Name: Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Leer patch-clamp en live-fluorescentiemicroscopie voor nierfysiologie met vers geïsoleerd cystisch epitheel van knaagdieren. Deze methode meet ionkanaalactiviteit en intracellulaire calciumdynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag naar Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) en Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) bedanken voor de uitstekende technische hulp bij microscopie experimenten. Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health subsidies R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (naar OPO) en K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (naar OPO) en de Ben J. Lipps Research Fellowship van de American Society of Nephrology (DVI).

De hieronder beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op het Medical College of Wisconsin en de Universiteit van Texas Health Science Center in Houston en waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren. Figuur 1 toont de belangrijkste stappen van de isolatie weefsel en veredeling. In het kort worden de nieren van PCK of SD-ratten gebruikt voor het handmatig isoleren van epitheliale monolagen van verzamelbuizen hetzij van gezonde niet-gekozen buisjes of cysten. Hier studeerde we nieren 4-16 weken oud PCK ratten 10,13. 1. Isolatie van Nier cysten en aansluiten Buisjes (CNT) / Verzamelen Goten (CD) Segmenten <ol><li> Verdoven proefdier met isofluraan (5% inductie, 1,5 tot 2,5% onderhoud) / medische kwaliteit O 2 of een andere goedgekeurde methode. Dieren moeten voortdurend worden bewaakt om adequate le zorgenvel van de anesthesie. Stabiele ademhaling en teen knijpen reactie worden gebruikt om de juiste verdoving bevestigen. </li><li> Voer laparotomie en spoel de nieren met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) via de abdominale aorta 17. <ol><li> Bereid een polyethyleen buis catheter (PE50) en sluit hem aan op een injectiepomp gevuld met PBS. Snijd de huid en de buikwand langs de linea alba, maak dan een dwarse incisie in de buik over de buik van links naar rechts en de verschuiving van de buikorganen met wattenstaafjes om de toegang tot de dalende aorta komen met vertakkende mesenterische en coeliakie slagaders. Bevochtig de inwendige organen met warme zoutoplossing tijdens de verdere procedures om hun droogte te voorkomen. </li><li> Plaats een ligatuur (# 1) rond de mesenterische en coeliakie slagaders en andere ligatuur (# 2) rond de aorta onder het membraan (niet binden). Scheiden voorzichtig een. abdominalis door stomp ontleden bindweefsel rond het met dunne pincet en plaats twee ligaturen ~ 3mm onder de linker nierslagader (# 3) en boven de iliacale arteriën bifurcatie (# 4). </li><li> Bind ligatuur # 4 en voeg een vat klem rond de aorta tussen de linker nierslagader en ligatuur # 3. Maak een incisie tussen de klem en ligatuur # 4 naar de aorta katheteriseren, gebruiken ligatuur # 3 om de catheter stevig vast te stellen. </li><li> Laat de klem en zorg ervoor dat het bloed puls is zichtbaar in de katheter om de juiste installatie te verzekeren. Beginnen perfusie met een snelheid van 6 ml / min, das ligaturen # 1 en # 2, en snijd de linker nier ader. Verder spoelen gedurende 1-2 min tot de organen volledig geblancheerd. </li><li> Renale bloedvaten, urethra en de omliggende bindweefsel en vetweefsel knippen met een schaar aan de nieren te verzamelen. Maak dan een korte scheur in de nier capsule en schil de nieren om ze decapsulate. Plaats de nieren in ijskoud PBS. Euthanasie wordt bevestigd door een thoracotomie. </li></ol></li><li> Bereid 5 x 5 mm dekglas chips bekleed met poly-L-lysine. Snijd een cover GLAss met een diamant potlood en plaats ongeveer 20 ui 0,01% steriel gefiltreerd Poly-L-lysine oplossing op elk glas chip. Bereid zoutoplossing en twee paar horlogemaker tang voor dissectie. </li><li> Snijd de nieren met een scheermesje langs het frontale vlak in plakjes ~ 1-2 mm dik. Plaats een van de segmenten onder een stereomicroscoop. Isolatie van weefsels moet gebeuren in ijskoude zoutoplossing. </li><li> Lokaliseren cysten onder een stereomicroscoop als round-shape holtes (Figuur 2A); hun muren bevatten vaak prominente netwerk van verspreid bloedvaten. Gebruik fijne punt tang ontleden de interne epitheliale laag van een cyste zo dun mogelijk om een ​​monolaag gebied te verkrijgen. Maak het aan een glazen chip bedekt met poly-L-lysine. Kleverige Poly-L-Lysine oppervlak kan de onderzoeker stevig positioneren interne cyste laag op glas. Expose de cyste met de apicale kant naar boven om de toegang voor de pipetten (Figuur 2B) te verstrekken. </li><li> Gebruik PCK of SD rat kindney centrale schijfjes bevatten papilla voor isolatie van niet-verwijde CNT / CCDsegments 18-21. OPMERKING: Papillaire weefsels duurzamer dan cortex en houden papillaire buisvormige banden met een pincet en scheuren langs de radiale as van de plak kan worden gesplitst in dunne sectoren. Afzonderlijke buisjes zijn zichtbaar en kunnen worden getrokken op hoes glazen chips worden geplaatst. </li><li> Identificeren van de CNT / CCD segmenten van vertakkingen, grotere transparantie dan proximale buisjes en grote prominent zichtbare cellen (figuur 2C). Plaats het deksel glas chip met aangehechte buisjes onder een microscoop uitgerust met micromanipulators geschikt voor het rijden micropipetten. Met behulp van scherpe micropipetten split open buisjes en hechten hun randen aan het glas op het apicale oppervlak toegankelijk te maken (Figuur 2D). </li></ol> 2. Single Channel Patch-clamp elektrofysiologie <ol><li> Vul de patch-clamp kamer met bad oplossing en breng het deksel glas chipmet geïsoleerde weefsels naar de kamer. Zorg ervoor dat de patch-clamp micropipetten hebben weerstand van 10/07 MQ voor een betrouwbare on-cel (cel bevestigd) metingen. </li><li> Voor de cel bevestigd metingen, zet de versterker winst verhouding tot 20x en low-pass de stroming bij 300 Hz met een acht-polige Bessel-filter. Voor de bewaking ENaC kanalen, gebruikt een bad oplossing in mM: 150 NaCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7,4); pipet: 140 LiCl, 2 MgCl2 en 10 HEPES (pH 7,4). </li><li> Voer een conventionele patch-clamp experiment in een cel bevestigd modus 10. Selecteer een cel in de epitheliale monolaag en benaderen de pipet om het apicale membraan. Vormen een hoge weerstand afdichting tussen een pipet en celmembraan door het toepassen van zachte zuigkracht. Zodra een hoog resistente gigaohm afdichting wordt gevormd, zou een spleetvrije protocol op een bedrijf potentieel worden gestart voor de monitoring activiteit van het kanaal van belang. </li><li> Store gap-free enkel kanaal huidige gegevens van gigaOhm verbindingen voor daaropvolgende analyse. Analyseer het kanaal gebeurtenissen met behulp van een softwarepakket het algemeen geleverd met patch-clamp opstellingen 18. Bereken kanaalactiviteit als NPO waarbij N verwijst naar het aantal actieve kanalen in de pleister en P o gemiddeld geopend waarschijnlijkheid van de kanalen. OPMERKING: Gebruik geïsoleerde cysten of buisjes in patch-clamp experimenten niet meer dan 30 min. </li></ol> 3. Ratiometrische epi-fluorescent Metingen van de intracellulaire calciumconcentratie in de epitheelcellen <ol><li> Gebruik 5 mM Fura-02:00 opgelost in DMSO. Aliquot voorraad oplossing in individuele 500 pi conische buizen (ongeveer 10 pl). Beschermen tegen licht en op te slaan in de vriezer bij -20 ° C voor maximaal zes maanden. </li><li> Incubeer geïsoleerde cysten en split open buisjes voor 30-40 min in de PSS (in mm: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2 en 10 HEPES bij pH 7,35) met 5 uM Fura-02:00 kleurstof en 0,05% pluronzuur om verspreiding van de acetoxymethylesters. Daarvoor in de plaats weefsels 3,5 cm schaaltje met laden cocktail, bescherming tegen licht en incubeer op een langzame shaker bij kamertemperatuur. </li><li> Verander Fura-2 AM bevattende media te reinigen PSS na incubatie en plaats het weefsel onder een microscoop te epifluorescentie- beeldvorming verder voeren. </li><li> Schakel CCD camera en stabiele lichtbron (monochromator systeem) voorzien filterwiel (elk filter positie kan worden door zijn eigen demping niveau telkens het filter wordt geselecteerd). </li><li> Vind het weefsel in heldere gebied. Schakel om detectie van het fluorescentiesignaal en de intensiteit van de lichtbron via grijsfilters en lampvermogen verzadiging van het signaal te voorkomen. </li><li> Monitor Fura-2 AM fluorescentie in het weefselmonster met ratiometrische excitatie bij 340/380 nm met een frequentie van 0.125 Hz of hoger. Gebruik een 40 × / NA 1.3 of soortgelijke objectief voor de juiste resolutiesimage tie. </li><li> Voor beeldverwerking en berekeningen importeer de sequentie van beelden. Zorg ervoor om de kanalen te splitsen en gebruik een HyperStack grijstinten-modus. Selecteer meerdere regio&#39;s van belang (single cyste cellen of geselecteerde gebieden van cystische weefsel) en het berekenen van de intensiteit waarden voor elk kanaal (340 en 380 nm) in de voorkeur data-analyse software; aftrekken achtergrond intensiteit waarden van elk gegevenspunt. </li><li> Voor elk tijdstip berekent de verhouding van intensiteiten van de Fura-2 AM 340 om 380 kanalen. Perceel scatter / line point-time wijzigingen van Ca 2+ transient voor elke regio en het berekenen van de gemiddelde / SE waarden. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hier beschreven toepassingen van conventionele patch-clamp techniek en epifluorescentie calcium beeldvorming om cystic epitheelmonolagen afgeleid van een muizen genetisch model van ARPKD. Het protocol bestaat uit drie stappen, waarbij de meeste aandacht moet worden besteed aan de isolatie van de cysten (stap 1.5 van de sectie protocollen) en de elektrofysiologische studies. Deze belangrijke procedures vereisen uitgebreide training en geduld, en de lezer mag niet worden gefrustreerd tegelijk. <p class="jove_conten...

Ionenkanalen spelen een belangrijke rol in vele fysiologische functies, waaronder celgroei en differentiatie. Autosomaal dominante en recessieve polycystische nierziekten (ADPKD en ARPKD respectievelijk) genetische aandoeningen gekenmerkt door de ontwikkeling van renale vloeistof gevulde cysten van de buisvormige epitheelcel oorsprong. ADPKD wordt veroorzaakt door mutaties van PKD1 of PKD2 genen die polycystins 1 en 2, membraaneiwitten betrokken bij de regulering van celproliferatie en differentiatie. PKD2 op zichzelf of als een complex met PKD1 ook functioneren als een Ca2 + -doorlaatbare kationenkanaal 1. Mutaties van het gen dat codeert fibrocystin PKHD1 (a cilia-geassocieerde receptor-achtige eiwitten die betrokken zijn bij de tubulogenesis en / of onderhoud van polariteit van epitheel) de genetische impuls van ARPKD 2. Cyste groei is een complex fenomeen gepaard met verstoorde proliferatie 3,4, angiogenese 5, dedifferentiatie en het verlies van polaireteit van de tubulaire cellen 6-8. Defecte reabsorptie en augmented secretie in cystic epitheel bijdragen aan vochtophoping in het lumen en cyste uitbreiding 9,10. Verminderde doorstroming afhankelijk [Ca 2+] i signalering is ook gekoppeld aan cystogenesis tijdens PKD 11-15. Hier beschrijven we een werkwijze geschikt voor patch-clamp metingen van één kanaal activiteit en intracellulaire Ca2 + niveaus in cystic epitheliale monolagen geïsoleerd van PCK ratten. Deze methode werd met succes toegepast door ons te karakteriseren van activiteit van de epitheliale Na + kanaal (ENaC) 10 en [Ca 2+] i afhankelijke processen veroorzaakt door Ca 2+ -doorlaatbare TRPV4 en purinerge signalisatie cascade 13. In deze studies gebruikten we PCK ratten, een model van ARPKD veroorzaakt door een spontane mutatie in het gen PKHD1. De PCK stam was originally afkomstig van Sprague-Dawley (SD) ratten 16 daardoor SD ratten gekozen als controle voor vergelijking met de PCK stam. Daardoor kan zowel SD rat nefron segmenten en niet-verwijde verzamelbuizen geïsoleerd uit dezelfde PCK ratten dienen als twee vergelijkingsgroepen voor experimenten op cystic epitheel.

<table><tbody><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14185</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8</td><td>AAT Bioquest</td><td>21091</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68&nbsp;</td><td>oplossing</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Lichtbron</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Lambda XL</td><td>met geïntegreerde sluiter/filterwielbestuurder</td></tr><tr><td>Neutrale dichtheidsfilters</td><td>Nikon</td><td></td><td>ND4, ND8</td></tr><tr><td>Objectief</td><td>Nikon</td><td>SFluo&nbsp;</td><td>40/1.3 DIC WD 0.22&nbsp;&nbsp; olie</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor Technologies</td><td>Zyla sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon&nbsp; microscoop (invers)</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>Diamantpotlood</td><td>Fisher Scientific</td><td>22268912</td><td></td></tr><tr><td>Beeldverwervingssoftware</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware</td><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/</td><td>ND Utility plugin maakt het mogelijk om afbeeldingen te importeren in het native Nikon Instruments.nd2 formaat</td></tr><tr><td>Opname-/perfusiekamer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp versterker</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Dataverwervingssysteem</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&reg; Systeem</td></tr><tr><td>Laagdoorlaatfilter</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8 polige Bessel</td></tr><tr><td>Borosilicaatglas capillairen</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet-puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipet-puller</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japan</td></tr><tr><td>Gemotoriseerde micromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Invers microscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Microvibratie-isolatietafel</td><td>TMC</td><td></td><td>uitgerust met een Faraday-kooi</td></tr><tr><td>Meerkanaals klepperfusiesysteem</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Opname-/perfusiekamer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10 . 2</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurgestuurde chirurgische tafel&nbsp;</td><td>MCW kern</td><td></td><td>voor knaagdieren</td></tr><tr><td>Binoculair stereomicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp-gebaseerd perfusiesysteem</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen slang</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-anesthesie</td><td><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Andere basisreagentia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

implementeren patch clamp en live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde pkd epithelium monitor

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyste initiatie en uitzetting gedurende polycystische nierziekte is een complex proces gekenmerkt door afwijkingen in buisvormige celproliferatie, luminale vochtophoping en extracellulaire matrixvorming. Activiteit van ionkanalen en intracellulaire calcium signalering zijn belangrijke fysiologische parameters welke functies van tubulaire epitheel te bepalen. We ontwikkelden een methode geschikt is voor real-time observatie van ionkanalen activiteit met patch-clamp techniek en de registratie van de intracellulaire Ca 2+ niveau epitheelmonolagen vers geïsoleerd van renale cysten. PCK ratten, een genetisch model van autosomaal recessieve polycystische nierziekte (ARPKD), hier werden gebruikt voor de ex vivo analyse van ionkanalen en calcium flux. Hier beschreven is een gedetailleerde stap-voor-stap procedure die tot cystic monolagen en de niet verwijde buisjes van PCK of normaal Sprague Dawley (SD) ratten isoleren en controleren enkel kanaal activiteit en intracellulaire Ca2 + dynamiek.Deze methode niet enzymatische verwerking vereisen en maakt analyse in een inheemse setting van vers geïsoleerde epitheliale monolaag. Bovendien is deze techniek zeer gevoelig is voor intracellulaire calcium veranderingen genereert hoge resolutiebeelden voor nauwkeurige metingen. Tenslotte kunnen geïsoleerde blaas epitheel verder worden gebruikt voor kleuring met antilichamen of kleurstoffen, bereiden van primaire kweken en zuivering van verschillende biochemische assays.

Potentiële ENaC betrokkenheid bij cystogenesis is aangetoond door verscheidene studies die verstoorde epidermale groeifactor (EGF) waargenomen signalering in PKD progressie 22-25 en abnormale natrium reabsorptie in ARPKD muizenmodellen en weefselculturen 26-28. Zo Veizis et al. Toonde aan dat de amiloride gevoelige Na + absorptie verminderd bij CD cellen van de niet-orthologe BPK muismodel van ARPKD 29. We hebben onlangs aangetoond dat een verminderde natrium en water...

Ionenkanalen tot expressie in renale tubulaire epitheel spelen een belangrijke rol in de pathologie van polycystische nierziekte. Hier beschrijven we de experimentele protocollen die worden gebruikt om patch-clamp-analyse en intracellulaire calciumgehalte metingen uit te voeren in cystic epitheel vers geïsoleerd van knaagdieren nieren.

Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Het algemene doel van deze procedure is om de activiteit van enkelvoudige kanalen te registreren en veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie te meten in cysteuze monolagen die vers zijn geïsoleerd uit knaagdiermodellen voor polycystische nierziekte. Dit wordt bereikt door eerst de PCK rec-nieren via de abdominale aorta door te spoelen om bloed uit het nierweefsel te verwijderen. De tweede stap is het isoleren van de epitheliale monolayer van de cysten.Vervolgens kan de geïsoleerde monolaag worden gebruikt voor conventionele patchclamp-metingen van ionkanalen in de apicale membranen van epitheelcellen. Het geïsoleerde weefsel kan ook worden gebruikt voor het laden met calciumkleurstoffen, om veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie in de epitheelcellen te kwantificeren.Deze parameters, gemeten in de natuurlijke omgeving van cysten, kunnen worden vergeleken met gezonde tubuli om het proces van cystagenese te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de chi-kanaalactiviteit en de calciumflux in de niercysten te bestuderen. Deze analyse levert fysiologisch relevante gegevens op, verkregen uit vers geïsoleerde weefsels.Met deze aanpak kunnen we de activiteit van individuele kanalen in vers geïsoleerde epithelia monitoren. Het is een unieke methode omdat deze kan worden gebruikt om het gedrag van ijzerkanalen nauwkeurig te karakteriseren met behulp van verschillende modificaties van de patchtechniek. We zijn in staat om de respons van kanalen op diverse geneesmiddelen te testen in cystische en gezonde tubuli.De vers geïsoleerde cystemonlaag kan worden gebruikt voor intracellulaire calciumimaging. Deze techniek maakt farmacologische screening en functionele studies van de intracellulaire calciumhomeostase in cystecellen mogelijk, wat belangrijke middelen zijn voor het ontdekken van nieuwe behandelingen ter preventie van polycystische nierziekte. De zorg voor het bloedloos maken zal de chirurgische benadering laten zien die wordt gebruikt om de nieren bloedvrij te maken.De isolatieprocedures van de nier en cysten worden eerst gedemonstreerd. Begin deze procedure door een laparotomie uit te voeren en spoel de nieren van een geanestheseerde rat met PBS via de abdominale aorta. Sluit hiervoor een polyethyleen slangcatheter aan op een spuitenpomp gevuld met PBS.Snijd de huid en de buikwand langs de abdominale middellijn en verschuif de abdominale organen met wattenstaafjes om toegang te krijgen tot de aorta descendens met de vertakkende arteriae mesentericae en coeliacae. Plaats vervolgens de eerste ligatuur rond de arteriae mesentericae en coeliacae en de tweede ligatuur rond de aorta, onder het diafragma.Scheid de aorta ADOS voorzichtig door het bindweefsel eromheen met een pincet stomp te dissekeren. Plaats vervolgens de derde ligatuur ongeveer drie millimeter onder de linker nieraorta en de vierde ligatuur boven de bifurcatie van de arteriae iliacae. Knoop de vierde ligatuur aan en bevestig een vatklem rond de aorta tussen de linker nieraorta en de derde ligatuur.Maak een incisie tussen de klem en de vierde ligatuur om de aorta te catheteriseren. Gebruik vervolgens de derde ligatuur om de katheter stevig te fixeren. Laat nu de klem los.Controleer of de bloedpuls zichtbaar is in de katheter om een correcte installatie te waarborgen. Start vervolgens de perfusie en knoop de eerste en tweede ligaturen vast. Snijd daarna snel de linker niervene door om de druk te verlagen.Ga door met spoelen gedurende één tot twee minuten totdat de organen volledig bleek zijn. Snijd vervolgens de nierbloedvaten, de urinebuis en het omringende bind- en vetweefsel door. Om de nieren uit te snijden, maakt u een kleine scheur in het nierkapsel en pelt u de nieren om ze te inkapselen.Plaats de nieren vervolgens in ijskoud PBS. Bereid daarna dekglasplaatjes van 5 bij 5 millimeter en 25 bij 25 millimeter voor, gecoat met poly-L-lysine.Snijd de nieren met een scheermes langs het frontale vlak in plakjes van één tot twee millimeter dik. Plaats vervolgens een van de plakjes onder een stereomicroscoop. Lokaliseer de cysten, die zichtbaar zijn als ronde holtes, met behulp van fijngetippedte pincetten.Dissekeer de interne epitheellaag van een cyste zo dun mogelijk om een monolayer-oppervlak te verkrijgen. Bevestig deze vervolgens aan een glazen chip bedekt met polylysine en positioneer de cysten met de apicale zijde naar boven. Vul de patchclampkamer met badoplossing om de pipetten toegang te geven voor het uitvoeren van elektrofysiologie. Plaats vervolgens de coverglasschip met de geïsoleerde weefsels in de kamer.Selecteer een cel in de epitheliale monolaag en benader een typisch membraan met een patch-pipet. Voer daarna een conventieeel patch-clamp experiment uit in de cell-attached modus. Plaats bij deze procedure de geïsoleerde cysten en opengebroken tubuli in een schaal van drie en een halve centimeter met PSS; voeg 5 µM flu, 8 HD en 0,05% onzuur toe om de dispersie van de acet-meth-esters te bevorderen.Bescherm het monster vervolgens tegen licht en incubeer het op een langzame schudmachine bij kamertemperatuur gedurende 30 tot 40 minuten. Spoel na incubatie het incubatiemedium uit met schone PSS. Plaats het weefsel vervolgens onder een confocale microscoop om vervolgens fluorescentie-imaging uit te voeren.Schakel de software voor confocale acquisitie in. Zet vervolgens de argonlaser aan op 488 nanometer excitatie en stel de emissie in op 520 over 25 nanometer. Lokaliseer daarna het weefsel in bright field.Monitor de flu oh acht H-fluorescentie in het weefselmonster met een frequentie van 0,25 hertz of hoger. Dien TP of andere farmacologische modulatoren toe om een toename van de intracellulaire calciumconcentratie te induceren. Hier worden de representatieve stroomsporen getoond voor de activiteit van het epitheliale natriumkanaal, gemeten in cell-attached patches van vers geïsoleerde cysten van 16 weken oude PCK-ratten na een behandeling met benzoyl en drinkwater gedurende 12 weken.Gestreepte lijnen geven de respectievelijke huidige toestand aan, waarbij C en op n staan voor de gesloten en open toestanden. Deze grafiek vat de waargenomen activiteit van het epitheliale natriumkanaal samen, waarbij benzoyl, een selectieve remmer van het epitheliale natriumkanaal, de activiteit van het epitheliale natriumkanaal significant verminderde. Deze video toont de cystische monolaag geladen met flu oh acht H voor en na de toevoeging van 10 µM ATP. De toename in de intensiteit van het groen fluorescerende signaal is zichtbaar wanneer de intracellulaire calciumconcentratie stijgt als reactie op ATP. Deze grafiek vat het effect van ATP op de calciumspiegels in de cel samen.Toepassing van een TP op een monolaag van PCK-ratten veroorzaakt een snelle stijging van het intracellulaire calciumgehalte, dat binnen twee of drie minuten terugkeert naar het basale niveau. Deze techniek biedt een unieke mogelijkheid om veranderingen in de calciumflux en ijzerkanaalactiviteit in de cysteuze nieren te monitoren. Naast het karakteriseren van de activiteit van het cellulaire natriumkanaal en de calciuminstroom bij PCK-ratten, kan deze aanpak worden gebruikt voor het analyseren van andere ijzerkanalen in meerdere AR- en A-D-P-K-D-modellen.

implementing-patch-clamp-live-fluorescence-microscopy-to-monitor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We zullen zien hoe het effect van een enkele puntmutatie op de functie van een ionkanaal studie.

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

In deze video laten we zien visualisatie van PKC translocatie in levende cellen met behulp van fluorescent gelabelde PKCS.

Live-beeldvorming van PKC Translocatie in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen

This video outlines a method for simultaneously imaging and recording electrical activity from transgenic brain slices that contain neuron-specific fluorescent proteins. The procedure involves maintaining the brain slice in a perfusion chamber with aerated artificial cerebrospinal fluid, using a light source to excite fluorescent-labeled cells, and recording the electrical signals with a multichannel probe and patch clamp.

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

In this video, embryonic kidney cell cultures expressing light-dependent ion channel proteins fused with a fluorescent reporter demonstrate the effect of light on ion movement. Whole-cell patch clamp is used to monitor the movement of ions.

Optogenetic Electrophysiology Recording of Cells with Light-Dependent Ion Channels

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Veranderingen in de intracellulaire calciumniveaus in de podocyten zijn een van de belangrijkste middelen om de filtratiefunctie van glomeruli te beheersen. Hier leggen we een high-throughput benadering uit die detectie van real-time calciumverwerking en activiteit van enkele ionkanalen in de podocyten van de vers geïsoleerde glomeruli mogelijk maakt.

Single-channel Analyse en Calcium Imaging in de podocytes van de Vers geisoleerde glomeruli

Een methode voor stimulatie van in-vitro celcultuur elektrische activiteit met zichtbaar licht, gebaseerd op het gebruik van organische halfgeleidende polymeren, wordt beschreven.

Optische controle van levende cellen elektrische activiteit van geconjugeerde polymeren

Dit artikel beschrijft hoe de ion-selectiviteit van channelrhodopsine wordt bepaald met elektrofysiologische whole-cell patch-clamp opnames met behulp van HEK293 cellen. Hier wordt de experimentele procedure voor het onderzoeken van chloride-selectiviteit van een anion-selectieve channelrhodopsine gedemonstreerd. De procedure is echter overdraagbaar naar andere channelrhodopsinen met een verschillende selectiviteit.

Whole-cell Patch-clamp opnames voor elektrofysiologische bepaling van de ion selectiviteit in channelrhodopsins

Wij presenteren een protocol dat celisolatie en volledige cilinder patch-clamp opname combineert om de elektrische eigenschappen van de primaire gedissocieerde epitheelcellen van de rat cauda epididymiden te meten. Dit protocol maakt het mogelijk om de functionele eigenschappen van primaire epididymale epitheelcellen te onderzoeken om de fysiologische rol van de epididymis verder te verduidelijken.

Hele-cel patch-klem opnames van geïsoleerde primaire epitheliale cellen uit de epididymis

Dit protocol beschrijft hoe u automatische beeldgeleide patch-clamp experimenten kunt uitvoeren met behulp van een systeem dat onlangs is ontwikkeld voor standaard in vitro elektrofysiologie apparatuur.

Toepassing van geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp voor de studie van neuronen in hersenschijven

Het doel van dit protocol is om intacte pacemakergebieden van het nierbekken van de muis te isoleren met behulp van vibratoomsecties. Deze secties kunnen vervolgens worden gebruikt voor in situ Ca2+ beeldvorming om Ca2+ transiënte eigenschappen van pacemakercellen en andere interstitiële cellen in vibratoomsegmenten te verduidelijken.

Isoleren en beeldvorming Live, intact pacemakergebieden van het nierbekken van de muis door vibratoomsecties

Leer patch-clamp en live-fluorescentiemicroscopie voor nierfysiologie met vers geïsoleerd cystisch epitheel van knaagdieren. Deze methode meet ionkanaalactiviteit en intracellulaire calciumdynamica.

Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor (Video) | JoVE Journal

Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor

Meer video's verkennen