Name: Een ELISA Based Binding en concurrentie methode om snel bepalen Ligand-receptor interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer ELISA-gebaseerde bindings- en concurrentiemethoden om snel ligand-receptorinteracties te bepalen. Deze techniek meet bindingsaffiniteiten en remmende peptiden voor eiwit-eiwitinteractiestudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Prof. J. Stelling (Afdeling Biosystemenwetenschap en Techniek, ETH Zürich en Zwitsers Instituut voor Bioinformatica, Bazel, Zwitserland) voor zijn kritische beoordeling van het manuscript.

1. reagens Voorbereiding <ol><li> Om carbonaatcoatingbuffer buffer voor te bereiden, te ontbinden 0,36 g Na 2 CO 3 en 0,84 g NaHCO3 in 100 ml gedestilleerd water; steriele filter de buffer met behulp van een vacuüm gedreven 0,22 pm polyethersulfon (PES) membraan filter en bewaar bij kamertemperatuur tot gebruik. </li><li> Bereid wasoplossing door toevoeging van 0,05% v / v Tween 20 in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Bereid een 5% runderserumalbumine (BSA) (blokkeeroplossing) in PBS-oplossing door het oplossen van 5 g BSA (≥98%) in 100 ml PBS en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Recombinante receptor, liganden en blokkeren Peptiden <ol><li> Reconstitutethe recombinant humaan interleukine-alfa-subeenheid (IL28RA) en recombinant aangemaakt liganden van humane IFN (IFNL1-3) volgens de instructies van de fabrikant en bewaar bij -80 ° C. Synthetiseren blokkerende peptiden en gebruikt zoals hiervoor beschreven 4. Met PBS verschillende concentraties ligand bereidens en peptiden voor gebruik in de testen. </li></ol></li><li> Aan het primaire antilichaam te bereiden, verdun 6x His muis monoklonaal antilichaam in PBS met 0,1% BSA in 1: 1000 verdunning. Om het tweede antilichaam te bereiden, verdunde mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd geit anti-muis IgG (H + L) in PBS met 0,1% BSA in 1: 10.000 verdunning. </li><li> Bereid TMB oplossing door het mengen van reagentia A en B volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Bereid stoppen door toevoeging van 5 N zwavelzuur (H 2 SO 4) in gedestilleerd water en bewaar bij kamertemperatuur. </li></ol> 2. Enzym-gekoppelde immunosorbent assays (ELISA&#39;s) OPMERKING: De directe ligand-receptor interactie ELISA (directe LRA figuur 1) kan worden gebruikt om de receptor-ligand dissociatieconstante (KD) te meten, als een maat voor de receptor ligand bindingsaffiniteit. De competitie ligand-receptor interactie ELISA (concurrentie LRA, figuur 2) Alleows screening van peptiden (en andere verbindingen te blokkeren), die werken om de interactie tussen ligand en receptor. Het basisprotocol dat eerder werd gepubliceerd 5 werd verder geoptimaliseerd. Opmerking: in beide ELISA- methoden multichannel pipet voor het toevoegen van oplossingen aan de putjes van 96-putjes plaat bij elke stap. In oplossing decant of wasstappen, gooien de oplossingen direct in de gootsteen. <ol><li> Direct Ligand-receptor-interactie Assay (direct LRA) OPMERKING: Voor een illustratie van de werkstroom (zie figuur 1). <ol><li> Coating Plaat met recombinante receptor <ol><li> Verdun de recombinante receptor in carbonaatbuffer bij een eindconcentratie van 100 ng / ul. Coat putjes van 96-well microtiterplaat met vaste receptor concentratie (100 ng / ul) pipetteren 100 pi aan elk putje met een multichannel pipet. Uitsluiten buitenwanden van de plaat goed edge artefact te vermijden. Bedek de plaat met een deksel en incubeer deplaat bij 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Blokkering en toevoeging van liganden <ol><li> De volgende dag, verwijder de bekledingsoplossing door het kantelen van de plaat tegen de gootsteen en was de plaat 3 maal met wasoplossing (PBS + 0,05% v / v Tween 20). </li><li> Blokkeert de vrije receptor bindingsplaatsen in de beklede plaat met behulp van 200 ui 5% BSA oplossing in elk putje met een multichannel pipet en incubeer de plaat gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Gooi de blokkerende oplossing (zie stap 2.1.2.1.) En was de plaat 3 maal met wasoplossing. </li><li> Bereid de recombinant-His gemerkte liganden in verschillende concentraties (bijvoorbeeld 8 ug / ml, 4 ug / ml, 2 ug / ml, 1 ug / ml, 0,5 ug / ml, 0,25 ug / ml, 0,125 pg / ml, 0,063 pg / ml, 0,031 pg / ml, 0,0 ug / ml) in PBS. Voeg alleen PBS in het lege putten. </li><li> Voeg 100 ul van elk ligand concentratie aan de putjes in duplo en incubeer de plaat gedurende 2 uur bij KT zodat receptor-ligandinteractie. </li></ol></li><li> Incubatie met Antilichamen <ol><li> Na incubatie met de liganden, was de plaat 3 maal met wasoplossing. </li><li> Pipetteer 100 ul van primair anti-His monoklonaal antilichaam (1: 1000) aan elk putje. </li><li> Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur; na incubatie, gooi het antilichaam-oplossing (zie stap 2.1.2.1.) en was de plaat 3 maal met wasoplossing. </li><li> Voeg 100 gl HRP gekoppelde geit anti-muis IgG secundair antilichaam (1: 10.000) aan elk putje. Incubeer de plaat gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Gooi het antilichaam-oplossing (zie stap 2.1.2.1.) En was de plaat 3 maal met wasoplossing. </li></ol></li><li> Toevoeging van de ondergrond en Ontwikkeling <ol><li> Breng de TMB substraat oplossing tot KT en bereid TMB substraatoplossing A en B in 1: 1 verhouding. Voeg 100 ul vers bereide substraat aan elk putje en houdt de plaat bij kamertemperatuur gedurende 15-30 min. Na voldoende col<html> of de ontwikkeling voeg 50 ul stop oplossing. </li></ol></li><li> Het lezen van de plaat en Data-analyse Opmerking: De beschreven protocol is gebaseerd op de veronderstelling dat het gemeten signaal stijgt van specifieke binding. Het kan nodig om de bijdrage van niet-specifieke binding aan de signaalschatting maar dit is buiten het bereik van dit protocol. <ol><li> Lees de absorptie (optische dichtheid, OD) direct bij 450 nm. </li><li> Trek het achtergrondsignaal van de gemeten OD-waarden en normaliseren hen. Transformatie waarden van de ligand concentratie logaritmische schaal (grondtal 10, log 10). </li><li> Plot de genormaliseerde en achtergrond gecorrigeerde OD-waarden (y-as overeenkomt met de fractie van bezette receptorbindingsplaatsen) tegen de logaritme van de concentratie ligand (X-as, log 10 schaal). </li><li> Om de K D-waarde te schatten, past de gegevens naar de volgende vorm van de Hill vergelijking: tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg &quot;/&gt; LET OP: Hier geeft Y de fractie van bezette receptor binding sites en Y max de maximale binding; [L] duidt de concentratie van vrije ligand en de Hill-coëfficiënt. Als er slechts één bindingsplaats voor het ligand, de Hill coëfficiënt n = 1. Voor systemen met meer dan één ligand bindingsplaats, de binding vertoont positieve coöperativiteit als n&gt; 1, negatieve coöperatief als n &lt;1 en als n geen coöperativiteit = 1. de microscopische dissociatieconstante wordt genoemd en komt overeen met de helft van de maximale effectieve concentratie 50 EC 6. De schijnbare dissociatieconstante is Kd = (KD) n. In het eenvoudigste geval waarin n = 1, de dissociatieconstante overeen met de ligand concentratie waarbij de helft van de receptor bindingsplaatsen bezet en Kd = KD. Dit model gaat uit van massa-actie bindend onder evenwicht omstandigheden, evenals dat slechts een klein deel van dehet toegevoegde ligand is gebonden aan de receptor, dat wil zeggen, [L] &gt;&gt; [RL]. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig1.jpg" /> Figuur 1. Direct ligand-receptor-interactie assay (direct LRA). Stap-voor-stap protocol voor directe LRA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="2"><li> Concurrentie Ligand-receptor-interactie Assay (concurrentie LRA) LET OP:. Voor een afbeelding van de workflow zie figuur 2 De wedstrijd LRA procedure volgt dezelfde stappen als de directe LRA (het bekleden van de plaat, antilichaam incubatie plaat ontwikkeling), behalve voor belangrijke veranderingen in het ligand en peptiden aanvulling stap. Juiste negatieve controles zijn essentieel voor deze test. In een eerdere screening &lt;sup&gt; 4, de gecodeerde blokkerende peptide niet antagonistische effecten laten zien. <ol><li> Het blokkeren - Toevoeging van liganden en het blokkeren van Peptiden <ol><li> De volgende dag, verwijder de coating-oplossing en was de plaat (zie 2.1.2.1). </li><li> Blokkeer de beklede plaat door toevoeging van 200 ui 5% BSA-oplossing aan elk putje en incubeer de plaat gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Bereid de recombinant His gemerkte liganden (IFNL1-3) met een vaste concentratie (2x-20 ng / ml) in PBS. </li><li> Bereid de blokkerende peptide (zie Tabel 3) met verschillende concentraties variërend van 10 nM tot 100 uM in PBS om een dosis-responscurve te garanderen. LET OP: Dit maakt de daaropvolgende bepaling van de IC 50 waarde voor de blokkering peptide. In controleputjes, voeg concentratie alleen vaste ligand zonder peptide aan het maximum (100%) binding leiden. In de lege alleen PBS toevoegen zonder ligand of peptide. </li><li> Voeg 50 ul van de liganden (IFNL1-3) en 50 pi van elke peptide concentratie aan de putjes in duplo. </li><li> Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij KT. </li></ol></li><li> Het lezen van de plaat en data-analyse Opmerking: De beschreven protocol is gebaseerd op de veronderstelling dat het gemeten signaal stijgt van specifieke binding. Het kan nodig om de bijdrage van niet-specifieke binding aan de signaalschatting maar dit is buiten het bereik van dit protocol. <ol><li> Lees de absorptie (optische dichtheid, OD) direct bij 450 nm. </li><li> Trek het achtergrondsignaal van de gemeten OD-waarden en normaliseren hen. Transformatie waarden van de peptide concentratie logaritmische schaal (grondtal 10, log 10). </li><li> Plot de genormaliseerde en achtergrond gecorrigeerde OD-waarden (y-as overeenkomt met de fractie van bezette receptorbindingsplaatsen) tegen de logaritme van de concentratie ligand (X-as, log 10 schaal). </li><li> Om de IC50 waarde te schatten, past de gegevens aan de volgende vergelijking: <img alt="vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/53575/53575eq2.jpg" /> LET OP: Hier [P] is de peptide concentratie en de Hill helling. De helling wordt de steilheid van de dosis-responscurve. De IC 50 komt overeen met de inhibitor concentratie waarbij 50% remming van binding tussen ligand en receptor waargenomen. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="figuur 2" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig2.jpg" /> Figuur 2. Competition ligand-receptor-interactie assay (concurrentie LRA). Stap-voor-stap protocol voor de concurrentie LRA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<ol><li>Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+techniques+to+study+ligand-receptor+interactions+and+receptor+activation+by+TNF+superfamily+members%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members.</a> Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+analysis+of+anti-citrullinated+protein%2Fpeptide+antibody+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity.</a> Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).</li>
<li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell-adhesion+molecule+interactions+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance.</a> Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).</li>
<li>Egli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-28B+is+a+key+regulator+of+B-+and+T-cell+vaccine+responses+against+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza.</a> PLoS Pathog. 10, e1004556(2014).</li>
<li>Rosenbluh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positively+charged+peptides+can+interact+with+each+other%2C+as+revealed+by+solid+phase+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays.</a> Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).</li>
<li>Goutelle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hill+equation%3A+a+review+of+its+capabilities+in+pharmacological+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+clinical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling.</a> Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).</li>
<li>Levin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+derived+from+HIV-1+integrase+that+bind+Rev+stimulate+viral+genome+integration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration.</a> PLoS One. 4, e4155(2009).</li>
<li>Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+interferon-lambda+family+on+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections.</a> Emerging infectious diseases. , e51(2014).</li>
<li>Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+human+interferon+lambda+and+what+it+has+taught+us%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">The structure of human interferon lambda and what it has taught us.</a> J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).</li>
<li>Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostability+of+salt+bridges+versus+hydrophobic+interactions+in+proteins+probed+by+statistical+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chemical+information+and+modeling%22%5BJournal%5D)">Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials.</a> Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).</li>
<li>Yuzlenko, O., Lazaridis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+ionizable+amino+acid+side+chains+at+a+lipid+bilayer-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+physical+chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface.</a> The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).</li>
<li>Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+two+buried+salt+bridges+in+the+stability+and+folding+pathway+of+barnase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase.</a> Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).</li>
</ol>

A.E. werd ondersteund door onderzoekssubsidies van het programma "SNSF Ambizione Score" (PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" Universiteit van Basel, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel en Bangeter Rhyner Stiftung. J.L. erkent de steun van een iPhD-beurs van de SystemsX.ch-initiatief in het programma systeembiologie (9de oproep).

ELISA is een standaard en gevestigde methode voor vele laboratoria. We hebben verder gemodificeerd en verbeterd eerder gepubliceerde werkwijze 5,7. De aangetoonde stap-voor-stap protocol duidelijk dat het kan worden gebruikt op een eenvoudige manier de KD-waarden van ligand-receptor-interacties te bepalen. Bovendien kan de IC50 van een blokkerend peptide dat interfereert met de ligand-receptor interactie te bepalen. Belangrijke voordelen zijn de snelle installatie, eenv...

Een beter begrip van signaalwegen vereist gedetailleerde kennis over de ligand-receptor interactie. De meeste werkwijzen voor het beoordelen van de interactie van een bepaalde ligand met zijn specifiek receptor zijn duur, tijdrovend, arbeidsintensief en vereist speciale uitrusting en deskundigheid 1. In dit artikel worden twee snelle en betrouwbare punt-punt protocollen bij de ligand-receptor interactie op basis van een enzym onderzoeken linked immunosorbent assay (ELISA): de directe ligand-receptor interactie assay (LRA) en de concurrentie LRA. ELISA is een zeer gevoelig, specifiek en gemakkelijk beschikbare techniek routinematig gebruikt in bijna elk laboratorium. ELISA kan worden uitgevoerd en aangepast in verschillende modes. De gepresenteerde protocollen zijn geoptimaliseerd voor het onderzoek naar de interactie tussen verschillende lambda interferonen (INFLs) en hun receptor. De directe LRA zorgt voor een quantificatieen van ligand-receptor binding ten opzichte van ligand concentratie en derhalve een bindende curve oplevert. Gebruikmaking van een geschikt model voor de ligand-receptor interactie, kunnen de gegevens verder worden geanalyseerd om de dissociatieconstante (KD) te schatten. In de gepresenteerde protocol, wordt de gebruikte Hill-vergelijking toegepast op de ligand-receptor binding te modelleren. Hoewel andere methoden zoals de oppervlakte plasmon resonantie technologie 2,3 maken de bepaling van bindingsaffiniteiten tussen twee eiwitten, deze technologie is vaak arbeidsintensief, duur, en vereist speciale laboratoriumapparatuur. De competitie LRA maakt de screening van remmende peptiden: de ligand-receptor binding wordt gekwantificeerd ten opzichte peptideconcentratie. Dit levert een dosis-response curve beschrijft het remmende effect van het peptide. De gegevens kunnen verder worden geanalyseerd om de halve maximale remmende concentratie te schatten (IC 50 </sub&gt;) van de blokkerende peptide. Beide ELISA-protocollen zijn gemakkelijk te gebruiken en kan worden aangepast aan een breed scala van onderzoek vragen. Recombinante eiwitten van elke soort kan worden gebruikt om snel en betrouwbaar bepalen van de interactie delen. Bovendien kan de concurrentie LRA worden gebruikt om kritische interactieplaatsen van liganden en receptoren bepalen via blokkerende peptiden, die zijn ontworpen om ofwel het ligand of de receptor nabootsen. Wanneer de blokkerende peptide toont efficiënte en specifieke remming, het peptide heeft een kritische interactieplaats van de ligand (indien het peptide bootst de receptor) of de ligand (indien het peptide bootst de ligand). Het eerste protocol beschrijft de K-D-waarde bepalen van verschillende INFLs en de alfa-subunit van hun receptor, dat wil zeggen, de interleukine-28 receptor (IL28RA) met behulp van de directe LRA. Vervolgens wordt het tweede protocol laat zien hoe het vermogen van een 20 aminozuren lang peptide te bepalenremmen de INFL-IL28RA interacties. Het peptide is ontworpen om te concurreren met IFNLs hun receptorbindingsplaats en maakt daarmee een moleculair begrip van de interactie. Verder kan dit peptide worden gebruikt om IL28RA in vitro experimenten blokkeren de effecten op downstream signaaleffecten 4 bepalen.

<table><tbody><tr><td>Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td>ELISA plate</td></tr><tr><td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td><td>Merck</td><td>497-19-8</td><td>Voor ELISA plate coating buffer</td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>144-55-8</td><td>Voor ELISA plate coating buffer</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030-100G</td><td>5% BSA in PBS voor Blocking</td></tr><tr><td>rhIL-28R&alpha;/IFN&lambda;R1</td><td>R&amp;D systems</td><td>5260-MR</td><td>Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha</td></tr><tr><td>rhIL-29/IFN&lambda;1</td><td>R&amp;D systems</td><td>1598-IL/CF</td><td>Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag</td></tr><tr><td>rhIL-28A/IFN&lambda;2</td><td>R&amp;D systems</td><td>1587-IL/CF</td><td>Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag</td></tr><tr><td>rhIL-28B/IFN&lambda;3</td><td>R&amp;D systems</td><td>5259-IL/CF</td><td>Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag</td></tr><tr><td>6x His Monoclonal antibody (Mouse)</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td>Primaire antilichaam om His getagged Liganden te vangen</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse igG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-035-166</td><td>Horseradish Peroxidase geconjugeerde secundaire antilichaam</td></tr><tr><td>BDoptEIA TMB reagent set</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td>ELISA - TMB substraatoplossing</td></tr><tr><td>Sulfuric acid (H2SO4)</td><td>Fulka</td><td>84720</td><td>5 N H2SO4 (Enzymreactie stop oplossing)</td></tr><tr><td>Synergy/H1 - Microplate reader</td><td>BioTeK</td><td></td><td>ELISA plate reader</td></tr></tbody></table>

een elisa based binding en concurrentie methode om snel bepalen ligand-receptor interacties

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

Een uitgebreid begrip van signaaltransductieroutes vereist gedetailleerde kennis over ligand-receptor interactie. Dit artikel beschrijft twee snelle en betrouwbare, punt voor punt, protocollen van enzymgekoppelde immunosorbeertesten (ELISA's) voor de onderzoek naar ligand-receptor interacties: de directe ligand-receptor interactie test (LRA) en de competitieve LRA. Als case study wordt de ELISA-gebaseerde analyse van de interactie tussen verschillende lambda interferonen (IFNLs) en de alfa-subeenheid van hun receptor (IL28RA) gepresenteerd: de directe LRA wordt gebruikt voor de bepaling van dissociatieconstanten (KD-waarden) tussen receptor en IFN-liganden, en de competitieve LRA voor de bepaling van het remmende vermogen van een oligopeptide, dat ontworpen is om te concurreren met de IFNLs op hun receptorbindingsplaats. Analytische stappen om KD en half maximale remmende concentratie (IC50) waarden te schatten worden beschreven. Ten slotte benadrukt de discussie de voor- en nadelen van de gepresenteerde methode en hoe de resultaten een beter moleculair begrip van ligand-receptor interacties mogelijk maken.

De dissociatieconstanten tussen INFL1-3 en hun receptor alpha subunit IL28RA werden bepaald met behulp van de directe LRA. De resultaten worden getoond in Figuur 3: De fractie bezette bindingsplaatsen uitgezet tegen de logaritme van de respectievelijke IFN concentratie. De Scatchard plot van de gegevens wordt weergegeven in de rechter benedenhoek. De resultaten illustreren dat de directe LRA levert een binding curve, die verder kan worden geanalyseerd om de KD...

De gepresenteerde protocollen beschrijven twee op enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) gebaseerde technieken voor de snelle onderzoeking van ligand-receptor interacties: De eerste test stelt de bepaling van constante disassociatie tussen ligand en receptor mogelijk. De tweede test maakt een snelle screening van blokkerende peptiden voor ligand-receptor interacties mogelijk.

Een ELISA Based Binding en concurrentie methode om snel bepalen Ligand-receptor interacties

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

De doelen van deze ELISA-gebaseerde methode zijn ten eerste om de bindingsaffiniteit van een cytokine aan zijn receptor te bepalen en ten tweede om de blokkerende effecten van remmende peptiden van de ligand-receptor-interactie te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van eiwit-eiwitinteracties, zoals cytokine-receptorbinding. Bindingsaffiniteiten en blokkade hiervan kunnen het algemene begrip van interactiedynamica vergroten.Het grote voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig uit te voeren is, het genereert labelreceptoren en het is relatief goedkoop, vanwege de gemakkelijke toegang tot direct beschikbare apparatuur zoals een ELISA-lezer. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de cytokine-receptorinteractie, kan het ook worden toegepast op andere systemen zoals algemene eiwit-eiwitinteracties en het ontwerpen van blokkerende verbindingen om de specifieke interacties te remmen. Bereid de oplossingen voor zoals beschreven in het tekstprotocol.Zorg ervoor dat u de koolzuurcoatingbuffer filtert met een 0,22 micron PES-membraan. Gebruik een vacuüm. Maak ook 10 verschillende concentraties van elk ligand of peptide.Er zijn twee assays beschreven in deze video, de eerste is de directe ligandreceptorinteractie, ELISA. Het kan worden gebruikt om de receptor-ligand dissociatieconstante te meten, die de receptor-ligandbindingsaffiniteit vertegenwoordigt. De tweede assay is een recent geoptimaliseerde competitieve ligand-receptorinteractie ELISA.Dit maakt het mogelijk om peptiden en andere blokkerende verbindingen te screenen, die interfereren met de receptor-ligandinteractie. Voor efficiëntie, bereid u voor om multikanaals pipetten te gebruiken voor 96-well platen, en bij het decanteren, giet u hun inhoud gewoon weg. Begin deze procedure door de plaat te coaten met een recombinant receptor.Verdun eerst de receptor in koolzuurbuffer tot 100 nanogram per microliter. Laad vervolgens de plaatgaten met 100 microliter receptoroplossing. Sluit de buitenste wanden uit om te voorkomen dat u te maken krijgt met het artefact van de plaatrand.Dek de plaat af en incubeer deze een nacht bij 4 graden Celsius. Voer alle plaatincubaties uit met zacht schudden. Verwijder de volgende dag de coatingoplossing en was de plaat drie keer met de wasoplossing, PBS met een vleugje Tween 20.Blokkeer vervolgens de vrije receptorbindingsplaatsen door 200 microliter 5%PSA toe te voegen. Laat de plaat twee uur bij kamertemperatuur incuberen om de blokkering te voltooien. Leeg later de gaten en was de plaat zoals voorheen.Laad nu de gaten met 100 microliter van de verschillende verdunningsreeksen van recombinant his-tag ligand. Laad elke concentratie in duplicaat. Laad de blanco gaten met alleen PBS.Vervolgens incubeer de plaat twee uur bij kamertemperatuur. Na de incubatie met de liganden, was de plaat drie keer met wasoplossing. Pipetteer vervolgens 100 microliter aliquots van primaire anti-his muis monoklonale antilichaam in elk putje en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende twee uur.Na het wegwassingen van het antilichaam, voegt u aan elk putje 100 microliter HRP gekoppelde geit anti-muis IGG secundair antilichaamoplossing toe. Wikkel de plaat in aluminiumfolie om licht te voorkomen. Incubeer vervolgens de plaat gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.Gebruik de standaard wastechniek om het secundaire antilichaam te verwijderen. Voeg nu aan elk putje 100 microliter versbereide TMB toe, gemaakt van gelijke hoeveelheden voorraadoplossing A en B. Houd de plaat vervolgens 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens, na voldoende kleurontwikkeling, 50 microliter voorraadoplossing toe aan elk putje.Het protocol is gebaseerd op de veronderstelling dat het gemelde signaal voortkomt uit specifieke binding. Het kan nodig zijn om de bijdrage van niet-specifieke binding aan het signaal te schatten. Lees vervolgens de platenabsorptiewaarden bij 450 nanometer en ga verder met het berekenen van de KD-waarde.De competitieve LRA-procedure volgt dezelfde stappen als de directe LRA-procedure, met uitzondering van enkele belangrijke wijzigingen. Na het afwassen van de overtollige coatingliganden van de plaat, blokkeer de plaatgaten. Voeg 200 microliter 5%BSA-oplossing toe aan elk putje en incubeer de plaat twee uur bij kamertemperatuur.Tijdens de incubatie, bereidt u de recombinante his-tag liganden voor op een vaste concentratie van 10 nanogram per milliliter in PBS. Bereid vervolgens het blokkerende peptide voor in verschillende concentraties in PBS, variërend van 10 nanomolair tot 100 micromolair om een dosis-responscurve te garanderen. Zo kan de IC50-waarde voor het blokkerende peptide worden gevonden.In de controleputjes, laad de vaste ligandconcentratie zonder peptide om de maximale binding te verkrijgen. In de blanco putjes, voeg alleen PBS toe zonder ligand of peptide. In de andere putjes, voeg 50 microliter van de liganden en 50 microliter van elke peptideconcentratie toe.Vervolgens incubeer de plaat twee uur bij kamertemperatuur en ga zoals gebruikelijk verder. De dissociatieconstanten tussen drie verschillende interferon-ligandpeptiden en de receptor-alfa-subeenheid IL28R-a werden bepaald met behulp van de directe LRA, de fractie van bezette bindingsplaatsen wordt uitgezet tegen de logaritme van de respectieve interferonconcentratie. Deze resultaten illustreren een bindingscurve die kan worden geanalyseerd om de KD-waarde te schatten door de gegevens aan de Hill-vergelijking te passen.Een Scatchard-plot illustreert coöperativiteit in ligandbinding, uiteindelijk heeft interferon-ligand 1 de hoogste bindingsaffiniteit, gevolgd door interferon-ligand 2 en interferon-ligand 3. De Hill-coëfficiëntwaarde van meer dan 1 suggereert een verhoogde affiniteit voor aanvullende liganden na de initiële ligandreceptorinteractie. Vervolgens werd competitieve LRA gebruikt om de impact van een blokkerend peptide op de interactie tussen de interferon-ligandpeptiden en de receptorsubeenheid te kwantificeren.De fractie van bezette bindingsplaatsen voor een interferon-ligandpeptide bij 10 nanogram per milliliter wordt uitgezet tegen de log van de

an-elisa-based-binding-competition-method-to-rapidly-determine-ligand

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

In this video, we demonstrate biolayer interferometry (BLI) technology to detect the intermolecular interactions between ligands and target analytes in real-time. BLI measures changes in the interference pattern of white light reflected off a layer of immobilized ligands on a biosensor surface as they interact with analytes in solution.

Biolayer Interferometry Technology to Detect Interactions between Ligand and Analyte

In this video, we describe a flow cytometry-based competitive binding assay to detect the interactions between the CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) and its fluorescently-labeled natural ligand CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), in the presence of a CXCR4-targeting small molecule. Incubating CXCR4-expressing cells with lower small molecule concentrations allows CXCR4-CXCL12 binding to some extent, which progressively declines upon a gradual increase in small molecule concentrations.

Competitive Binding Assay to Identify Compounds Disrupting Receptor-Ligand Interactions

This video demonstrates the reporter assay-based detection of the receptor-ligand interaction. The successful receptor-ligand interaction activates the downstream signaling pathway, causing the generation and release of cytokines as secretory reporter molecules in the solution, which is confirmed using ELISA.

ELISA-Based Reporter Assay to Study the Receptor-Ligand Interaction in BW Cells

In this video, biomembrane force probes (BFPs) are used to measure the forces between receptors and ligands. This technique can detect interactions by monitoring the pressure needed to break the bonds between the pMHC conjugated on the probe beads and the TCRs on the target cells.

Biomembrane Force Probe to Quantitate Receptor-Ligand Interactions

De protocollen beschrijven hier kinetische analyses van eiwit-eiwit interacties met Bio-layer interferometrie. F type ATP synthase, dat betrokken is bij de cellulaire energiemetabolisme, kan worden geremd door de ε subeenheid in bacteriën. We hebben Bio-layer interferometrie aangepast aan interacties van de katalytische complex studeren met remmende C-terminale domein ε's.

Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects

Surface Plasmon Resonance (SPR) is een label vrij werkwijze voor het detecteren van biomoleculaire interacties in real time. Hierin, een protocol voor een membraaneiwit: wordt receptor interactie experiment beschreven, terwijl de discussie over de voors en tegens van de techniek.

Real Time Metingen van membraaneiwit: Receptor Interacties gebruik Surface Plasmon Resonance (SPR)

Een protocol voor screening van kleine moleculaire geneesmiddelen op basis van in-situ synthese van ultrakleine fluorescerende gouden nanoclusters (Au NC's) met behulp van een door geneesmiddelen geladen eiwit als sjabloon wordt gepresenteerd. Deze methode is eenvoudig om de bindingsaffiniteit van geneesmiddelen aan een doeleiwit te bepalen door een zichtbaar fluorescerend signaal dat wordt uitgezonden door de eiwit-gesjabloniseerde Au NC's.

Een snelle en kwantitatieve Fluorimetrische Methode voor-eiwit targeting Small Molecule drugscontrole

Een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een titratie ELISA wordt beschreven. Bovendien wordt een nieuw algoritme te evalueren van de titratie ELISAs en te verkrijgen van een dissociatieconstante van binding van een oplosbare ligand aan een receptor microtiterplaat plaat-geïmmobiliseerd gepresenteerd.

Titratie ELISA als een methode om te bepalen van de dissociatieconstante van Receptor-Ligand interactie

Ice bindingseiwitten (IBP), ook bekend als antivrieseiwitten, remmen ijsgroei en een veelbelovende toevoegingsmiddelen in de cryopreservatie van weefsels. Het belangrijkste instrument dat wordt gebruikt om IBP te onderzoeken is de nanoliter osmometer. We ontwikkelden een huis ontworpen koeling stadium gemonteerd op een optische microscoop en gecontroleerd met behulp van een custom-built LabVIEW routine. De nanoliter osmometer hier beschreven gemanipuleerd het monster temperatuur in een...

LabVIEW bediende Novel nanoliter Osmometer voor Ice Bindend Eiwit Onderzoeken

Antivrieseiwitten (ACP's) binden zich aan specifieke ijsvlakken om ijsgroei te voorkomen of te vertragen. Fluorescentie-gebaseerde ijsvlakaffiniteitsanalyse (FIPA) is een wijziging van de oorspronkelijke ijsetsmethode voor de bepaling van AFP-gebonden ijsvlakken. AFP's zijn fluorescerend gelabeld, verwerkt in macroscopische enkelvoudige ijskristallen en gevisualiseerd onder UV-licht.

Het bepalen van de IJsbindende Vlakken van Antivries eiwitten door Fluorescentie-gebaseerde Ice Plane Affiniteit

Leer ELISA-gebaseerde bindings- en concurrentiemethoden om snel ligand-receptorinteracties te bepalen. Deze techniek meet bindingsaffiniteiten en remmende peptiden voor eiwit-eiwitinteractiestudies.

Een ELISA Based Binding en concurrentie methode om snel bepalen Ligand-receptor interacties

Meer video's verkennen