Een ELISA Based Binding en concurrentie methode om snel bepalen Ligand-receptor interacties

De doelen van deze ELISA-gebaseerde methode zijn ten eerste om de bindingsaffiniteit van een cytokine aan zijn receptor te bepalen en ten tweede om de blokkerende effecten van remmende peptiden van de ligand-receptor-interactie te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van eiwit-eiwitinteracties, zoals cytokine-receptorbinding. Bindingsaffiniteiten en blokkade hiervan kunnen het algemene begrip van interactiedynamica vergroten.

Het grote voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig uit te voeren is, het genereert labelreceptoren en het is relatief goedkoop, vanwege de gemakkelijke toegang tot direct beschikbare apparatuur zoals een ELISA-lezer. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de cytokine-receptorinteractie, kan het ook worden toegepast op andere systemen zoals algemene eiwit-eiwitinteracties en het ontwerpen van blokkerende verbindingen om de specifieke interacties te remmen. Bereid de oplossingen voor zoals beschreven in het tekstprotocol.

Zorg ervoor dat u de koolzuurcoatingbuffer filtert met een 0,22 micron PES-membraan. Gebruik een vacuüm. Maak ook 10 verschillende concentraties van elk ligand of peptide.

Er zijn twee assays beschreven in deze video, de eerste is de directe ligandreceptorinteractie, ELISA. Het kan worden gebruikt om de receptor-ligand dissociatieconstante te meten, die de receptor-ligandbindingsaffiniteit vertegenwoordigt. De tweede assay is een recent geoptimaliseerde competitieve ligand-receptorinteractie ELISA.

Dit maakt het mogelijk om peptiden en andere blokkerende verbindingen te screenen, die interfereren met de receptor-ligandinteractie. Voor efficiëntie, bereid u voor om multikanaals pipetten te gebruiken voor 96-well platen, en bij het decanteren, giet u hun inhoud gewoon weg. Begin deze procedure door de plaat te coaten met een recombinant receptor.

Verdun eerst de receptor in koolzuurbuffer tot 100 nanogram per microliter. Laad vervolgens de plaatgaten met 100 microliter receptoroplossing. Sluit de buitenste wanden uit om te voorkomen dat u te maken krijgt met het artefact van de plaatrand.

Dek de plaat af en incubeer deze een nacht bij 4 graden Celsius. Voer alle plaatincubaties uit met zacht schudden. Verwijder de volgende dag de coatingoplossing en was de plaat drie keer met de wasoplossing, PBS met een vleugje Tween 20.

Blokkeer vervolgens de vrije receptorbindingsplaatsen door 200 microliter 5%PSA toe te voegen. Laat de plaat twee uur bij kamertemperatuur incuberen om de blokkering te voltooien. Leeg later de gaten en was de plaat zoals voorheen.

Laad nu de gaten met 100 microliter van de verschillende verdunningsreeksen van recombinant his-tag ligand. Laad elke concentratie in duplicaat. Laad de blanco gaten met alleen PBS.

Vervolgens incubeer de plaat twee uur bij kamertemperatuur. Na de incubatie met de liganden, was de plaat drie keer met wasoplossing. Pipetteer vervolgens 100 microliter aliquots van primaire anti-his muis monoklonale antilichaam in elk putje en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende twee uur.

Na het wegwassingen van het antilichaam, voegt u aan elk putje 100 microliter HRP gekoppelde geit anti-muis IGG secundair antilichaamoplossing toe. Wikkel de plaat in aluminiumfolie om licht te voorkomen. Incubeer vervolgens de plaat gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.

Gebruik de standaard wastechniek om het secundaire antilichaam te verwijderen. Voeg nu aan elk putje 100 microliter versbereide TMB toe, gemaakt van gelijke hoeveelheden voorraadoplossing A en B. Houd de plaat vervolgens 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens, na voldoende kleurontwikkeling, 50 microliter voorraadoplossing toe aan elk putje.

Het protocol is gebaseerd op de veronderstelling dat het gemelde signaal voortkomt uit specifieke binding. Het kan nodig zijn om de bijdrage van niet-specifieke binding aan het signaal te schatten. Lees vervolgens de platenabsorptiewaarden bij 450 nanometer en ga verder met het berekenen van de KD-waarde.

De competitieve LRA-procedure volgt dezelfde stappen als de directe LRA-procedure, met uitzondering van enkele belangrijke wijzigingen. Na het afwassen van de overtollige coatingliganden van de plaat, blokkeer de plaatgaten. Voeg 200 microliter 5%BSA-oplossing toe aan elk putje en incubeer de plaat twee uur bij kamertemperatuur.

Tijdens de incubatie, bereidt u de recombinante his-tag liganden voor op een vaste concentratie van 10 nanogram per milliliter in PBS. Bereid vervolgens het blokkerende peptide voor in verschillende concentraties in PBS, variërend van 10 nanomolair tot 100 micromolair om een dosis-responscurve te garanderen. Zo kan de IC50-waarde voor het blokkerende peptide worden gevonden.

In de controleputjes, laad de vaste ligandconcentratie zonder peptide om de maximale binding te verkrijgen. In de blanco putjes, voeg alleen PBS toe zonder ligand of peptide. In de andere putjes, voeg 50 microliter van de liganden en 50 microliter van elke peptideconcentratie toe.

Vervolgens incubeer de plaat twee uur bij kamertemperatuur en ga zoals gebruikelijk verder. De dissociatieconstanten tussen drie verschillende interferon-ligandpeptiden en de receptor-alfa-subeenheid IL28R-a werden bepaald met behulp van de directe LRA, de fractie van bezette bindingsplaatsen wordt uitgezet tegen de logaritme van de respectieve interferonconcentratie. Deze resultaten illustreren een bindingscurve die kan worden geanalyseerd om de KD-waarde te schatten door de gegevens aan de Hill-vergelijking te passen.

Een Scatchard-plot illustreert coöperativiteit in ligandbinding, uiteindelijk heeft interferon-ligand 1 de hoogste bindingsaffiniteit, gevolgd door interferon-ligand 2 en interferon-ligand 3. De Hill-coëfficiëntwaarde van meer dan 1 suggereert een verhoogde affiniteit voor aanvullende liganden na de initiële ligandreceptorinteractie. Vervolgens werd competitieve LRA gebruikt om de impact van een blokkerend peptide op de interactie tussen de interferon-ligandpeptiden en de receptorsubeenheid te kwantificeren.

De fractie van bezette bindingsplaatsen voor een interferon-ligandpeptide bij 10 nanogram per milliliter wordt uitgezet tegen de log van de