Fysieke Isolatie van Endospores van milieu monsters door Gerichte Lysis van vegetatieve cellen

Het algemene doel van deze procedure is om bacteriële endosporen te scheiden van complexe microbiële monsters, zoals sediment. Deze methode helpt om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van microbiologie over de aanwezigheid en abundantie van endosporen in natuurlijke monsters. Het is gebaseerd op een verschil in weerstand tussen endosporen en vegetatieve cellen ten opzichte van chemicaliën en warmte. Het grote voordeel van deze techniek is dat de methode niet destructief is voor endosporen, zodat ze kunnen worden gebruikt voor downstream-experimenten zoals cultivatie, kwantificering en metabolische tests.

Hoewel we deze methode hebben ontworpen om te werken met de ecologie van endosporevormende bacteriën, kan deze ook worden gebruikt in gebieden zoals exobiologie of de voedingsmiddelenindustrie, waarbij sporen gunstig of nadelig kunnen zijn. Na het voorbereiden van oplossingen en apparatuur volgens het tekstprotocol, gebruik onder een UV gesteriliseerde bioveiligheidskast ethanol ontstoken metalen schepjes om drie gram sedimentmonster toe te voegen aan vooraf gewogen, steriele 50 milliliter buizen. Gebruik een steriele, gegradueerde buret om 15 milliliter van een steriele, gefilterde 1% natriumhexametafosfaat, of SHMP-oplossing aan het monster toe te voegen.

Met een vloeibare dispersieur of homogenisator en een steriele dispersierotor, homogeniseer het monster gedurende één minuut bij 17.500 RPM. Laat het monster twee minuten rusten en herhaal de homogenisatie. Laat het monster 10 minuten rusten om de zwaarste deeltjes te laten bezinken.

Breng het supernatant dat de celbiomassa bevat over in een schone 50 milliliter buis, zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Voeg nog eens 15 milliliter SHMP toe aan de gesedimende pellet en herhaal de homogenisatie voordat je het supernatant verzamelt en combineert met de eerste aliquot. Centrifugeer het monster gedurende één minuut bij 20 keer G en breng het supernatant over in een verse 50 milliliter buis voordat je de pellet weggooit.

Zodra de filtratie-eenheid en vacuümpomp zijn voorbereid volgens het tekstprotocol, gebruik ethanolvlam om pincetten te steriliseren om steriele nitrocellulosemembraan toe te voegen aan de filtratie-eenheid. Voeg de helft van het zojuist bereide supernatant toe aan de membraanfiltratie-eenheid en gebruik de vacuümpomp om de cellen op het membraan te verzamelen. Wanneer het vocht volledig door het filter is gegaan, stop de vacuümpomp.

Gebruik gesteriliseerde pincetten om het membraan voorzichtig te verwijderen en plaats het in een steriele petrischaal. Met een vers stuk steriele membraan herhaal de filtratie met de resterende helft van de oplossing. Om endosporen te scheiden van vegetatieve cellen in de zojuist verzamelde biomassa ontdooi het membraan als het bevroren was en gebruik ethanol ontstoken gesteriliseerde schaar om het in kleinere stukken te snijden.

Breng de membraanstukken over in een steriele twee milliliter buis en voeg 900 microliter 1X TE-buffer toe. Meng grondig door te vortexen om de biomassa van het membraan te laten loslaten. Incubeer de buis gedurende 10 minuten bij 65 graden Celsius en 80 RPM.

Verwijder vervolgens de buis uit de incubator en laat deze gedurende 15 minuten afkoelen. Voeg 100 microliter vers bereid lysozyme toe tot een eindconcentratie van twee milligram per milliliter en incubeer het monster gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius en 80 RPM om de vegetatieve cellen te lyseren. Nadat de lysis voltooid is, voeg 250 microliter 3 normaal natriumhydroxide en 250 microliter 6% SDS-oplossing toe aan het monster.

Incubeer bij kamertemperatuur en 80 RPM gedurende 60 minuten. Bereid vervolgens een steriele filtratie-eenheid voor die membranen met een diameter van 25 millimeter bevat door autoclavage. Nadat de filtratie-eenheid is afgekoeld, plaats een 25 millimeter diameter 0,2 micrometer nitrocellulosemembraan erop.

Breng het monster op het membraan aan en gebruik de vacuümpomp om de vloeistof te filteren, waarbij de endosporen op het membraan worden gevangen, terwijl het vegetatieve cellenmateriaal erdoorheen gaat. Om resterende detergenten af te wassen, voeg je twee milliliter steriele fysiologische oplossing toe aan het membraan en breng je de vacuümpomp aan. Wanneer de vloeistof volledig is gefilterd, zet je de pomp uit en laat je het membraan op de filtratie-eenheid.

Om DNase-behandeling direct op het membraan uit te voeren, breng je 450 microliter steriele water, 50 microliter 1X DNase-reactiebuffer en 0,5 microliter DNase-enzym op het membraan aan en laat je het ongeveer 15 minuten staan bij 25 graden Celsius. Het extracellulaire DNA dat eerder is vrijgegeven door geliseerde cellen wordt enzymatisch verteerd en vervolgens afgewassen. Dit zorgt ervoor dat de uiteindelijke endospore-bereiding vrij is van extern DNA, wat belangrijk is voor downstream-analyse zoals moleculaire analyse.

Het is belangrijk om te onthouden dat er geen lekkage mag zijn op het filterapparaat en dat het monster niet mag uitdrogen. Na de incubatie voeg je één milliliter fysiologische oplossing toe en zet je de pomp aan om de resterende enzym van het monster af te wassen. Gebruik steriele pincetten om het membraan met endosporen over te brengen in een steriele petrischaal.

Analyseer het monster volgens het tekstprotocol. Het protocol dat in deze video wordt gedemonstreerd van gerichte lysis van vegetatieve cellen resulteert in een gezuiverd endosporemonster en een significante toename van de fractie van endosporevormende firmicutes. In amplicon-sequencing van het 16S ribosomale RNA-gen corresponderen firmicutes in onbehandelde monsters met slechts 8% tot 19% van de sequenties.

In tegenstelling hiermee vertegenwoordigden firmicutes na behandeling 90,6% en 83,9% van het endosporerijke monster. De twee belangrijkste ordes van endosporevormende firmicutes, bacillales en clostridiales, werden verrijkt, terwijl niet-endosporevormende firmicutes zoals lactobacillales afwezig waren. De efficiëntie van de behandeling werd ook aange