Veiligheidsmaatregelen en operationele procedures in een (A) BSL-4 Laboratory: 2. Algemene Practices

Het algemene doel van deze procedure is om veilige praktijken aan te tonen bij het werken in een laboratorium met een biosafety level 4-pak, waarbij de plaque-assay als voorbeeld dient. Deze procedure demonstreert de aanpassingen die nodig zijn om een standaard plaque-assay uit te voeren in een biosafety level 4-omgeving. De procedure wordt gedemonstreerd door Tracey Burdette, een technicus van het Integrated Research Facility.

Nadat de dagelijkse checklist voor de interne systeemcontrole is voltooid, dient de klasse II biologische veiligheidskabinet te worden gereinigd door de binnenzijde, inclusief het schuifvenster, te bespuiten met een 5% dual quaternary ammonium desinfectiemiddel. Veeg vervolgens het kabinet af met papieren handdoeken, waarbij de spuitfles met de desinfectieoplossing in het kabinet moet blijven staan om gehandschoende handen tijdens en na voltooiing van de assay te kunnen bespuiten. Bespuit de binnenzijde van het kabinet en het schuifvenster met een 70% ethanoloplossing om de kleverige desinfectieoplossing te verwijderen.

Bereid een afvalcontainer voor in de biologische veiligheidskast. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van de dubbele quaternaire ammonium desinfecterende oplossing in de afvalcontainer niet minder is dan 5%, rekening houdend met eventuele aanvullende vloeistof die wordt toegevoegd. Plaats de afvalcontainer met 5% dubbele quaternaire ammonium desinfecterende oplossing in de klasse II biologische veiligheidskast.

Voer al het werk zo dicht mogelijk bij het binnencentrum van de klasse II biologische veiligheidskabinet uit. Het binnencentrum is ontworpen als de meest effectieve positie om zichzelf te beschermen. Neem 50 µL virusmonster en controlevirus en breng deze over in 450 µL Dulbecco's Modified Eagle's medium met 2% foetaal runderserum in verdunningsputjes.

Ga door met het maken van seriële verdunningen tot de gewenste concentratie is bereikt. Meng de virusmonsters ten minste vijf keer met een pipetpunt, waarbij u na elke verdunning de pipetpunt vervangt. Meng langzaam om de vorming van luchtbellen in de monsters te minimaliseren.

Zet de verdunningsputjes na voltooiing apart. Spoel bij het weggooien van de tips elke tip met desinfecterende oplossing uit de afvalbak om zowel de binnen- als buitenkant van de tip te contamineren voordat u de tip in de afvalbak uitwerpt. Verwijder het grootste deel van het medium uit de putjes van de zes-wellscultuurplaten.

Voeg 100 µL van het juiste monster in dubbeltoets toe aan de overeenkomstige putjes van de vooraf gelabelde platen. Spuit na voltooiing de handschoenen in met de desinfecterende oplossing. Gebruik een met desinfecterende oplossing doordrenkt papieren handdoekje om de buitenkant van alle platen af te nemen voordat de platen handmatig in de incubator worden geplaatst.

Schud de platen elke 15 minuten gedurende een uur in een acht-beweging om een goede verspreiding van het monster over de cellen te garanderen. Voeg twee milliliters van het overlay-mengsel toe aan elke put en schud opnieuw in een acht-beweging voor een gelijke verdeling van de overlay over het oppervlak van de put. Dompel al het afvalmateriaal volledig onder in een 5% desinfecterende oplossing in de afvalbak met een contacttijd van ten minste 10 minuten.

Sproei de binnen- en buitenkant van de afvalemmer, de binnenkant van de klasse II veiligheidskast voor biologische agentia, de buitenkant van de apparatuur en de handschoenen in met een 5% desinfectieoplossing. Laat de oplossing in de afvalemmer en op andere oppervlakken een contacttijd van 10 minuten behouden. Verwijder vervolgens de items uit de veiligheidskast en breng ze naar de spoelbak.

Plaats de gebruikte pipet in een pipettray voor autoclavering. Giet de inhoud van de afvalemmer door een zeef in de gootsteen. Breng vervolgens een biohazard-afvalcontainer, voorzien van een rode biohazard-zak, naar de gootsteen en stort de inhoud van de zeef in de rode biohazard-zak.

Plaats de biohazard-zak op een autoclaafplateau op een kar. Sluit de autoclaafzakken losjes af met tape, zodat stoom de zak kan binnendringen. Voorzie een van de autoclaaf-tapes van de initialen en de datum.

Verwijder de geperforeerde metalen staaf uit de autoclaaf en open de bovenkant. Plaats een buisje met een biologische indicator met sporen van Geobacillus stearothermophilus in de metalen staaf om te controleren of de sterilisatiecyclus van de autoclaaf succesvol is voltooid. Plaats de met afval gevulde autoclaafbak in de autoclaaf.

Start de autoclaaf en controleer of de cyclus is begonnen. Het bedieningsscherm van de autoclaaf geeft de resterende tijd voor die run aan. Nadat de vereiste incubatieperiode is voltooid, worden de plaque-assayplaten voorzichtig uit de incubator gehaald en handmatig in de schone klasse II biologische veiligheidskabinet geplaatst.

Suug het medium en het overlay-materiaal af met een pipet en breng dit over in de houder met desinfectiemiddel. Vervang het medium door een mengsel van 10% neutraal gebufferde formaline en 0,8% kristalviolet om het virus te inactiveren met een contacttijd van 30 minuten. Verwijder na inactivering voorzichtig het mengsel van neutraal gebufferde formaline/kristalviolet en plaats dit in een aparte afvalbak om het te neutraliseren vóór verwijdering.

Spoel de platen bij de gootsteen af om overtollige kleurstof te verwijderen en plaats de platen vervolgens in een tray om volledig te laten drogen. Gebruik een lichtbak om de plaques te tellen. Noteer alle tellingen en bereken de virustiters aan de hand van de standaardvergelijking.

Plaats voor het verwijderen van geïnactiveerde monsters uit het BSL-4 laboratorium de buisjes of platen in een hitte-sealzak. Spray de binnenkant van de zak in met 5% desinfectiemiddel of fixeermiddel om de binnenzijde van de zak en de buitenkant van de monsterbuisjes te desinfecteren. Seal de zak vervolgens met hitte.

Plaats deze zak in een andere zak volgens dezelfde procedure. Verhitsegel de tweede zak en plaats de dubbel verzegelde zakken gedurende ten minste 10 minuten in een dompelbad met een 5% desinfectieoplossing om de buitenkant van de zakken te desinfecteren. Vul in het laboratorium een logboek voor het dompelbad in door het aantal en de grootte van de buisjes, het volume in de buisjes, het gebruikte middel, de gebruikte inactivatiemethode en de ruimte waarnaar de monsters worden overgebracht, te specificeren.

Het volgen van de juiste procedures binnen het laboratorium voor biosafety level 4 is essentieel om de veilige en effectieve voltooiing van assays te waarborgen. Door de ingevulde dagelijkse interne checklist te raadplegen, stelt het laboratoriumpersoneel vast dat de apparatuur volledig operationeel is. Het virusmonster wordt serieel verdund om platen te verkrijgen met 30 tot 300 plaques per putje en om de virustiter te bepalen.

Een aantal factoren beïnvloedt de vorming van plaques, waaronder het tropisme van het virus voor gastcelijnen, de inoculatietechniek, de omstandigheden voor virusgroei, het juiste verdunningsbereik en de keuze van de overlay. Afval dat tijdens de procedure in de veiligheidskast wordt gegenereerd, wordt tweemaal gedesinfecteerd. Het afval wordt eenmaal correct gedesinfecteerd voordat het uit de veiligheidskast wordt verwijderd.

Vervolgens wordt het afval geautoclaveerd voordat het de omgeving van biosafety level 4 voor dieren verlaat. Door deze procedures te volgen, zijn er geen laboratorium-geïnduceerde infecties geregistreerd tijdens het onderzoek op biosafety level 4 voor dieren in de Integrated Research Facility in Frederick. Deze techniek kan in drie tot vier uur worden voltooid, afhankelijk van het aantal monsters, mits de techniek correct wordt uitgevoerd.

Houd bij het uitvoeren van deze procedure rekening met het correct uitvoeren van verdunningen, het nauwkeurig tellen van plaques en het naleven van alle veiligheidsvoorschriften, om een veilig en succesvol experiment te garanderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de fysieke beperkingen die worden opgelegd door pakken met positieve druk en de extra tijd die nodig is om een standaard plaque-assay te voltooien.