Name: Fysieke Isolatie van Endospores van milieu monsters door Gerichte Lysis van vegetatieve cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer een methode voor fysieke isolatie van bacteriële endosporen uit milieumonsters door gerichte lysis van vegetatieve cellen. Deze niet-destructieve techniek maakt downstream experimenten zoals kweek en metabole testen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de Swiss National Science Foundation voor Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 en nr 151.948 en Fundation Pierre Mercier pour la Science.

1. Bereiding van chemicaliën en apparatuur <ol><li> Voeg 500 ml van een 1% natriumhexametafosfaat (SHMP) (NaPO 3) n-oplossing en te steriliseren in de autoclaaf. </li><li> Steriliseren nitrocellulose (NC) filters (poriegrootte 0,22 pm, een diameter van 47 mm) in de autoclaaf in gesloten glazen petrischaaltjes. </li><li> Steriliseren NC filters (poriegrootte 0,22 pm, diameter 25 mm) in de autoclaaf in gesloten glazen petrischaaltjes. </li><li> Weeg en noteer het leeggewicht van de steriele 50 ml buizen (met pet op) (één tube per monster). </li><li> Bereid Tris-EDTA-buffer (TE-buffer) 1x: maak oplossing van 10 mM Tris (tris (hydroxymethyl) aminomethaan) en 1 mM EDTA buffer. Stel de pH tot 8 en steriliseer in de autoclaaf. </li><li> Bereid lysozym oplossing (20 mg / ml) door het oplossen van 0,02 g lysozym in 1 ml TE-buffer. Idealiter maken fris elke keer. Bewaren bij 4 ° C voor niet meer dan 1 week. </li><li> Bereid fysiologische oplossing door het oplossen van 8 g / L natriumchloride(NaCl) in gedestilleerd water. Steriliseren in autoclaaf. </li></ol> 2. Scheiding van biomassa uit sediment <ol><li> Voeg 3 g sediment monster vooraf gewogen steriele 50 ml buizen met behulp van ethanol gevlamd metalen bolletjes. Voer deze in een schone, UV gesteriliseerde bioveiligheid kast om besmetting te voorkomen. </li><li> Voeg 15 ml van een 1% steriele (autoclaaf) SHMP oplossing voor het monster met een steriele afgestudeerd buret. De SHMP oplossing kan ook worden gefilterd om besmetting te voorkomen. </li><li> Homogeniseer het sediment en SHMP oplossing met een vloeibare verstrooier / homogenisator (bijvoorbeeld Ultra-Turrax homogenisator). 70% ethanol-of stoom steriliseren de dispersie rotor vóór gebruik. Voer het homogeniseren gedurende 1 min bij 17.500 rpm. Laat het monster 2 minuten rusten en herhaal het homogeniseren gedurende 1 minuut bij dezelfde rotorsnelheid. </li><li> Laat het monster staan ​​voor 10 min. Bij deze stap, zal de zwaarste deeltjes (mineralen) te beslechten. De cellen en de organische bestanddelen van het monster evenwel wziek in oplossing blijven. Daarna breng de bovenstaande oplossing (met cel biomassa) in een schone 50 ml tube, terwijl de zorg het sediment pellet niet te verstoren. </li><li> Om het sediment pellet toe weer 15 ml van een 1% steriele (autoclaaf) SHMP oplossing met behulp van een steriele afgestudeerd buret. Dan stappen herhalen 2.3 en 2.4. Deze herhaling zorgt voor de scheiding van de maximale hoeveelheid cellen en organische deeltjes van de minerale component van het sediment. Het supernatant van deze tweede scheiding kan worden samengevoegd met de supernatant uit de eerste scheidingszone. Opmerking: De volgende stappen worden allen uitgevoerd op het supernatant (cel bevattende biomassa). De minerale component (sediment pellet) worden weggegooid. </li><li> Centrifugeer het monster bij 20 xg gedurende 1 min. Deze stap verhoogt de g-kracht genoeg om kleine minerale deeltjes bezinken, terwijl de biologische cel materiaal blijft in oplossing. Na centrifugeren breng de bovenstaande oplossing (bevattende cel biomassa) in eenschoon 50 ml buis. Gooi het mineraal pellet. </li><li> Bepaal het eindvolume van de oplossing bevattende biomassa door weging van het monster. Het gewicht bepaling wordt voorkomen dat het monster over te dragen aan een maatcilinder en vermindert het risico op besmetting. </li></ol> 3. Het verzamelen van biomassa op filtermembraan <ol><li> Bereid filtratie-eenheid (47 mm diameter membranen) en vacuümpomp. Steriliseer de filtratie-eenheid ofwel de autoclaaf of (indien Pyrex glas) door besproeien met 70% ethanol en vlammen met een bunsenbrander. Laat het afkoelen voordat u verder gaat met het protocol. </li><li> Voeg steriel NC membraan naar de filtratie-eenheid met behulp van ethanol gevlamd gesteriliseerde pincet. </li><li> Voeg de helft van de supernatant monster (van stap 2,6) op de membraanfiltratie-eenheid en het verzamelen van cellen op het membraan met behulp van de vacuümpomp. </li><li> Wanneer de vloeistof volledig is door het filter, stop de vacuümpomp en verwijder het membraan met behulp ethanol-vlam gesteriliseerd pincet. Plaats het membraan in een steriele petrischaal. <ol><li> Snijd het membraan in de helft gebruik van ethanol gevlamd gesteriliseerd schaar. Naar elke helft van het membraan om een ​​aparte 2 ml buis. Eén helft van het membraan wordt gebruikt voor DNA-extractie en analyse van het volledige bacteriële gemeenschappen. De andere helft van de filter wordt opgeslagen bij -80 ° C en dient als backup. </li></ol></li><li> Plaats nieuwe NC membraan op de filtratie-eenheid en het verzamelen van biomassa uit de tweede helft van het monster volume (van stap 2.6) met behulp van de vacuümpomp. </li><li> Wanneer de vloeistof volledig is door het filter, stop de vacuümpomp en verwijder het membraan met behulp van ethanol gevlamd gesteriliseerde pincet. Plaats het gehele membraan in een afzonderlijke 2 ml buis. Dit monster wordt gebruikt voor de behandeling endosporen scheiden van vegetatieve cellen. Het monster kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik. </li></ol> 4. Lysis van vegetatieve cellen <ol><li> Voer debehandeling endospores van vegetatieve cellen te scheiden van de biomassa eerder verzamelde op een NC membraan (stap 3.6). <ol><li> Indien het membraan werd bevroren, laat het op kamertemperatuur 10 minuten te ontdooien. Plaats dan het membraan in een steriele petrischaal en snijd het (ongeveer 4 keer) in kleinere stukken met behulp van ethanol gevlamd gesteriliseerd schaar. Plaats dan alle membraanfilter stukken in een steriele 2 ml buis. </li></ol></li><li> Voeg 900 ul 1x TE (Tris-EDTA) buffer (zie 1.5) aan de buis met het monster membraan en meng goed door de vortex. Bij deze stap wordt de biomassa uit het membraan in de TE-bufferoplossing. </li><li> Plaats de buis in een incubator bij 65 ° C gedurende 10 min en 80 rpm. Daarna verwijdert de buis uit de incubator en laat het afkoelen gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg 100 ul vers bereide lysozyme (zie 1.5) tot een eindconcentratie van 2 mg / ml te bereiken. Laat de lysozym niet toe te voegen voordat het monster is afgekoeld tot 37 ° C, omdat dit zou kunnen degrade het enzym. </li><li> Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 60 min en 80 rpm, de optimale voorwaarden voor lysozym vegetatieve cellen lyseren. </li><li> Na lysis is voltooid, voeg 250 gl 3 N natriumhydroxide (NaOH) en 250 pl 6% natriumdodecylsulfaat (SDS) oplossing van het monster. Door toevoeging van deze, het monstervolume bereikt 1,5 ml en er is een eindconcentratie van 0,5 N NaOH en het uiteindelijke concentratie van 1% SDS. </li><li> Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 60 min en 80 rpm. Het toevoegen van de basis en wasmiddelen zal helpen bij het laatste cellysis. De concentratie van deze detergentia is geoptimaliseerd om geen endosporen schaden, terwijl lyseren vegetatieve cellen. </li><li> Bereid een steriele filtratie-eenheid die 25 mm diameter membraan houdt de autoclaaf, of (indien Pyrex glas) besproeien met 70% ethanol en vlammen met een bunsenbrander. Laat het afkoelen. </li><li> Plaats een 0,2 urn NC membraan (25 mm diameter) van de filtratie-eenheid met behulp van ethanol vlam gesteriliseerde pincet. &lt;/ li&gt; <li> Voeg het monster van stap 4.7 op het membraan en filtreren van de vloeistof met de vacuümpomp. Wanneer vloeistof door voorbij is, schakelt de vacuümpomp. Bij deze stap wordt de vegetatieve gelyseerd celmateriaal verwijderd, aangezien het niet op het membraan vastgehouden. Slechts endosporen wordt op het membraan achterblijven. </li><li> Voeg 2 ml steriele fysiologische oplossing te wassen resterende detergenten en filteren de vloeistof met behulp van de vacuümpomp. </li><li> Wanneer vloeistof volledig is gefilterd, schakelt de vacuümpomp. Laat het membraan op de filtratie-eenheid. </li></ol> 5. DNase behandeling Opmerking: Voer de DNase behandeling direct op het filter membraan. Het is belangrijk dat het filtersysteem niet lekt en de vacuümpomp uitgeschakeld. <ol><li> Voeg 450 ul van steriel water, 50 pl DNase reactie buffer (1x) en 0,5 ul DNase enzym direct op het filter membraan en laat het staan ​​voor 15 min. Als het mogelijk is, doe dit de spijsvertering in een kamer die een beetje oorlogmer dan gemiddeld RT, aangezien het enzym beter werkt bij een temperatuur van 25 ° C en hoger. Opmerking: Houd de bunsenbrander vernietiging van het filtersysteem verhoogt ook de temperatuur en heeft het extra voordeel van het houden van de steriele omgeving, dus minder kans op contaminatie van de monsters. </li><li> Wanneer de DNase spijsvertering is voltooid, zet vacuümpomp om het enzym uit het monster te verwijderen. </li><li> Afwassen resterende enzym door het toevoegen en het filteren van 1 ml fysiologische oplossing. </li><li> Als er vloeistof volledig voorbij is, schakelt vacuümpomp en verwijder het filter membraan dat endospores met steriele pincet en leg het in een steriele petrischaal. Opmerking: Het monster afgescheiden endospores is nu klaar voor downstream analyse. Bewaar bij -20 ° C indien gebruikt voor DNA-extractie of alternatief bij 4 ° C indien voor kweekdoeleinden. </li></ol>

<ol><li>Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Bacillus+endospores+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Roles of Bacillus endospores in the environment.</a> Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).</li>
<li>Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microflora+of+extreme+arid+Atacama+Desert+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microflora of extreme arid Atacama Desert soils.</a> Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).</li>
<li>Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+archaea+and+bacteria+dominate+stable+microbial+communities+in+North+America%27s+Largest+Hot+Spring%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring.</a> Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).</li>
<li>Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+prokaryotic+diversity+in+the+genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring prokaryotic diversity in the genomic era.</a> Genome Biol. 3 (2), (2002).</li>
<li>Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+genes+in+members+of+the+low+G%2BC+Gram-type-positive+phylogenetic+branch+%28Firmicutes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes).</a> Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).</li>
<li>Delmont, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+the+soil+metagenome+for+studies+of+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).</li>
<li>Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRicca%2C+E+%22Bacterial+spore+formers%3A+probiotics+and+emerging+applications%22">Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications</a>. , Horizon Bioscience. (2004).</li>
<li>Kuske, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Scale+DNA+Sample+Preparation+Method+for+Field+PCR+Detection+of+Microbial+Cells+and+Spores+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil.</a> Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phylogenetic+assessment+of+microbial+communities+in+diverse+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments.</a> Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+0+sporulation+gene+A+as+a+molecular+marker+to+study+diversity+of+endospore-forming+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes.</a> Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).</li>
<li>Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+spore-forming+bacteria+in+an+acid+forest+soil%2C+with+special+reference+to+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+General+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis.</a> J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).</li>
<li>Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacterial+endospores+in+soil+by+terbium+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence.</a> Int J Microbiol. , 435281(2011).</li>
<li>Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+variations+in+endospore+numbers+within+tidal+flat+sediments+revealed+by+quantification+of+dipicolinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Geomicrobiol+J%22%5BJournal%5D)">High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid.</a> Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).</li>
<li>Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+flow+cytometry+in+the+study+of+Bacillus+cereus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus.</a> J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).</li>
<li>de Rezende, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersal+of+thermophilic+Desulfotomaculum+endospores+into+Baltic+Sea+sediments+over+thousands+of+years%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years.</a> ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).</li>
<li>Hubert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermophilic+anaerobes+in+Arctic+marine+sediments+induced+to+mineralize+complex+organic+matter+at+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature.</a> Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).</li>
<li>Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+Bacillus+spp.+in+agricultural+soil+under+different+management+regimes+detected+via+PCR-DGGE%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE.</a> Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).</li>
<li>Brill, J. A., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+spore-forming+and+asporogenic+bacteria+using+a+PCR+and+southern+hybridization+based+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method.</a> J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).</li>
<li>Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+PCR+assay+targeting+the+sporulation+gene%2C+spo0A.%2C+for+the+enumeration+of+thermophilic+bacilli+in+milk+powder%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder.</a> Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).</li>
<li>Bueche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+endospore-forming+firmicutes+by+quantitative+PCR+with+the+functional+gene+spo0A%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endospore-enriched+sequencing+approach+reveals+unprecedented+diversity+of+Firmicutes+in+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments.</a> Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).</li>
<li>Nicholson, W. L., Law, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+purification+of+bacterial+endospores+from+soils%3A+UV+resistance+of+natural+Sonoran+desert+soil+populations+of+Bacillus+spp.+with+reference+to+B.+subtilis+strain+168%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168.</a> J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De weerstand van endosporen externe agressieve fysisch-chemische factoren (bijvoorbeeld temperatuur of detergenten) werd gebruikt om een methode om bacteriële endosporen scheiden van vegetatieve cellen milieumonsters bedenken. Dit is de eerste uitgebreide methode endosporen van milieumonsters te isoleren op een niet-destructieve wijze. Vorige methoden te kwantificeren, sporen of endospores in monsters te analyseren gebaseerd op de meting van specifieke proxies voor endosporen zoals dipicolinezuur of specifieke ...

Het doel van dit werk is om een ​​protocol voor de scheiding van bacteriële endosporen van vegetatieve bacteriële cellen in het milieu monsters. De vorming van bacteriële endosporen een overlevingsstrategie, gewoonlijk veroorzaakt door verhongering gevonden in een aantal bacteriële groepen die tot phylum Firmicutes 1. Endospore-vormende bacteriën zijn goed bestudeerd, vooral omdat een aantal stammen zijn ziekteverwekkers en dus van medisch belang (bijvoorbeeld Bacillus anthracis of Clostridium difficile). Milieu stammen van endospore-vormende bacteriën zijn geïsoleerd uit vrijwel elke omgeving (bodem, water, sedimenten, lucht, ijs, menselijke darm, dieren gut, en meer) 1-3. Daarom Firmicutes zijn de tweede meest voorkomende stam in cultuur collecties 4. Door hun sterke buitenste cortex en beschermende kern eiwitten, kan endospores extreme omstandigheden, variërend fr overlevenOM verdroging te hoge straling, extreme temperaturen en schadelijke chemische stoffen 5. Deze opmerkelijke weerstand maakt het een uitdaging om DNA uit endospores 6-8 halen. Dit verklaart waarschijnlijk waarom ze zijn over het hoofd gezien in het milieu sequencing studies 9,10. Andere methoden, zoals de concentratie van endospores milieumonsters door fluorescente antilichamen 11, kwantificatie van dipicolinezuur (DPA) in grond en sediment 13 12 flowcytometrie 14 of pasteurisatie en daaropvolgende kweek 15,16 zijn gebruikt om endosporen halen of kwantificeren milieu monsters. In de afgelopen jaren, geoptimaliseerde DNA-extractie werkwijzen en specifieke moleculaire primers te richten endospore-specifieke gensequenties ontwikkeld 10,17-20. Dit heeft bijgedragen aan meer biodiversiteit onder deze groep van bacteriën 21 onthullen en heeft ook geleid tot toepassingen in de industrie en de geneeskunde voor de detectie van endosporesBijvoorbeeld in melkpoeder 19. De hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op het verschil in weerstand tegen schadelijke fysisch-chemische omstandigheden (zoals warmte en detergenten) van bacteriële endosporen opzichte van vegetatieve cellen. Om vegetatieve cellen in een monster te vernietigen, we achtereenvolgens toepassen warmte, lysozym en lage concentraties van detergenten. De tijd en de sterkte van deze behandelingen zijn geoptimaliseerd om geen sporen te vernietigen, maar voor alle vegetatieve cellen lyseren. Sommige cellen in een milieu celpool meer resistent dan andere, dus om de kans op het vernietigen van alle vegetatieve cellen verhogen we drie behandelingen toegepast. Het voordelig nieuwheid van deze werkwijze is dat de endosporen na de behandeling nog steeds intact en kan worden gebruikt voor verdere stroomafwaartse analyses. Deze omvatten DNA-extractie, kwantitatieve PCR (qPCR) en amplicon of metagenomic sequencing (gericht op met name de groep van endospores en dus het verminderen van diversity, terwijl het verhogen van de dekking). De endosporen kan ook worden gebruikt voor stroomafwaartse cultuur- of kwantificatie met behulp van fluorescentie microscopie, flow cytometrie, of detectie van DPA. Een belangrijk kenmerk van deze methode is dat door een onbehandeld monster met een behandeld monster, kan men de hoeveelheid en de diversiteit van endosporen afleiden in een milieumonster naast de component die overeenkomt met vegetatieve cellen.

<table><tbody><tr><td>Whatman nitrocellulose membraanfilters, 0,2 &#956;m poriegrootte, 47 mm diameter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182004 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859 Sigma-Aldrich</td><td>CAS 77-86-1</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp; 60-00-4&nbsp;</td></tr><tr><td>Lysozym uit kippeneiwitje</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971 Fluka</td><td>poeder, CAS&nbsp; 12650-88-3&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra-Turrax homogenisator T18 basic</td><td>IKA</td><td>3720000</td><td></td></tr><tr><td>Glazen filterhouders voor 47&nbsp;mm membranen, Pyrex glas</td><td>EMD Millipore</td><td>XX10 047 00</td><td></td></tr><tr><td>Chemische vacuümpomp</td><td>Millipore</td><td>WP6122050</td><td>220 V/50 Hz</td></tr><tr><td>Manifold bemonsteringsfiltratie voor 25&nbsp;mm membranen</td><td>Millipore</td><td>1225 Sampling Manifold</td><td>polypropyleen</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td>Rnase vrij</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp; 1310-73-2&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Whatman nitrocellulose membraanfilters, 0,2 &#956;m poriegrootte, 25 mm diameter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182002 Aldrich</td><td></td></tr></tbody></table>

fysieke isolatie van endospores van milieu monsters door gerichte lysis van vegetatieve cellen

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Endosporevorming is een overlevingsstrategie die voorkomt bij sommige bacteriën uit het phylum Firmicutes. Tijdens de endosporevorming gaan deze bacteriën een morfo-fysiologische rusttoestand in die de overleving onder ongunstige omgevingsomstandigheden verbetert. Hoewel endosporevormende Firmicutes een van de meest frequent verrijkte en geïsoleerde bacteriegroepen zijn in kweekstudies, ontbreken ze vaak in diversiteitsstudies op basis van moleculaire methoden. De weerstand van de spoorkern wordt beschouwd als een van de factoren die de herstel van DNA uit endosporen beperken. We ontwikkelden een methode die gebruikmaakt van de hogere weerstand van endosporen om ze te scheiden van andere cellen in een complex microbiële gemeenschap door middel van fysische, enzymatische en chemische lysismethoden. De endospore-voorbereiding die zo wordt verkregen, kan worden gebruikt voor hercultivering of voor downstream-analyse zoals aangepaste DNA-extractie geoptimaliseerd voor endosporen en daaropvolgende DNA-sequencing. Deze methode, toegepast op sedimentmonsters, heeft de verrijking van endosporen mogelijk gemaakt en na sequencing heeft het een grote diversiteit aan endospore-vormers in zoetwatermeersedimenten onthuld. We verwachten dat de toepassing van deze methode op andere monsters een vergelijkbaar resultaat zal opleveren.

De hier gepresenteerde resultaten zijn eerder verschenen 10,21. Verwijzen wij u naar die artikelen voor de milieu-interpretatie en bespreking van de gegevens. De algemene procedure wordt samengevat in figuur 1 en komt overeen met drie stappen: eerst de scheiding van biomassa uit sediment of andere milieu-matrix; tweede, de vernietiging van vegetatieve cellen; en ten derde de stroomafwaartse analyse van de afgescheiden endosporen. Downstream analys...

Er werd een methode ontwikkeld om bacteriële endosporen uit complexe microbiële gemeenschappen te isoleren om op maat gemaakte kweek- of moleculaire studies van deze groep bacteriën uit te voeren.

Fysieke Isolatie van Endospores van milieu monsters door Gerichte Lysis van vegetatieve cellen

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

Het algemene doel van deze procedure is het scheiden van bacteriële endosporen uit complexe monsters van microbiële gemeenschappen, zoals sediment. Deze methode helpt bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen de microbiologie over de aanwezigheid en abundantie van endosporen in natuurlijke monsters. Het is gebaseerd op een verschil in resistentie tussen endosporen en vegetatieve cellen tegenover chemicaliën en hitte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de methode niet-destructief is voor endosporen, waardoor ze kunnen worden gebruikt voor daaropvolgende experimenten zoals cultivatie, kwantificatie en metabole testen.Hoewel we deze methode hebben ontworpen voor gebruik bij de ecologie van endosporevormende bacteriën, kan deze ook worden toegepast in vakgebieden zoals de exobiologie of de voedingsmiddelenindustrie, waarin sporen zowel gunstig als nadelig kunnen zijn. Nadat de oplossingen en apparatuur volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, worden onder een UV-gesteriliseerde veiligheidskast met ethanol-geflamde metalen lepels drie gram sedimentmonster toegevoegd aan vooraf gewogen, steriele buisjes van 50 milliliter. Voeg met een steriele, gegradueerde buret 15 milliliters van een steriele, gefiltreerde 1% natriumhexametafosfaat- of SHMP-oplossing toe aan het monster.Homogeniseer het monster gedurende één minuut bij 17.500 RPM met een vloeistofdispersor of homogenisator en een steriele dispersierotor. Laat het monster twee minuten rusten en herhaal de homogenisatie. Laat het monster vervolgens 10 minuten rusten zodat de zwaarste deeltjes kunnen bezinken.Overbreng het supernatant dat de celbiomassa bevat naar een schone buis van 50 milliliter, waarbij u er zorg voor draagt de pellet niet te verstoren. Voeg een volgende aliquot van 15 milliliter SHMP toe aan de bezonken pellet en herhaal de homogenisatie voordat u het supernatant opvangt en samenvoegt met de eerste aliquot. Centrifugeer het monster bij 20 ×g gedurende één minuut en overbreng het supernatant naar een nieuwe buis van 50 milliliter voordat u de pellet weggooit.Zodra de filtratie-eenheid en de vacuümpomp volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, wordt een ethanolvlam gebruikt om de pincet te steriliseren voor het toevoegen van een steriel nitrocellulosemembraan aan de filtratie-eenheid. Voeg de helft van het zojuist bereide supernatantmonster toe aan de membraanfiltratie-eenheid en gebruik de vacuümpomp om de cellen op het membraan te verzamelen. Stop de vacuümpomp wanneer de vloeistof volledig door het filter is gepasseerd.Gebruik gesteriliseerde pincetten om het membraan voorzichtig te verwijderen en plaats het in een steriele petrischaal. Herhaal de filtratie van de resterende helft van de oplossing met een nieuw stuk steriel membraan. Om endosporen te scheiden van vegetatieve cellen in de zojuist verzamelde biomassa, ontdooi het membraan als het was ingevroren en gebruik met ethanol geflammeerde, gesteriliseerde scharen om het in kleinere stukjes te knippen.Breng de membraanstukken over naar een steriele buis van twee milliliter en voeg 900 µL 1X TE-buffer toe. Meng grondig door te vortexen om de biomassa van het membraan los te maken. Incubeer de buis bij 65 °C en 80 RPM gedurende 10 minuten.Haal vervolgens de buis uit de incubator en laat deze 15 minuten afkoelen. Voeg 100 µL vers bereid lysozym toe tot een eindconcentratie van 2 mg/mL en incubeer het monster 60 minuten bij 37 °C en 80 RPM om de vegetatieve cellen te lyseren. Voeg na voltooiing van de lyse 250 µL 3 N natriumhydroxide en 250 µL 6% SDS-oplossing toe aan het monster.Incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur en 80 RPM. Bereid vervolgens een steriele filtratie-eenheid voor die membranen met een diameter van 25 millimeter bevat door middel van autoclaveren. Nadat de filtratie-eenheid is afgekoeld, plaatst u een nitrocellulosemembraan met een diameter van 25 millimeter en een poriegrootte van 0,2 micrometer hierin.Voeg de monsteroplossing toe aan het membraan en gebruik de vacuümpomp om de vloeistof te filteren, zodat de endosporen op het membraan worden opgevangen terwijl het vegetatieve celmateriaal erdoorheen gaat. Om resterende detergentia af te spoelen, voegt u twee milliliters steriele fysiologische oplossing toe aan het membraan en activeert u de vacuümpomp. Wanneer de vloeistof volledig gefiltreerd is, schakelt u de pomp uit en laat u het membraan op de filtratie-eenheid.Om een DNase-behandeling direct op het membraan uit te voeren, voegt u 450 µL steriel water, 50 µL 1X DNase-reactiebuffer en 0,5 µL DNase-enzym toe aan het membraan en laat u dit ongeveer 15 minuten staan bij ongeveer 25 °C. Het extracellulaire DNA dat eerder was vrijgekomen uit de gelyseerde cellen wordt enzymatisch verteerd en vervolgens weggespoeld. Dit zorgt ervoor dat de uiteindelijke endosporenpreparatie vrij is van extern DNA, wat essentieel is voor latere analyses, zoals moleculaire analyse.Het is belangrijk om eraan te denken dat het filterapparaat niet mag lekken en dat het monster niet mag uitdrogen. Voeg na de incubatie één milliliter fysiologische zoutoplossing toe en zet de pomp aan om het residuele enzym van het monster af te wassen. Gebruik een steriele pincet om het membraan met endosporen over te brengen naar een steriele petrischaal.Analyseer het monster volgens het tekstprotocol. Het in deze video gedemonstreerde protocol voor gerichte lysis van vegetatieve cellen resulteert in een gezuiverd endosporemonster en een significante toename van de fractie endosporevormende firmicutes. Bij amplicon sequencing van het 16S ribosomaal RNA-gen komen firmicutes in onbehandelde monsters slechts overeen met 8% tot 19% van de sequenties.Daarentegen waren na de behandeling firmicutes verantwoordelijk voor 90,6% en 83,9% van het endosporinerijke monster. De twee belangrijkste ordes van endosporevormende firmicutes, bacillales en clostridiales, waren verrijkt, terwijl niet-endosporevormende firmicutes zoals lactobacillales afwezig waren. De efficiëntie van de behandeling werd ook aangetoond met behulp van zuivere culturen.Een endospore-preparaat en een vegetatieve celcultuur werden behandeld; alle cellen werden geïncubeerd en de groei werd gemeten aan de hand van de optische dichtheid bij 600 nanometer. Zoals hier getoond, werd groei waargenomen bij de endospore-culturen, terwijl er geen groei werd waargenomen in de behandelde E.Coli-cultuur, wat erop wijst dat vegetatieve cellen onomkeerbaar beschadigd zijn. Zodra de techniek onder de knie is, en indien de oplossingen en apparatuur vooraf zijn voorbereid, dient deze procedure ongeveer vijf uur in beslag te nemen.Het is belangrijk om te onthouden dat alle contaminatie moet worden vermeden door onder steriele omstandigheden te werken en de steriliteit van de oplossingen en alle apparatuur te waarborgen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals cultivatie, isolatie en metabole testen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de stamidentificatie en het metabole potentieel van endosporen te beantwoorden. Daarnaast kunnen DNA-extractie en metagenomische sequencing stroomafwaarts worden uitgevoerd om de soortdiversiteit en de aanwezigheid van genen te analyseren.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe endosporen uit milieu monsters kunnen worden gescheiden. Vergeet niet dat werken met detergentia zoals SDS uiterst gevaarlijk kan zijn. Vergeet niet om persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen.

physical-isolation-endospores-from-environmental-samples-targeted

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Source: Schlimpert, S., et al. Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the cultivation and isolation of spores from Streptomyces venezuelae. Spores, dormant cells that help bacteria survive stress, are produced during nutrient limitation and collected through centrifugation. The method ensures a pure, cold-stored spore suspension for downstream applications.

 Preparation and Isolation of Streptomyces venezuelae Spores from a Liquid Culture 

Source: Wunderlin, T., et al. Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a method to isolate endospores from an environmental sample containing both vegetative cells and various bacteria. The procedure involves filtration, mechanical disruption, and selective chemical treatment to weaken and lyse vegetative cells while preserving endospores. The final step isolates the resilient endospores through...

Isolation of Endospores from an Environmental Sample by Targeted Lysis of Vegetative Cells 

Hier beschrijven we een colorimetrische test om de aanwezigheid van reducerende suikers te detecteren tijdens de kieming van bacteriële sporen.

Detecteren Cortex Fragmenten Tijdens Bacteriële Spore Kiemkracht

Dit protocol illustreert de belangrijke opeenvolgende stappen die nodig zijn voor de beoordeling van de relevantie van het toezicht op de parameter van de vitaliteit en DNA-herstelsynthese in de heropleving van sporen van Bacillus subtilis na behandeling met lage druk plasma door tracking fluorescentie-gelabelde DNA repair eiwitten via time-resolved confocale microscopie en elektronenmicroscopie scannen.

Onderzoek naar de nadelige effecten van lage druk Plasma sterilisatie op het voortbestaan van Bacillus subtilis sporen met behulp van Live cel microscopie

Smut schimmels veroorzaken vele verwoestende landbouw ziekten. Zij worden verspreid als slapende teliospores die in antwoord op het milieu signalen ontkiemen. Duidelijk naar voren komt twee methoden voor het onderzoek naar moleculaire veranderingen tijdens kieming: meten van verhoging van de ademhaling voor het detecteren van metabole activering en beoordelen van moleculaire gebeurtenissen wijzigen door het isoleren van teliospores in verschillende morfologische stadia.

Onderzoek naar Teliospore kieming met behulp van Microrespiration analyse en Microdissection

Germinant receptor eiwitten cluster in 'germinosomes' in het binnenste membraan van sporen van Bacillus subtilis . We beschrijven een protocol met behulp van super resolutie microscopie en TL verslaggever eiwitten om te visualiseren van germinosomes. Het protocol geeft ook spore binnenste membraan domeinen die zijn bij voorkeur gekleurd met de membraan kleurstof FM4-64.

Visualisatie van Germinosomes en het binnenste membraan in sporen van Bacillus subtilis

Hier presenteren we een protocol op basis van het meelworm (Tenebrio molitor)-aassysteem dat werd gebruikt voor het isoleren en selecteren van entomopathogene schimmels (EPF) uit bodemmonsters. Een effectieve conidia-getalformule (ECN) wordt gebruikt om een hoge stresstolerante EPF te selecteren op basis van fysiologische kenmerken voor microbiële bestrijding van plagen in het veld.

Isolatie en selectie van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters en evaluatie van schimmelvirulentie tegen insectenplagen

De isolatie van zware metaalresistente microben uit geothermische bronnen is een hot topic voor de ontwikkeling van bioremediatie en milieumonitoring biosystemen. Deze studie biedt een methodologische benadering voor het isoleren en identificeren van zware metaaltolerante bacteriën uit warmwaterbronnen.

Bioprospectie van extremofiele micro-organismen om milieuvervuiling aan te pakken

Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.

Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren

EPA-methode 1615 gebruikt een elektropositieve filter om enterovirussen en norovirusessen te concentreren in milieu- en drinkwater. Dit manuscript beschrijft de procedure voor het verzamelen van monsters voor analyse volgens Methode 1615.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. I. Het verzamelen van Virus Samples

Leer een methode voor fysieke isolatie van bacteriële endosporen uit milieumonsters door gerichte lysis van vegetatieve cellen. Deze niet-destructieve techniek maakt downstream experimenten zoals kweek en metabole testen mogelijk.

Fysieke Isolatie van Endospores van milieu monsters door Gerichte Lysis van vegetatieve cellen

Meer video's verkennen