Een ELISA Based Binding en concurrentie methode om snel bepalen Ligand-receptor interacties

De doelen van deze ELISA-gebaseerde methode zijn ten eerste om de bindingsaffiniteit van een cytokine aan zijn receptor te bepalen en ten tweede om de blokkerende effecten van remmende peptiden van de ligand-receptor-interactie te meten. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van eiwit-eiwit-interacties te beantwoorden, zoals cytokine-receptor-binding. Bindingsaffiniteiten en blokkering hiervan kunnen de algemene begrip van interactiedynamiek verhogen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijk uit te voeren is, het genereert labelreceptoren en het is relatief goedkoop, vanwege de gemakkelijke toegang tot direct beschikbare zoals ELISA-lezer. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de cytokine-receptor-interactie, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals algemene eiwit-eiwit-interacties en het ontwerpen van blokkerende verbindingen om de specifieke interacties te remmen. Bereid de oplossingen voor zoals beschreven in het tekstprotocol.

Zorg ervoor dat u de koolzuurcoatingbuffer filtert met een 0,22 micron PES-membraan. Gebruik een vacuüm. Maak ook 10 verschillende concentraties van elk ligand of peptide.

Er worden twee assays beschreven in deze video, de eerste is de directe ligand-receptor-interactie, ELISA. Het kan worden gebruikt om de receptor-ligand-dissociatieconstante te meten, die de receptor-ligand-bindingsaffiniteit vertegenwoordigt. De tweede assay is een onlangs geoptimaliseerde competitieve ligand-receptor-interactie-ELISA.

Dit maakt het mogelijk om peptiden en andere blokkerende verbindingen te screenen, die interfereren met de receptor-ligand-interactie. Voor efficiëntie, bereid u voor op het gebruik van multikanaals pipetten voor 96-wells platen, en als u decanteerd, gooit u gewoon de inhoud eruit. Begin deze procedure door de plaat te coaten met een recombinant receptor.

Verdun eerst de receptor in koolzuurbuffer tot 100 nanogram per microliter. Laad vervolgens de plaatputjes met 100 microliter receptoroplossing. Sluit de buitenste wanden uit om te voorkomen dat u met het artefact van de plaatrand te maken krijgt.

Dek de plaat af en incubeer deze een nacht bij 4 graden Celsius. Voer alle plaatincubaties uit met voorzichtig schudden. Verwijder de volgende dag de coatingoplossing en was de plaat drie keer met de wasoplossing, PBS met een vleugje Tween 20.

Blokkeer vervolgens de vrije receptorbindingsplaatsen door 200 microliter 5%PSA toe te voegen. Laat de plaat twee uur bij kamertemperatuur incuberen om de blokkering te voltooien. Leeg later de putjes en was de plaat zoals voorheen.

Laad nu de putjes met 100 microliter van de verschillende verdunningen van recombinant his-tag-ligand. Laad elke concentratie in duplicaat. Laad de lege putjes met alleen PBS.

Bewerk daarna de plaat gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Na de incubatie met de liganden, was de plaat drie keer met wasoplossing. Pipetteer vervolgens 100 microliter aliquots van primaire anti-his-muismonoklonaal antilichaam in elke put en incubeer de plaat twee uur bij kamertemperatuur.

Na het wassen van het antilichaam, voegt u aan elke put 100 microliter HRP-gekoppelde geitenanti-muis IGG secundaire antilichaamoplossing toe. Wikkel de plaat in met aluminiumfolie om licht te voorkomen. Incubeer vervolgens de plaat gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.

Gebruik de standaardwastechniek om het secundaire antilichaam te verwijderen. Voeg nu aan elke put 100 microliter versbereide TMB toe, gemaakt van gelijke hoeveelheden stocksubstraatoplossingen A en B. Bewaar vervolgens de plaat gedurende 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens, na voldoende kleurontwikkeling, 50 microliter stockoplossing toe aan elke put.

Het protocol is gebaseerd op de veronderstelling dat het verzonden signaal afkomstig is van specifieke binding. Het kan nodig zijn om de bijdrage van niet-specifieke binding aan het signaal te schatten. Lees vervolgens de absorptiewaarden van de plaat bij 450 nanometer en ga door met het berekenen van de KD-waarde.

De competitieve LRA-procedure volgt dezelfde stappen als de directe LRA-procedure, behalve enkele belangrijke wijzigingen. Na het wassen van de overtollige coatingliganden van de plaat, blokkeer de plaatputjes. Voeg 200 microliter 5%BSA-oplossing toe aan elke put en incubeer de plaat twee uur bij kamertemperatuur.

Tijdens de incubatie, bereidt u de recombinante his-tag-liganden voor op een vaste concentratie van 10 nanogram per milliliter in PBS. Bereid vervolgens het blokkerende peptide voor in verschillende concentraties in PBS, variërend van 10 nanomolair tot 100 micromolair om een dosis-responscurve te garanderen. Zo kan de IC50-waarde voor het blokkerende peptide worden gevonden.

In de controleputjes, laadt u de vaste ligandconcentratie zonder peptide om de maximale binding te verkrijgen. In de lege putjes, voegt u alleen PBS toe zonder ligand of peptide. In de andere putjes, voegt u 50 microliter van de liganden en 50 microliter van elke peptideconcentratie toe.

Bewerk daarna de plaat gedurende twee uur bij kamertemperatuur en ga zoals gebruikelijk verder. De dissociatieconstanten tussen drie verschillende interferon-ligandpeptiden en de receptor-alfa-subeenheid IL28R-a werden bepaald met behulp van de directe LRA, de fractie van bezette bindingsplaatsen wordt uitgezet tegen de logaritme van de respectieve interferonconcentratie. Deze resultaten illustreren een bindingscurve die kan worden geanalyseerd om de KD-waarde te schatten door de gegevens aan de Hill-vergelijking aan te passen.

Een Scatchard-plot illustreert coöperativiteit in ligandbinding, uiteindelijk heeft interferon-ligand 1 de hoogste bindingsaffiniteit, gevolgd door interferon-ligand 2 en interferon-ligand 3. De Hill-coëfficiëntwaarde van meer dan 1 suggereert verhoogde affiniteit voor aanvullende liganden na de initiële ligand-receptor-interactie. Vervolgens werd competitieve LRA gebruikt om de impact van een blokkerend peptide op de interactie tussen de interferon-ligandpeptiden en de receptorsubeenheid te kwantificeren.

De fractie van bezette bindingsplaatsen voor een interferon-ligandpeptide