Veiligheidsmaatregelen en operationele procedures in een (A) BSL-4 Laboratory: 3. Aerobiology

Het algemene doel van dit protocol is het bieden van een algemeen inzicht in aerosolprocedures in een laboratorium met een biosafety Level IV-kast, ter ondersteuning van de veiligheid van laboratoriumonderzoekers. Het visualiseren van dit protocol helpt om de complexiteiten en veiligheidscomponenten aan te tonen aan gezondheidsbeheerders die de bouw van soortgelijke faciliteiten overwegen en aan externe samenwerkingspartners die betrokken zijn bij studies naar pathogenen met een hoog risico. Het belangrijkste voordeel van deze techniek, waarbij gebruik wordt gemaakt van Klasse III biosafety cabinets met onderdruk voor aerosolexperimenten, is dat het laboratoriumpersoneel veilig aerobiologisch onderzoek kan uitvoeren zonder gebruik te maken van overdrukpakken.

Als leidende aerobioloog zal ik de procedure demonstreren samen met Kyle Bohannon, de aerosolenengineer van ons laboratorium. Test de functionaliteit van de apparatuur van de rapid transfer port, of RTP, die wordt gebruikt bij aerobiologische procedures, inclusief de deuren van de transportwagen en de RTP die de transportwagen door de wand verbindt met de klasse III biologische veiligheidskabinet, of BSC. Vergrendel de RTP op zijn plaats.

Houd alle fysieke handelingen, toedieningen of routinematige procedures bij en leg deze vast in de dossiers van elke niet-menselijke primaat, of NHP. Indien aanvullende anesthesie vereist is, zorg er dan voor dat alle verwijderde doppen, gebruikte naalden, scherpe voorwerpen en spuiten worden weggegooid in een naaldencontainer. Plaats na gebruik nooit opnieuw een dop op de naalden.

Transporteerde geneesde NHP's in transparante containers die zijn vastgezet met een vergrendeling op het deksel van de transportbox. Plaats de transportcontainers op een mobiele kar, zodat onderzoekers in volledige beschermende kleding zich vrij kunnen bewegen met behulp van ademhalingsslangen door de luchtdrukbestendige deuren. Wanneer een aerosol-challenge is voltooid, plaats dan de NHP in de transportkar en breng de NHP terug naar de thuiskooi.

Test gelijktijdig met de voorbereiding van de dieren door het personeel van de vergelijkende geneeskunde de functionaliteit van de gedecontamineerde biologische veiligheidskast. Verifieer dat de onderdruk in de klasse III BSC binnen het gespecificeerde bereik wordt gehandhaafd. Inspecteer de klasse III BSC op mogelijke lekken of scheuren.

Inspecteer de synthetische rubberen handschoenen en o-ringen van de gedeconamineerde Klasse III BSC op zwakke plekken, scheuren, gaten of uitdroging. In deze fase is de Klasse III biologische veiligheidskabinet niet besmet. Vervang de beschadigde synthetische rubberen handschoenen en/of o-ringen van de Klasse III BSC.

Inspecteer de dompelbak en controleer of deze tot het aangegeven niveau is gevuld met desinfectiemiddel, ofwel drie inch boven de dompelbaffle of tot een markeerlijn in de dompelbak. Controleer met een geleidbaarheidsmeter of de concentratie desinfectiemiddel in de dompelbak minimaal 3 500 microsiemens, of 3,5 millisiemens, bedraagt. Zorg ervoor dat de Class III BSC autoclaaf functioneel is om besmet afval en apparatuur te ontvangen wanneer het experiment is voltooid, of om eenmalig over het hoofd geziene apparatuur die nodig is voor het experiment vanuit de autoclaafpoort in de Class III BSC te brengen.

Autoclaveer alleen de apparatuur waarvan bekend is dat deze bestand is tegen de zware omstandigheden van het proces. Test de functionaliteit van andere aerobiologische apparatuur, zoals de elektronische verbindingen en stopcontacten.

Plaats de gehandschoende handen in de synthetische rubberen handschoenen die aan de Klasse III BSC zijn bevestigd. Assembleer de blootstellingskamer voor alleen de kop van de NHP, de conditioneringsbuis en het platform voor aerosolbeheer. Bevestig een aerosolgenerator aan de conditioneringsbuis en de aerodynamische partikelanalyse-apparatuur aan de blootstellingskamer voor alleen de kop van de NHP.

Trek de handschoenen uit de bevestigde synthetische rubberen handschoenen. Gooi de persoonlijke handschoenen elke keer dat ze worden verwijderd uit de bevestigde synthetische rubberen handschoenen weg als biologisch gevaarlijk afval. Start vervolgens de software voor het aerosolprotocol op de laptop.

Voer de juiste stroomsnelheid in voor de NHP-blootstellingskamer voor alleen het hoofd, de aerosoolgenerator en de biosampler, evenals de administratieve informatie in de softwaremenu's. Ontvang het reeds voorbereide pathogeen via de snelle overdrachtspoort en vul de aerosoolgenerator met het pathogeen. De klasse III biosafety cabinet is nu gecontamineerd.

Zet de aerosolgenerator aan via de aerosolsoftware. Het pathogeen uit de aerosolgenerator zal de blootstellingskamer vullen. Nadat de aerosolgenerator is uitgeschakeld, dient het testmateriaal te worden geleegd en afgevoerd in een zak voor biologisch gevaarlijk afval in de klasse III biosafety cabinet.

Vul vervolgens de biosampler met opvangmedium en bevestig de gevulde biosampler aan de blootstellingskamer voor enkel het hoofd van de NHP. Sluit de juiste vacuümleiding aan op de biosampler. Controleer of de anesthesiediepte van de NHP adequaat is, zoals aangetoond door het ontbreken van reacties op externe stimuli, de spiertonus en stabiele ademhalings- en hartslagfrequenties.

Breng de geanestheseerde NHP via de RTP naar de Klasse III BSC. Plaats de NHP in rugligging op de blootstellingshelling. Verifieer visueel en met een draagbare subjectmonitor of de vitale functies van de NHP stabiel zijn.

Kalibreer de respiratoire inductieve plethysmografie, of RIP, voorafgaand aan het experiment volgens het protocol van de fabrikant. Plaats de banden voor respiratoire inductieve plethysmografie rond de buik en de borst van de NHP. Controleer of deze banden correct passen en of de elektronische verbindingen stevig zijn vastgeklikt.

Plaats vervolgens het Numatech-kalibratiemasker over de snuit van de NHP. Controleer daarna of er een goede afdichting rond de snuit van de NHP is gemaakt. Kalibreer de RIP-banden met een Numatech-kalibratiemasker met behulp van computersoftware.

Verwijder na voltooiing het kalibratiemasker. Registreer de respiratoire parameters en exporteer de respiratoire gegevens voor elk dier via een compatibel programma. Leid de kop van de NHP voorzichtig door het rubberen cofferdam dat aan de kopopening van de NHP-blootstellingskamer voor alleen de kop is bevestigd.

Zorg ervoor dat het rubberen dentale dam een afdichting vormt rond de nek van de NHP tijdens de blootstelling aan het aerosol. Voer het doelvólume van het geaccumuleerde aerosol en de benodigde apparaatidentificatoren die relevant zijn voor elke blootstellingsronde in de software in en start de aerosolprocedure. Zodra de NHP het doelvolume heeft ingeademd, schakelt het systeem uit.

Haal de RIP-banden los en leg ze op het bed naast de NHP. Veeg de NHP af met gaas gedrenkt in een een tot twee procent chlorhexidine-oplossing, waarbij voorzichtigheid in acht wordt genomen bij het afvegen rond de ogen van de NHP. Dep de kop van de NHP om overtollige oplossing te verwijderen.

Breng de NHP via de RTP terug naar de onderzoekers in het ABSL-4 aerobiologielaboratorium met pakken. Leeg de aerosolgenerator en alle resterende challenge-materialen in de zak voor biologisch gevaarlijk afval die afval, wegwerpmateriaal en voor 3/4 gevulde naaldencontainers bevat. Leeg de opvangmedia van de aerosol-biomonstername-apparatuur in de dienend gelabelde opvangbuisjes.

Plaats de opvangbuisjes voor de betreffende bio-assay om een geschatte geïnhaleerde dosis te bepalen in een emmer met nat ijs. Breng de opvangbuisjes en de emmer vervolgens door de RTP. De biosafety cabinet klasse III is een hermetisch afgesloten roestvrijstalen kast onder negatieve druk binnen een laboratorium met bioveiligheidsniveau IV voor dieren.

Materialen worden in de biosafety cabinet gebracht door personeel dat werkt in het laboratorium voor dierlijke biosafety Level IV via een onder de cabinet gemonteerde roestvrijstalen tank, of dompeltank, die een vijf procentige dubbele quaternaire ammoniumdesinfectieoplossing bevat. Omdat de BSC is ingebouwd in de wand die het cabinetlaboratorium scheidt van een ABSL-4 paklaboratorium, kunnen materialen, dieren en virale pathogenen ook vanuit de zijde van het paklaboratorium in de BSC worden verplaatst, met behulp van een transportkar en een RTP. Zodra de deuren van de transportkar naar het ABSL-4 paklaboratorium worden geopend, wordt de Class III biosafety cabinet als besmet beschouwd.

Items in de BSC kunnen van buitenaf worden gemanipuleerd door personeel dat verschillende soorten synthetische rubberen handschoenen draagt. Deze items, met uitzondering van infectieuze monsters, worden uit de BSC verwijderd na sterilisatie via een dubbeldeurs autoclaaf of desinfectie via het dompelbad. Door te verifiëren dat de klasse III biologische veiligheidskast en de bio-aerosolapparatuur correct functioneren, wordt een veilige en correct operationele omgeving behouden die essentieel is voor de veiligheid van het personeel.

Door strikte naleving van deze procedures en praktijken zijn er geen laboratorium-geassocieerde infecties geregistreerd tijdens bio-aerosoolonderzoek bij de Integrated Research Facility, Frederick. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze tijdig worden uitgevoerd om meerdere blootstellingen bij niet-menselijke primaten op één dag mogelijk te maken. Denk erbij het uitvoeren van deze procedure aan om een adequate anesthesiediepte te handhaven.

Zonder een constante staat van sedatie wordt de plethysmografie-acquisitie veel uitdagender. Na deze procedure kunnen andere aerobiologische experimenten met kleinere soorten, zoals konijnen en muizen, worden uitgevoerd. Deze techniek biedt aerobiologische onderzoekers de mogelijkheid om variabelen die de dosimetrie beïnvloeden, zoals temperatuur, relatieve vochtigheid en de efficiëntie van de biosampler, te controleren om een nauwkeurige geïnhaleerde dosis toe te dienen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de biosafety-voorzorgsmaatregelen die worden toegepast tijdens aerobiologische experimenten. Voorzorgsmaatregelen, zoals het herhaaldelijk vervangen van persoonlijke handschoenen, zouden het risico op laboratoriumverworven infecties moeten verminderen.