJ. Trek de achtergrond van vloeiende continu achtergronden uit de afbeelding (Process - Aftrekken Achtergrond) te verwijderen en bepalen de drempel om onderste en bovenste drempelwaarden ingesteld, segmenteren grijstinten in kenmerken van belang. Meet het oppervlak beperkt tot de drempel. </li><li> Vergelijk bacteriële hechting, uitgedrukt fluorescerende delen, bijvoorbeeld met behulp van statistische analysesoftware. Vergelijk de groepen met behulp van one-way ANOVA of two staart T-test Student&#39;s. Melden alle waarden als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Beschouw een p-waarde van &lt;0,05 significant (* p &lt;0,05; ** p &lt;0,01; *** p &lt;0,001). </li></ol></li></ol> 3. In vivo Mesenteriale Perfusion Model <ol><li> Voorbereiding / chirurgie van de muis <ol><li> Fast de muis de nacht vóór het experiment om stoelgang te beperken. </li><li> Geef een 6-8 weken oude muizen (C57BL / 6) pre-operatieve analgesie door een subcutane injectie van buprenorfine (0,1 mg / kg lichaamsgewicht (BW)) 20-30 minuten voor de operatie. </li><li> Verdoven de muis door intraperitoneale injectie van ketamine (125 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (12,5 mg / kg BW). Controleer door pedaal reflex. Breng vet zalf tot droog voorkomen. </li><li> Plaats de muis in een thermisch gecontroleerde verwarmingskussen bij 37 ° C op een microscoopglaasje lade. Aangezien dit een terminal procedure, is er geen noodzaak van een strikte asceptic procedures. Een incisie nabij de halsader, verwijder voorzichtig de rechterzijde van de cervicale spier en isoleer de halsader van het omringende weefsel. </li><li> Plaats een 2 French intraveneuze catheter in de rechter halsader voor infusie van fluorescent gelabelde bacteriën of andere oplossingen. Open de buikholte via een middellijn incisie in de buik en het gebruik van wattenstaafjes om de mesenterium verspreiden en de mesenteriale arteriolaire en venular circulatie te visualiseren. </li><li> Plaats de muis naar de rechterzijde op een transparante plaat en zet de canule met tape. Gebruik een hot pack om onderkoeling te voorkomen. Om uitdroging van het weefsel te voorkomen, vallen 500 ul 0,9% NaCl op de darmen. </li></ol></li><li> Fluorescentie microscopie van bacteriële hechting aan de mesenterische circulatie <ol><li> Werk in een donkere kamer. Gebruik wattenstaafjes om de schepen te immobiliseren en visualiseren ze onder een omgekeerde microscoop. </li><li> Topicaal 5 pi van een 10 mM oplossing o toepassingf de Ca2 + -ionophore A23187 opgelost in DMSO. Na 10 sec, injecteer 100 ul gemerkte bacteriën (zie stap 1) door de halsader katheter. Neem de time-lapse beelden. Na het experiment is voltooid, euthanaseren de muis volgens de institutionele richtlijnen goedgekeurd. </li></ol></li><li> Beeldanalyse <ol><li> Verkrijgen van live-beelden met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop, vastgelegd met behulp van een zwart-wit camera en ontwikkeld met behulp van een imaging software. Breng geautomatiseerde belichtingstijd en contrast optimalisatie specifiek voor de gebruikte apparatuur. </li><li> Acquire time-lapse beelden met behulp van de &#39;Acquisitie&#39; instrument in de werkbalk (Multidimensional Acquisities - Time) met behulp van 40 cycli van 1.000 beelden / sec. Sla de beelden in een geschikt bestandsformaat. </li><li> Proces beelden met behulp van ImageJ analyse software om het gebied van fluorescerende signaal per beeld te meten. Definieer de drempel tot onderste en bovenste drempelwaarden ingesteld, segmenteren grijstinten in fENMERKEN van belang. Identificeer het gebied van belang (bloedvat) en meet het gebied beperkt tot de drempel en het gebied van belang. Vergelijk bacteriële hechting, uitgedrukt als fluorescerende gebied met behulp van een statistische of grafische software. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Cardiovasc+Ther%22%5BJournal%5D)">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li>
<li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis%3A+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li>
<li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li>
<li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor%E2%80%93binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor–binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li>
<li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li>
<li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin%2C+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%2FFEBS%22%5BJournal%5D)">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+activated+platelets+assist+THP-1+monocytoid%2Fendothelial+cell+interaction+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress.</a> Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).</li>
<li>Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+von+Willebrand+factor-binding+protein+%28vWbp%29+of+Staphylococcus+aureus+is+a+coagulase%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase.</a> FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).</li>
<li>Friedrich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylocoagulase+is+a+prototype+for+the+mechanism+of+cofactor-induced+zymogen+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation.</a> Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).</li>
<li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+formation+by+staphylothrombin+facilitates+Staphylococcus+aureus-induced+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).</li>
<li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+staphylothrombin-mediated+fibrin+deposition+in+catheter-related+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections.</a> J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).</li>
<li>Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Krötz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li>
<li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Shear stress is van cruciaal belang voor de vroege bacteriële hechting aan de vaatwand en de volgende generatie van endovasculaire of endocardiale vegetaties en metastatische infecties 4,5. We beschreven complementaire in vitro en in vivo modellen om de pathogenese van endovasculaire infecties onder fysiologische schuifspanning bestuderen. Deze modellen hebben ons aan von Willebrand-factor-bindend eiwit (vWbp) te identificeren als de belangrijkste S. aureus eiwit te communiceren onder stroom met een verwonde vaatwand bloot VWF 4. Endovasculaire infecties en infectieuze endocarditis vooral van belang zijn, niet alleen vanwege sepsis geïnduceerde orgaanfalen en de dood, maar ook door lokale en verre (metastatisch) complicaties. Om infectieuze endocarditis en metastatische infecties veroorzaken, bacteriën moeten zich houden aan de vaatwand en dus verzetten tegen de shear stress van stromend bloed. Meeststudies op bacteriën virulentiefactoren zijn uitgevoerd in statische omstandigheden. Echter, deze gevestigde interacties misschien niet dwarskrachten en studies te weerstaan ​​onder stroom omstandigheden kan nieuwe, voorheen onbekende factoren in bacterie-gastheer wisselwerking onthullen. Met behulp van de micro-parallelle stroom kamer, hebben wij en anderen zien het belang van de VWF voor vasculaire adhesie. Onder shear stress, VWF geleidelijk ontvouwt uit zijn rustplaats bolvormige structuur, en onthult de A1 domein dat interageert met bloedplaatjes via de GPIb-receptor 6. Stroomkamers zijn uitgebreid gebruikt om bloedplaatjesfunctie 7 bestuderen. Opmerkelijk is ook S. aureus hechting onder stroom vereist VWF, en in het bijzonder het A1 domein dat wordt blootgesteld aan afschuiving. We geïdentificeerd vWbp te bemiddelen VWF binding. vWbp is een coagulase die bijdraagt ​​aan S. aureus pathofysiologie van protrombine de gastheer te activeren. Staphylothrombin, de resulting complex van een bacteriële coagulase en protrombine, zet fibrinogeen in onoplosbaar fibrine 8,9. Onze studies hebben aangetoond dat vWbp niet alleen geactiveerd prothrombine, maar leidt tot de vorming van bacterie-fibrine-aggregaten van bloedplaatjes, waardoor de hechting aan bloedvaten onder stroom 4,10,11 verbeteren. De in vitro stromingskamer model maakt het mogelijk om de verschillende spelers in bacteriële hechting te bestuderen om cellulaire of matrix componenten. Bacteriële virulentie factoren kunnen worden bestudeerd met behulp van mutanten of onschadelijke bacteriën specifieke oppervlakte-eiwitten uiten. Alternatief kunnen farmacologische remmers of blokkerende antilichamen worden toegevoegd aan het medium in de stroom kamer. De rol van gastheerfactoren zoals verschillende bestanddelen van extracellulaire matrix kan worden onderzocht door gebruik dekglaasjes met verschillende coatings. De dekglaasjes kan ook worden bekleed met endotheelcellen, waarvan de activeringsstatus kan worden gemoduleerd door het toevoegen van specifieke stimulatoren. Apart uit de vaatwand, kan de bijdrage van ontvangst bloedcellen en plasma-eiwitten worden bestudeerd door het toevoegen van deze factoren het stromende medium. Zo kunnen verschillende omstandigheden van toenemende complexiteit onder gestandaardiseerde omstandigheden van laminaire stroming worden bestudeerd om de interacties die de bacteriën te hechten aan de bloedvatwand in vivo ontrafelen. Interacties die in het in vitro model worden vervolgens onderzocht in een diermodel om de relevantie te testen in een complex organisme. Andere in vivo modellen om dynamische interacties onder stroom te bestuderen zijn beschreven, zoals de hamster dorsale huidplooi kamer 12 en de cremaster model 13. In vergelijking, de mesenterische perfusie model beschreven biedt verschillende voordelen vanwege het gebruiksgemak, de mogelijkheid te variëren gastheer genetische achtergrond van de muizen en farmacologische interventies evalueren. Kortom, de beschreven modellenbieden de mogelijkheid om oppervlakte-eiwitten niet alleen van S. bestuderen aureus, maar vele andere micro-organismen in verschillende gastheersoorten achtergronden, beter inzicht in de pathogenese van vasculaire infectie.

Om endovasculaire infecties te veroorzaken, hebben pathogenen een mechanisme nodig om te hechten aan het endotheel, dat de vaatwand en het binnenoppervlak van het hart bekleedt, en om te overleven en een infectie te vestigen ondanks de blootstelling aan de schuifspanning van snel stromend bloed. De meest voorkomende ziekteverwekker die levensbedreigende endovasculaire infecties en infectieuze endocarditis veroorzaakt, is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Verschillende aan het bacteriële oppervlak gebonden adhesiefmolecuulmediators zorgen voor hechting aan het gastheerweefsel door interactie met componenten van de extracellulaire matrix. Deze MSCRAMM's (microbiële oppervlaktecomponenten die adhesieve matrixmoleculen herkennen) herkennen moleculen zoals fibronectine, fibrinogeen, collageen en von Willebrand-factor (VWF). MSCRAMM's zijn belangrijke virulentiefactoren van S. aureus en zijn betrokken bij de kolonisatie en invasie van de gastheer2. De meeste studies naar deze virulentiefactoren zijn uitgevoerd onder statische omstandigheden en zijn daarom mogelijk niet representatief voor menselijke infecties waarbij de initiële hechting van de bacteriën plaatsvindt in stromend bloed. 
In het geval van bloedstroominfecties moeten bacteriën de schuifkrachten van stromend bloed overwinnen om zich aan de vaatwand te hechten. Modellen die de interactie tussen bacteriën en endotheel of subendotheel onder stromingscondities onderzoeken, zijn daarom van bijzonder belang. 
Een recente studie toonde aan dat de hechting van S. aureus aan bloedvaten onder schuifspanning wordt gemedieerd door VWF3. VWF, een onder schuifspanning werkend eiwit, wordt vrijgegeven uit endotheliale cellen bij activering. Circulerend VWF bindt aan collageenvezels van de blootgestelde subendotheliale matrix. Onze groep rapporteerde dat het von Willebrand-factorbindende eiwit (vWbp) van S. aureus cruciaal is voor schuifspanningsgemedieerde hechting aan VWF4. 
In dit artikel presenteren we een in vitro stromingskamermodel waarin bacteriële hechting aan verschillende componenten van de extracellulaire matrix of aan endotheliale cellen kan worden geëvalueerd. Om de bevindingen uit in vitro gegevens te valideren, hebben we een in vivo model ontwikkeld dat de directe interactie van bacteriën met de vaatwand en de vorming van bacteriële-trombocyt trombi in de mesenteriale circulatie van muizen visualiseert en kwantificeert, met behulp van real-time intravitale vasculaire microscopie.

<table><tbody><tr><td>Brain Heart Infusion (BHI)</td><td>BD Plastipak&nbsp;</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td><td>Oxoid</td><td>CM0129</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td>D-PBS</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21878-25MG-F</td><td>fluorescent labeling&nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td><td>Roch</td><td>10 735 086 001</td><td></td></tr><tr><td>Haemate-P</td><td>CSL Behring</td><td>PL 15036/0010</td><td>VWF</td></tr><tr><td>Horm collagen</td><td>Takeda</td><td>10500</td><td>collagen</td></tr><tr><td>1-well PCA cell culture chambers</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td>plastic slips</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>283716</td><td>bruprenorfine</td></tr><tr><td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td><td>Eurovet</td><td>BE-V136516</td><td>ketamin</td></tr><tr><td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td><td>VMD Arendonk</td><td>BE-V170581</td><td>xylazine</td></tr><tr><td>2 french intravenous catheter green</td><td>Portex</td><td>200/300/010</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td><td>Baxter Healthcare</td><td>W7124</td><td></td></tr><tr><td>cotton swabs</td><td>International Medical Product</td><td>300230</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+-ionophore solution A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522-10 MG</td><td></td></tr><tr><td>26 gauge 1 ml syringe&nbsp;&nbsp;</td><td>BD Plastipak&nbsp;</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>26 gauge 1 ml syringe&nbsp; with needle</td><td>BD Plastipak&nbsp;</td><td>300015</td><td>intra-peritoneale injectie</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810-R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.320</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slips (24x50)</td><td>VWR</td><td>BB02405A11</td><td>Thickness No, 1</td></tr><tr><td>PHD 2000 Infusion</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702100</td><td>High-accuracy Harvard infusiepomp</td></tr><tr><td>Axio-observer DI</td><td>Carl-Zeiss</td><td>Invertede fluorescentiemicroscoop</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>Analysesoftware</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 5,0</td><td>Graphpad Software</td><td>Analysesoftware</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Carl-Zeiss&nbsp;</td><td>Zwart-witcamera</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro en in vivo model voor bacteriële hechting aan de vaatwand onder flow omstandigheden te bestuderen

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

Om endovasculair infecties en infectieuze endocarditis veroorzaken, moeten bacteriën kunnen hechten aan de vatwand terwijl blootstelling aan de afschuifspanning van stromend bloed. Om de bacteriële en gastheer factoren die bijdragen tot vasculaire adhesie van micro-organismen te identificeren, worden de modellen die deze interacties onder fysiologische omstandigheden te bestuderen afschuiving nodig. Hier beschrijven we een in vitro flow chamber model waarmee bacteriële hechting onderzoeken in verschillende componenten van de extracellulaire matrix of endotheelcellen en een intravitale microscopie zoals dat is ontwikkeld om direct visualiseren de initiële hechting van bacteriën aan de splanchnische circulatie in vivo . Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt om de bacteriële en gastheer factoren die nodig zijn voor de aanhechting van bacteriën onder stroming te identificeren. We illustreren het belang van de schuifspanning en de rol van von Willebrand factor voor de hechting van Staphyferment- aureus zowel met de in vitro en in vivo model.

S. aureus adhesie aan VWF, subendotheliale matrix en endotheelcellen een schuifspanning afhankelijk fenomeen De rol van shear stress benadrukken de interactie tussen S. aureus en VWF, voerden we perfusie via VWF beklede dekglaasjes bij verschillende afschuifsnelheden (een schematisch overzicht van de in vitro perfusie model is weergegeven in figuur 1. adhesie van S. aureus aan vWF toe met toenemende afschuifsnelheden van 250 sec -1 tot 2000 sec -1 (figuur 2), wat aangeeft dat hoge afschuifkrachten niet belemmeren maar versterkt de hechting van bacteriën aan VWF. Om de bijdrage van VWF bacteriële hechting aan collageen te onderzoeken, het hoofdbestanddeel van de subendothele matrix, we geperfuseerd fluorescent gemerkte S. aureus op collageen in de aanwezigheid of afwezigheid van VWF. Bij afwezigheid van VWF, hechting van S. eenureus collageen af met toenemende afschuifsnelheden. Wanneer echter VWF in het medium aanwezig was, de hechting van S. aureus toe met toenemende afschuifsnelheden (figuur 3). De in vitro stromingsmodel kunnen wij ook de hechting van bacteriën onderzocht endotheelcellen onderbroken wordt. We geperfuseerd HUVECs met fluorescent gelabelde S. aureus bij afschuifsnelheden van 500 tot 2.000 sec -1. Waar aangegeven, HUVEC werden geactiveerd met een Ca 2+ -ionophore, tot het vrijkomen van VWF leiden. Endotheelcel activatie en de daaropvolgende afgifte VWF, verhoogde adhesie van S. aureus (Figuur 4A), wat typische &quot;draadvormige&quot; patronen gevormd van fluorescent gelabelde bacteriële clusters uitgelijnd in de richting van de dwarskracht (figuur 4B), wat suggereert dat de binding van bacteriën aan een lineaire gestrekt VWF molecuul. Eerste in vivobacteriële hechting splanchnische aders wordt gemedieerd door VWF Omdat S. aureus kan houden aan VWF, gebruikten we wildtype muizen (vWF + / +) en VWF-deficiënte muizen (VWF - / -) om bacteriële hechting aan de geactiveerde bloedvatwand in vivo te onderzoeken. Real-time videomicroscopie van splanchnische aderen konden de in vivo visualisatie van circulerende fluorescent gelabelde S. aureus (Schematisch overzicht van de in vivo perfusie model is weergegeven in figuur 5). Na farmacologische activatie van het endotheel van de Ca2 + -ionophore vonden wij snelle lokale ophoping van individuele bacteriën en aggregaten van bacteriën aan de vaatwand van WT-muizen (aanvullende&#39;s 1 en 2). Vrijwel geen hechting van bacteriën werd waargenomen op de geactiveerde vaatwand van vWF -deficient muizen (extra Video 3) ten opzichte van hechting in WT-muizen (Figuur 6). De afwezigheid van VWF vermindert het vermogen van S. aureus te houden aan de geactiveerde vaatwand. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Figuur 1. Een schematische weergave van de in vitro stromingsmodel. De in vitro stromingsmodel is een multifunctioneel model, dat de studie van verschillende afschuifsnelheid afhankelijke mechanismen maakt zoals bacteriële hechting aan de subendotheliale matrix maar ook trombus vorming. De micro-meestroom kamer rust op een dekglaasje (plastic of glas) met verschillende coatings van eiwitten en endotheelcellen. De adhesie van verschillende bacteriën (oranje en grijze stippen) kunnen worden geanalyseerd, en het effect van de aanwezigheid van plasmaproteïnen, bloedplaatjes en totaal bloed kunnen worden geëvalueerd. Fluorescent markers voor bloedplaatjes (blauwe ovalen) of fibrinogen (blue strings) worden toegepast in combinatie met andere remmers (zwarte ovalen) bacteriële en gastheer factoren onderscheiden. Vertegenwoordiger beelden van bacteriële hechting van S. aureus collageen coating in aanwezigheid (onder) of afwezigheid (top) van de VWF worden weergegeven (schaal bar is 100 micrometer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Figuur 2. Hechting van S. aureus VWF toe met toenemende afschuifsnelheden. Micro-parallel flow chamber perfusie via beklede VWF (50 ug / ml) met fluorescent gelabelde S. aureus Newman bij afschuifsnelheden van 250 tot 2.000 sec -1 (sec -1) in medium (n&gt; 5). Alle resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> Figuur 3. Hechting van S. aureus subendotheel is afschuiving en VWF afhankelijk. Micro-parallel flow chamber perfusie via gecoate collageen (160 ug / ml) met fluorescent gelabelde S. aureus Newman bij afschuifsnelheden van 250 tot 2.000 sec -1 in medium (n&gt; 5). VWF (60 ug / ml) was aanwezig in het medium waar aangegeven. Alle resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. ** P &lt;0,01. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Figuur 4. Adhesie van S. aureus aan geactiveerde endotheelcellen is shear afhankelijk. Micro-parallel flow chamber perfusie via endotheelcellen. (A) menselijke navelstreng endotheel cellen werden geactiveerd met het Ca2 + -ionophore A23187 (0,1 mM) gevolgd door een 10 min perfusie van fluorescent gemerkte S. aureus Newman bij afschuifsnelheden van 500 tot 2.000 sec -1 in medium (n&gt; 5). Alle resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. * P &lt;0,05. (B) Afbeelding van micro-parallelle stroom kamer perfusie dan geactiveerd HUVECs met S. aureus bij een afschuifsnelheid van 1.000 sec -2. S. aureus vormt snaren van ± 200 micron lengte, wat suggereert hechting aan VWF multimeren (schaal bar is 100 micrometer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Figuur 5. Een schematisch overzicht van de in vivo mesenteriale perfusie model. Een recht halsader katheter (gele lijn) is voor het beheer van fluor gestokenescently gelabelde bacteriën (oranje stippen), extra anesthetica of andere componenten, zoals de farmaceutische remmers en antilichamen. De peritoneale holte wordt geopend en het mesenterium wordt verspreid naar de bloedvaten (arterieel en veneus) onder een fluorescentiemicroscoop visualiseren. Na farmacologische activatie van het endotheel door Ca2 + -ionophore, dat de afgifte van VWF induceert, kunnen bacteriën worden toegediend via de jugulaire ader katheter. Real-time intravasculaire video microscopie kan de in vivo visualisatie van circulerende fluorescent gelabelde bacteriën en de resulterende vorming van bacteriën bloedplaatjes trombi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Figuur 6. De initiële hechting van S. aureusaan geactiveerd endotheel in vivo wordt gemedieerd door VWF In vivo veneus mesenterische perfusie model met C57BL / 6 VWF + / + en C57BL / 6- VWF -. / - muizen. Hechting van fluorescent gemerkte S. aureus het lokaal actief vaatwand significant lager bij VWF - / - muizen. Alle resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. *** P &lt;0,001, n&gt; 7. <img alt="Video Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Video 1: Real-time hechting van S. aureus aan geactiveerde vaatwand in VWF + / + muizen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">Klik hier om deze video te bekijken.</a> Video 2: Real-time aggregaatvorming en embolisatie van S. aureus in VWF + / + muizen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">Klik hier om deze video te bekijken.</a> <img alt="Video Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Video 3: Real-time hechting van S. aureus geactiveerd bloedvatwand in VWF - / -. muizen in vivo mesenterische perfusie model met VWF + / + en VWF - / - muizen. Vijf pi van een Ca2 + -ionophore (10 mM) werd toepased op het gebied van de gevisualiseerde vaatbed. Een suspensie van carboxy-fluoresceïne-gemerkte S. aureus werd geïnjecteerd via de jugulaire catheter. De mesenteriale circulatie werd gevisualiseerd onder een omgekeerde microscoop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">Klik hier om deze video te bekijken.</a>

Om de interactie van bacteriën met de bloedvaten onder afschuifspanning te bestuderen, worden een stromingskamer en een in vivo mesenteriale intravitale microscopiemodel beschreven die het mogelijk maken om de bacteriële en gastheerfactoren die bijdragen aan vasculaire adhesie te ontleden.

In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de interactie tussen bacteriën en het endotheel en subendotheel onder schuifspanning te onderzoeken. Dit wordt bereikt door bacteriën fluorescent te labelen om ze in een tweede stap in real-time te visualiseren met behulp van videomicroscopie. Een in vitro flowkamer wordt gebruikt om de verschillende betrokken factoren bij de adhesie van stromende bacteriën aan cellulaire of matrixcomponenten te bestuderen.Vervolgens worden de in het in vitro-model geïdentificeerde interacties bestudeerd in het in vivo mesenteriale perfusiemodel om hun relevantie in een complex organisme te testen; de resultaten tonen aan dat staphylococcus reus in staat is om te adhereren aan geactiveerde endotheelcellen en aan het subendotheel onder schuifspanning. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het zowel een in vitro- als een in vivo-model omvat, die complementair zijn voor het bestuderen van de pathogenese van endovasculaire infecties onder schuifspanning. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van infectieziekten en vasculaire biologie, zoals hoe infectieuze endocarditis en metastatische infecties worden gevestigd onder fysiologische schuifspanning. De procedure wordt gedemonstreerd door Be Malin, een technicus gespecialiseerd in dierwerk uit ons laboratorium. Begin met het voorbereiden van de fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om de bacteriën te volgen.Voeg 150 µL van een stockoplossing van carboxy-fluorescentie toe aan 850 µL laboratoriumwater en meng dit. Bewaar de oplossing lichtbeschermd bij -20 °C tot gebruik. Pelleteer vervolgens een cultuur van 5 mL S. reus.Was de bacteriën die overnacht zijn gekweekt in tryptische soja-bouillon één keer met PBS en resuspendeer ze vervolgens. Voeg aan het nieuwe pellet in 800 microliters PBS 200 microliters van de kleurstofoplossing toe aan de geresuspendeerde cellen voor in vitro perfusie-experimenten, of 400 microliters van de kleurstofoplossing voor in vivo experimenten. Bedek de buisjes met aluminiumfolie om fotobleking van de kleurstof te voorkomen en incubeer ze 30 minuten op een schudapparaat bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens een 6% bovine serum albumine-oplossing in PBS toe aan het mengsel om aspecifieke binding te blokkeren. Controleer de celconcentratie met optische cytometrie en verdun de bacteriën in PBS tot verschillende concentraties, afhankelijk van de toepassing. Bescherm de buizen na verdunning tegen licht en plaats ze op ijs.Verdun de von Vand-factor in water van laboratoriumkwaliteit tot een uiteindelijke concentratie van 50 µg/mL. Verdun daarnaast collageen in een isotone glucoseoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 160 µg/mL. Breng vervolgens 200 µL van elke coating aan op een strip paraform.Plaats de dekglasjes bovenop de druppels om deze met de eiwitten te coaten. Incubeer het dekglasje gedurende vier uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde container. Til vervolgens de dekglasjes voorzichtig met een stompe naald van de parafilm af en monteer het dekglasje in het onderste gedeelte van een flowkamer voor experimenten met endotheelcellen; coat plastic glaasjes met één milliliter van een 1% gelatinestoplossing in PBS en incubeer deze gedurende 30 minuten bij 37 °C.Zaai vervolgens menselijke endotheelcellen uit de navelstrengader op de met gelatine gecoate plastic strips en laat deze groeien tot een confluentie van 70 tot 80%. Plaats het met proteïne gecoate dekglas of de met endotheelcellen gecoate plastic strip in het onderste gedeelte van de flowkamer. Sluit vervolgens de inlaat- en uitlaatslangen aan op het bovenste gedeelte van de flowkamer en verbind de uitlaatslang met een afvalcontainer.Plaats het bovenste gedeelte van de flowkamer voorzichtig op het onderste gedeelte en assembleer de flowkamer. Injecteer, terwijl de vorming van luchtbellen wordt voorkomen, één milliliter medium door de kamer om te controleren of de kamer niet lekt en om overtollige coatingoplossing te verwijderen.Stel vervolgens de infusiepomp in voor een spuit van één milliliter, zodat de stroomsnelheid 75 µL per minuut is. Vul in een donkere kamer een spuit van één milliliter met één milliliter fluorescent gelabelde bacteriën en plaats deze in de infusiepomp. Verbind de uitlaat van de spuit met de inlaat van de flowkamer.Start de infusiepomp voor 10 minuten bij 75 µL per minuut, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen luchtbellen ontstaan. Verwijder na 10 minuten de eerste spuit en sluit een spuit van 1 mL met PBS of DMEM aan op de inlaatbuis. Start de infusiepomp en spoel gedurende 10 minuten om alle ongebonden bacteriën weg te wassen.Laat na het spoelen de infusiepomp aanstaan en maak ten minste 15 zwart-witopnames met een belichtingstijd van 1,5 seconden op willekeurige locaties, verspreid over het gecoate oppervlak van de flowkamer. Gebruik een programma voor beeldanalyse zoals Image J. Trek de achtergrond af om egale, continue achtergronden uit het beeld te verwijderen en bepaal de drempelwaarde om de onder- en bovengrenzen in te stellen, waarmee de grijswaardenbeelden worden gesegmenteerd in de relevante kenmerken. Meet vervolgens het oppervlak dat beperkt is tot de nieuw gecreëerde drempelwaarde en sla deze waarde, bekend als het fluorescentieoppervlak, op voor elk monster.De muizen van acht weken oud werden de avond voor het experiment vastgezet om de darmbewegingen te verminderen. Begin op de dag van het experiment met het injecteren van 0,1 milligram buprenorfine per kilogram lichaamsgewicht als analgeticum. Anestheseer vervolgens de muis en breng zalf aan op de ogen.Plaats de muis op het temperatuurgecontroleerde warmtekussen onder de dissectiescoop en controleer of de muis geen patella-reflex vertoont. Maak een incisie van één centimeter parallel aan de vena jugularis. Verwijder de rechterkant van de cervicale spier en isoleer vervolgens de vena jugularis van het omliggende weefsel.Plaats een twee French intraveneuze katheter in de rechter vena jugularis en zet deze vast met hechtingen. Maak vervolgens een midline abdominale incisie om de peritoneumholte te openen. Plaats de muis op zijn rechterzijde op een transparante plaat en zet de canule vast met tape.Trek de darmen voorzichtig naar buiten met wattenstaafjes en spreid het mesenterium om de arteriolaire en capillaire circulatie van het mesenterium te visualiseren. Plaats een warmtepak op de muis om hypothermie te voorkomen en druppel elke 30 minuten 500 µL 0,9% NACL op de darmen om uitdroging van het weefsel te voorkomen.Gebruik wattenstaafjes om de vaten te immobiliseren en visualiseer deze onder een geïnverteerde microscoop. Breng vervolgens topisch vijf microliter van een 10 millimolaire oplossing van calcium ionofoor four opgelost in DMSO aan. Dit zal de afgifte van Von Willebrand-factor vanuit de endotheelcellen in de vaten activeren.Inject na 10 seconden 100 µL van de fluorescerend gelabelde bacteriën via de jugulariscatheter. Begin op dit moment met het maken van time-lapsebeelden; neem deze beelden op met de acquisitietool in de werkbalk met 40 cycli van 1000 beelden per seconde. Zodra de beeldacquisitie is voltooid, wordt de muis geëuthanaseerd volgens de institutionele richtlijnen.Sla de afbeeldingen op in een geschikt afbeeldingsbestandsformaat en verwerk deze vervolgens met ImageJ-analysesoftware zoals eerder beschreven om de rol van schuifspanning bij bacteriële adhesie te benadrukken; perfusies van Staphylococcus aureus werden uitgevoerd bij verschillende schuifsnelheden op met Von Willebrand-factor gecoate dekglasplaatjes. Naarmate de schuifsnelheden toenemen, neemt ook de bacteriële adhesie toe, wat aangeeft dat hoge schuifkrachten de adhesie van de bacteriën aan het eiwit niet remmen, maar juist versterken. In afwezigheid van Von Willebrand-factor nam de adhesie van Staphylococcus aureus aan collageen af bij toenemende schuifsnelheden.Wanneer Von Willebrand-factor echter aanwezig was in het medium, nam de adhesie van de bacteriën toe naarmate de afschuifsnelheden hoger werden; endotheelcellen die met een calciumionofoor waren geactiveerd om Von Willebrand-factor vrij te geven, vertoonden significant meer bacteriële adhesie dan niet-geactiveerde cellen. Daarnaast vormden de bacteriën typische strengvormige patronen van fluorescentie-gelabelde bacteriële clusters die waren uitgelijnd in de richting van de afschuifkracht, wat wijst op de binding van bacteriën langs een lineair uitgerekt VWF-molecuul. Om het effect van Von Willebrand-factor in vivo te testen, werden endotheelcellen van de mesenteriale circulatie geactiveerd om Von Willebrand-factor vrij te geven, waarna fluorescentie-gelabelde bacteriële cellen in de bloedstroom werden geïntroduceerd. De bacteriën hechtten zich lokaal aan de geactiveerde vaatwand en vormden aggregaten.Na het bekijken van deze video zou u een beter inzicht hebben in hoe de interactie tussen bacteriën en de vaatwand onder invloed van schuifspanning kan worden onderzocht door de bacteriën fluorescentie-labeling toe te passen en deze te visualiseren in zowel een in vitro flowkamer als in een in vivo intravitaal mesenteriaal perfusiemodel. Deze techniek biedt onderzoekers op het gebied van cardiovasculaire infecties de mogelijkheid om de interactie tussen pathogenen en de vaatwand bij infectieuze endocarditis en metastatische infecties te onderzoeken.

in-vitro-vivo-model-to-study-bacterial-adhesion-to-vessel-wall-under

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit is een methode om leukocyt adhesie te visualiseren aan het endotheel in geoogste drukvaten. De techniek maakt het bestuderen van vasculaire adhesie onder afschuiving stroom met verschillende intraluminale druk tot 200 mmHg aldus de pathofysiologische omstandigheden van hoge bloeddruk na te bootsen-ing.

Imaging Leukocyt Hechting aan het vasculair endotheel bij High intraluminale druk

Tijdens het infectieproces, een belangrijke stap is de hechting van pathogenen met gastheercellen. In de meeste gevallen deze hechting stap gebeurt in de aanwezigheid van mechanische spanning opgewekt door stromende vloeistof. Beschrijven we een techniek die schuifspanning introduceert als een belangrijke parameter in de studie van bacteriële hechting.

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

Source: Ditkowski, B., et al. An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the method of using a parallel-plate flow chamber to perfuse fluorescently labeled bacteria over vascular graft tissues, enabling controlled analysis of bacterial adhesion and early pathogenesis under shear flow conditions.

In Vitro Parallel-Plate Flow Model to Study Bacterial Adhesion on a Tissue Biopsy

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates an in vitro gut host–microbe model to study bacterial viability. A co-culture of Caco-2 and HT29-MTX cells is incubated with bacteria pre-treated under simulated digestive conditions. Epithelial barrier integrity is assessed using transepithelial electrical resistance, and fractions from the medium, solubilized...

In Vitro Gut Model to Assess Bacterial Adhesion and Internalization

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

We rapporteren een in vitro methode die de kwantificering van het werkelijke aantal adhesieve cellen binnen een endotheelcelmonolaag mogelijk maakt.

Kwantificering van endotheelcellen Hechtvermogen<em&gt; In Vitro</em

Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

We beschrijven een in-house ontworpen in vitro flow kamer model, waardoor het onderzoek naar bacteriële aanhankelijkheid aan het enten van de weefsels.

Een In Vitro Model van een Parallel-plaat perfusie-systeem te bestuderen van de naleving van de bacteriële om te enten van weefsels

We presenteren een in vitro vasculaire ziekte model om hele bloed interacties met patiënt-afgeleide endotheel te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om tromboogene eigenschappen van primaire endotheelcellen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. De methode is vooral geschikt om in situ tromboïgeniteit en antistollingstherapie te evalueren tijdens verschillende fasen van stolling.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Leer bacteriële hechting aan vaatwanden onder schuifspanning bestuderen met in vitro- en in vivo-modellen. Deze methode maakt real-time visualisatie van Staphylococcus aureus-adhesie mogelijk voor infectieonderzoek.

In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen

Meer video's verkennen