Name: Multi-exon Skipping Met behulp Cocktail antisense-oligonucleotiden in de Canine X-gebonden Muscular Dystrophy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Leer multi-exon skipping met cocktail antisense-oligonucleotiden in een hondenmodel van Duchenne musculaire dystrofie. Deze methode toont systemische dystrofine-rescue en therapeutisch potentieel voor DMD-patiënten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, en het Women and Children's Health Research Institute (WCHRI).

De open access vergoedingen voor dit artikel werden betaald door Gene Tools, LLC.

Exon skipping is een veelbelovende techniek voor de therapeutische behandeling van DMD. Zowel in vitro en in vivo experimenten hebben aangetoond dat multi-exon skipping haalbaar. Hier wordt het gebruik van de CXMD hondenmodel besproken. Eerst werden AONs ontworpen met behulp van de Rescue-ESE en ESEfinder programma&#39;s om dystrofine exons 6 richten - 8. De 2&#39;OMePS AON chemie werd gebruikt voor CXMD myoblast transfectie en de morfolino AON backbone chemie werd gekozen voor in vivo-experimenten. vPMOs efficiënter zijn dan ongemodificeerde PMO maar vanwege hun hogere toxiciteit ze niet geschikt voor systemische injecties. RNA-extractie, RT-PCR en cDNA sequentie werd uitgevoerd op de CXMD myoblasten. Honden geïnjecteerd met het PMO cocktail waren klinisch graded aan een verbetering van de klinische symptomen te beoordelen. Nadat de honden op humane wijze werden gedood, werden de spieren monsters genomen en voorbereid voor cryo-snijden. De halfwaardetijd van dystrofine proteïne geïnduceerd door AONS wordt verondersteld ongeveer 1 zijn - 2 maanden. Jonge volwassen honden werden in dit onderzoek, hoewel deze experimenten kan met neonatale honden en oudere honden (&gt; 5 jaar). Bereid spier secties werden gebruikt voor histopathologie te evalueren en te beoordelen dystrofine-eiwit te redden door middel van Western blotting en immunohistochemie 48. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het volume van het PMO oplossing juist is voordat injecties is; niet te doen zal aanzienlijke gevolgen hebben op de resultaten. Tijdens intramusculaire injecties wordt voldoende druk vereist om de spiervezels voeren. Monitoring van de hond gezondheid en de controle van de operatie site zijn van belang voor het oplossen van problemen. Om de gezondheid van dieren te controleren, moet wekelijks bloedonderzoek en wegen worden uitgevoerd. Na euthanization van het dier en bereiding van monsters spieren, een kritische stap voor het waarborgen van de gevoeligheid bij het detecteren dystrofine eiwit zowel de Tris-acetaat gel en halfdroge blotting methodetijdens de Western blot procedure. Zoals getoond in de representatieve resultaten, myoblasten behandeld met Ex6A, Ex6B, Ex8A en de cocktail (met Ex6A, Ex6B, Ex8A en Ex8B) die in het leeskader DMD producten. Aangezien Ex8B geen exon-overgeslagen geproduceerd, werd niet gebruikt in volgende in vivo experimenten. cDNA sequencing toonde aan dat exons 6-9 skipping voorgedaan en immunocytochemie met DYS-2 kleuring vertoonden gerestaureerd dystrofine-expressie in behandelde monsters. AON-behandelde honden vertoonden een significante toename van dystrofine-positieve vezels. Dit geeft aan dat exons 6-8 werden overgeslagen en een verkort eiwit werd geproduceerd. De hoeveelheid dystrofine-positieve vezels verhoogd wanneer een cocktail van AONs werd gebruikt en was evenredig aan AON dosering. Immunoblots toonden toegenomen dystrofine-expressie in systemische-morfolino behandelde honden. Skeletspier had verschillende niveaus van dystrofine vezels; Maar-morfolino behandelde hartweefsel toonde weinigverbetering van dystrofine expressie. Omdat dystrofine een hoog molecuulgewicht (427 kDa), kan detectie van lage hoeveelheden dystrofine moeilijk. Voor het beste resultaat, Tris-acetaat gel en de semi-droge overdracht methode werden gebruikt. HE kleuring vertoonden verbeterde histopathologie in de morfolino behandelde honden. Centraal-gekiemd vezels (CNF &#39;s) zijn een teken van ongezonde spier- en vertegenwoordigen cycli van de spieren degeneratie en regeneratie. Morfolino-behandelde CXMD honden een daling van het percentage CNF &#39;in vergelijking met niet behandelde CXMD honden. Klinische indeling liet een verbetering van de symptomen, zoals verhoogde lopen en rennen vermogen, in morfolino-behandelde dieren. De hardheid van de spieren wordt dat spieratrofie dus werd opgenomen in de classificering op basis 59 weerspiegelen. De hardheid van de dij (achterste ledematen) spieren werd geëvalueerd; echter uitgesloten we schedelinhoud Sartorius spieren, omdat ze de neiging om hypertrofie in plaats van atrofie vertonen in CXMD. Behandelde honden tonened lagere inschaling scores en had snellere tijden op de 15 meter looptest. Betere tijden op de 15 m-test zijn een indicatie van een verbeterde spierfunctie 40. Hogere algemene inschaling scores geven een slechte gezondheid en een verhoogde spieratrofie. Hoewel deze resultaten veelbelovend, multi-exon skipping bestaan ​​nog vele uitdagingen die moeten worden overwonnen voordat het klinische toepasbaarheid techniek heeft. Hartweefsel geeft nog steeds een verminderde opname van AONs, waarschijnlijk te wijten aan het verschil in cellulaire handel tussen hart- en skeletspieren weefsel. Geen toxische effecten waargenomen bij dieren onder de huidige doseringsschema&#39;s; moet echter meer werk moet worden gedaan om de toxiciteit op lange termijn te beoordelen alvorens het gebruik van AON cocktails kunnen verplaatsen naar klinische proeven. Het is moeilijk om goedkeuring van AON cocktail drugs te krijgen, omdat de regelgevende agentschappen te definiëren elk AON-sequentie als een uniek drug. Dit betekent dat elke sequentie in een cocktail zouden moeten afzonderlijk worden getest safety, die meer tijd en meer geld. Andere belemmering voor het gebruik van multi-exon skipping in een klinische setting een groot aantal tussenproducten eiwitproducten geproduceerd met onbekende functies. Deze eiwitten kunnen mogelijk leiden tot onvoorspelbare bijwerkingen, afhankelijk van de individuele mutaties 22. Daarnaast is de mutatie patronen beschikbaar zijn binnen de huidige Dystrofe hond modellen zijn beperkt. Er zijn weinig natuur voorkomende mutaties, en niet alle mutaties zijn nuttig voor het bestuderen van multi-exon skipping. De dystrofische varken model belooft een goed alternatief voor de toekomstige DMD exon skipping studies 33, 34 zijn. De DMD hond modellen hebben een aantal voordelen ten opzichte van andere modellen DMD. Omdat het een grotere diermodel, klinische sorteren en MRI zijn mogelijk, waardoor meer gedetailleerde analyse. Aangezien honden zijn grote dieren zijn ze ook geschikt voor toxicologisch onderzoek en beter vertegenwoordigt de menselijke ziekte in vergelijking met het muismodel. hond modellen ook DMD gensequenties die meer lijkt op de mens 23, 34, 45 zijn. Hoewel technisch uitdagende, kan de multi-exon skipping aanpak uiteindelijk ten goede&gt; 90% van de DMD patiënten 24. Dit maakt het een veel beter alternatief voor single-exon skipping, als single-exon skipping is alleen van toepassing op een kleine subgroep van patiënten. Daarnaast zal multi-exon skipping ons in staat om het verwijderen patronen die de functionaliteit van de verkorte dystrofine eiwitten optimaliseren selecteren. Bijvoorbeeld, het verwijderen van DMD exonen 45-55 wordt in verband gebracht met een uitzonderlijk milde symptomen of asymptomatische individuen 14,19,60-63. De multi-exon skippen van exonen 45-55 reeds aangetoond in een muismodel van DMD een exon 52 deletie (mdx52) via systemische injecties van vPMOs 22,26. Het gebruik van cocktails vPMOs is ook aangetoond in andere vormen van spierdystrofie, zoalszoals Fukuyama aangeboren spierdystrofie (FCMD). FCMD wordt veroorzaakt door exon trapping, waarbij afwijkende mRNA-splitsing wordt veroorzaakt door retrotransposonintegratie insertie. vPMOs is aangetoond dat de splicing patroon redden in zowel FCMD muizenmodel en bij humane cellijnen 64. Next-generation AON chemie vertonen grotere werkzaamheid en lagere toxiciteit zou de effectieve vertaling van de multi-exon skipping aanpak in de klinische toepassing ervan te vergemakkelijken. Voorts zouden meerdere exon skipping mogelijk worden toegepast op andere genetische aandoeningen, zoals dysferlinopathies 24, 65.

Duchenne spierdystrofie (DMD) is een X-gebonden recessieve spierziekte gekenmerkt door progressieve spierzwakte, eerst beschreven door Dr. Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD is een veel voorkomende erfelijke ziekte die ongeveer 1 op de 3500 jongens over de hele wereld, met ongeveer 20.000 getroffen kinderen geboren elk jaar 2,3. Motorische ontwikkeling wordt vertraagd en manier van lopen stoornissen worden gezien in de vroege jeugd 4, gevolgd door rolstoel afhankelijkheid bij ongeveer de vroege tienerjaren. De dood treedt meestal op in de leeftijd tussen 20 en 30 als gevolg van de luchtwegen of hartfalen 5-8. Er is momenteel geen remedie voor DMD. Behandeling met glucocorticoïden kan de progressie van spierdegeneratie vertragen tot op zekere hoogte, maar gaat gepaard met significante bijwerkingen, waaronder obesitas en diabetes mellitus 2,7,8. DMD gevolg van mutaties in het dystrofine (DMD) gen, wat leidt tot een verlies van functioneel dystrofine Protein. DMD is een zeer groot gen met meer dan 2 miljoen basenparen en 79 exons 9,10. Schrapping, onzin, en duplicatie mutaties die leiden tot out-of-frame van mutaties zijn de meest voorkomende oorzaak van de DMD fenotype. De gebieden van exons 3-9 en exons 45-55 worden &quot;mutatie hotspots&quot; aangezien de meeste patiënten deletiemutaties in deze gedeelten van het gen, wat leidt tot niet-functioneel dystrofine in DMD patiënten 3,9,11-16. Dystrofine functies binnen het dystrofine-glycoproteïne complex (DGC), die een belangrijke rol in spiermembraan stabilisatie. De N- en C-termini zijn de belangrijkste domeinen functie, terwijl de centrale stang domein speelt een minder grote rol 3,9,17. De naleving van een mild fenotype geassocieerd met Becker spierdystrofie (BMD), die vooral het gevolg is van in-frame mutaties binnen de DMD-gen, geïnspireerd op de toepassing van exon skipping voor de behandeling van DMD. BMD patiënten hebben een verkorte, maar functionaliteitenl, dystrofine-eiwit dat beide uiteinden 3,6,18 onderhoudt. Exon skipping, in theorie, kan het leeskader te herstellen, wat resulteert in verkorte-but-functioneel dystrofine eiwitten vergelijkbaar met die in BMD 3,19. Meerdere typen antisense oligonucleotiden (AONs) zijn getest in klinische studies, met inbegrip van 2&#39;O-gemethyleerd fosforothioaten (2&#39;OMePS) en fosfordiamidaat morfolino-oligomeren (PMO). Skipping exons 51 en 53 met deze AONs is en zolang resultaten zijn veelbelovend, heeft één exon skipping beperkt toepasbaar, omdat het mutatie-specifieke 3, 19, 20,21, 22-26. Vragen blijven ook de stabiliteit van de verkregen verkorte dystrofine eiwitten afkomstig van één exon skipping 22,23. Bovendien hebben sommige patiënten vereisen meer dan een exon worden overgeslagen om het leesraam 3 herstellen. Hoewel technisch minder, multi-exon skipping is een methode diekan deze problemen aanpakken 3,19. Multi-exon skipping is eerder aangetoond in dystrofische honden en humane cellijnen in vitro. Daarnaast hebben mdx52 muizen en honden X-gebonden spierdystrofie (CXMD) hondenmodellen gebruikt voor in vivo studies 22, 24-27. Canine X-gebonden spierdystrofie Japan (CXMD J) beagles werden hier gebruikt, als leesraam van CXMD J kan worden hersteld door multi-exon skipping exons 6 en 8, of extra exonen (bv exons 3-9) (Fig 1). Beagle-gebaseerde CXMD deelt dezelfde mutatie patroon als de Golden Retriever spierdystrofie (GRMD) model, maar beagles zijn kleiner en goedkoper te onderhouden als gevolg van hun lichaamsgrootte, aldus een bruikbaar model voor DMD 28,29. CXMD honden nauwer na te bootsen de menselijke DMD fenotype dan kleinere diermodellen, zoals knaagdieren, en zijn meer betrouwbaar voor toxicologische evaluaties 3,22,30,31 </sup&gt; (Figuur 2). CXMD honden tonen progressieve spier verval, loopstoornissen en hart- en ademhalingsproblemen vergelijkbaar met die in DMD. Vergeleken met één exon skipping, multi-exon skipping van toepassing is op een veel groter aantal patiënten. Van de drie meest voorkomende mutatie (deleties, nonsense en duplicaties), 80 - kan 98% van de patiënten worden behandeld door middel van multi-exon skipping 14,32,33, terwijl 45% van alle DMD patiënten kunnen profiteren van specifiek skipping exons 45 - 55 3,19,22,34. Met de ontwikkeling van gemodificeerde morpholinos, is de efficiëntie van AON cocktails vergemakkelijking exon skipping verbeterd. Arginine-rich-cel penetrerende peptide-geconjugeerde PMO (PPMOs) en vivo-morpholinos (vPMOs) zijn AON chemische die aanzienlijk zijn verbeterd cel-penetrerende vermogen en de stabiliteit 3,35-38. Zorgen blijven over de lange termijn AON toxiciteit; echter aanzienlijke vooruitgangis gemaakt. Chemische modificaties aan morpholinos off-target effecten sterk verminderen en pre-klinische studies hebben geen significante toxische effecten 3,22,39,40 gemeld. Een overblijvende uitdaging voor multi-exon skipping is de huidige eis per individuele AON te testen op toxiciteit alleen, als een geneesmiddel, in plaats van samen als een cocktail 3,19,22,41,42. In DMD studies waarbij zowel single en multi-exon overslaan van gericht op het hart, is er weinig verbetering in dystrofische hartweefsel geweest. De werkzaamheid van morpholinos in het hart wordt verondersteld laag te zijn vanwege de slechte cel-penetrerende vermogen. Peptide-geconjugeerde PPMOs hebben het vermogen van AONs tot hartcellen dringen verbeterd, het verhogen van de hoeveelheid functioneel dystrofine-eiwit gered in het hart 3,19,38. Hier wordt onze AON cocktail aanpak besproken, met inbegrip van het ontwerp van AON sequenties met behulp van ESEfinder software 43. ProtocOLS voor hond experimenten met multi-exon skipping worden ook beschreven. CXMD J beagles werden gebruikt voor exons 6 en 8 overslaan experimenten. Multi-exon skipping in de CXMD hond model geeft hoopvolle resultaten, maar uitdagingen blijven bestaan, dat moet worden opgelost voordat ze klinisch toepasbaar.

<table><tbody><tr><td colspan="4">2'OMePS Transfectie van hondenmyoblasten&nbsp;</td></tr><tr><td>3 ml 6-wells platen</td><td>IWAKI</td><td>5816-006</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s aangepast Eagle&rsquo;s medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectin&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18292-011</td><td>Totaal volume van 100 ml in opti-MEM media met een verhouding van 2:1 voor lipofectin.&nbsp; 10 ml lipofectin voor 5 mg RNA.&nbsp;</td></tr><tr><td>2&rsquo;OMePS</td><td>Eurogentec&nbsp;</td><td></td><td>Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), en Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&nbsp;</td></tr><tr><td>Paarden serum&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16050-114</td><td>2%</td></tr><tr><td>streptomycine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 &#956;g/ml</td></tr><tr><td>Bovien serum albumine (BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Morpholino transfectie van hondenmyoblasten 
Alle materiaal van MePS Transfectie van hondenmyoblasten voor cultivering</td></tr><tr><td>Antisense morpholinos&nbsp;</td><td>Gene-tools</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Verdunnen tot een eindvolume van 100 L in opti-MEM media.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 120&ndash;200 mg/kg van morpholinos op 32 mg/ml in zoutoplossing</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene-tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp;ml/plaat</td></tr><tr><td colspan="4">RNA Extractie en Reverse Transcriptie Polymerase Ketting Reactie (RT-PCR)</td></tr><tr><td>guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp;ml/plaat</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td>200 &#956;l&nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 ml buisjes&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% Ethanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td></td></tr><tr><td>UV Spectrometer&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forward primer in exon 5&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1.5 &#956;l 10 &#956;M</td></tr><tr><td>Reverse primer in exon 10&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1.5 &#956;l 10 &#956;M</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Clontech</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>One-Step RT-PCR kit&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-cycler</td><td>Scinco</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Complementaire DNA (cDNA) Sequencing&nbsp;</td></tr><tr><td>Gel extractie kit&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit&nbsp;</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td>4337454</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Intramusculaire injecties of open spierbiopsie</td></tr><tr><td>Chirurgische Instrumenten</td><td></td><td></td><td>Scharen, scalpel, naald, chirurgische draad&nbsp;</td></tr><tr><td>Dierlijke Zalf&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jodoforen&nbsp;</td><td>webtextiles</td><td>12190-71-5</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine</td><td>Peridex</td><td>12134</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Lakens&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scrubs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gezichtsmasker&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Handschoenen&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoofdbedekking&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiopental natrium&nbsp;</td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma&nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Abbott laboratories&nbsp;</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr><td>Antisense morpholinos&nbsp;</td><td>Gene-tools</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Verdunnen tot een eindvolume van 100 L in opti-MEM media.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&

multi-exon skipping met behulp cocktail antisense-oligonucleotiden in de canine x-gebonden muscular dystrophy

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Duchenne spierdystrofie (DMD) is een van de meest voorkomende dodelijke genetische ziekten wereldwijd, veroorzaakt door mutaties in het dystrofine (DMD) gen. Exon skipping telt korte DNA / RNA-moleculen genaamd antisense oligonucleotiden (AONs), die de reading frame te herstellen en produceren kortere, maar functionele eiwitten. Echter, exon skipping therapie voor twee belangrijke obstakels: beperkte toepasbaarheid (tot slechts 13% van de patiënten kunnen worden behandeld met één AON geneesmiddel) en onzekere functie van afgeknotte eiwitten. Deze problemen werden behandeld met een cocktail AON aanpak. Terwijl ongeveer 70% van de DMD patiënten kunnen worden behandeld door één exon skipping (alle exons samen), kan men eventueel behandelen meer dan 90% van de DMD patiënten als multiple exon skipping behulp cocktail antisense middelen worden gerealiseerd. De honden X-gebonden spierdystrofie (CXMD) hond model, waarvan het fenotype is op humane DMD patiënten, werd gebruikt om de systemische effic testenacy en veiligheid van multi-exon skipping exons 6 en 8. De CXMD hondenmodel herbergt een splitsingsplaats mutatie in intron 6, wat leidt tot een gebrek aan exon 7 in dystrofine mRNA. Om het herstel van de reading frame in CXMD vereist multi-exon skipping van exons 6 en 8; Daarom is een goede CXMD middelgrote diermodel voor het testen van de werkzaamheid en veiligheid van multi-exon skipping. In de huidige studie, een cocktail van antisense morpholinos targeting exon 6 en exon 8 werd ontworpen en gerestaureerd dystrofine-expressie in het lichaam-brede skeletspieren. Werkwijzen voor transfectie / injectie cocktail oligos en evaluatie van de werkzaamheid en veiligheid van multi-exon skipping in de CXMD hondenmodel worden gepresenteerd.

In vitro experimenten Myoblasten werden met verschillende 2&#39;OMePS behandelcondities teneinde de doeltreffendheid van elk AON vergelijken. Één AON behandeling met 600 nM elk van Ex6A, Ex6B, Ex8A of Ex8B waren, en een cocktail behandeling met 600 nM elk van 4 AON sequenties. RNA-monsters werden verzameld vier dagen na transfectie. Na RT-PCR werden monsters voor elke behandeling uitgevoerd op een gel samen met niet-behandelde (NT) monsters. Bands hoger op de gel vertegenwoordigen out-of-frame van DMD producten; deze bands werden gezien in NT, Ex8A en Ex8B behandeld myoblasten. Ex6A, Ex6B, Ex8A, en de-cocktail behandelde myoblasten toonde in-frame producten. De cocktail en Ex6A / B toonde 100% in-frame producten, terwijl Ex8A vertoonde slechts 30% in-frame producten (Figuur 7). Om exon skipping en het herstel van bevestigenhet leesraam, cDNA sequentie werd uitgevoerd; de resultaten bleek dat exons 6-9 inderdaad overgeslagen (Figuur 7). Immunohistochemie toonde dat AON-behandelde honden dystrofine-positieve vezels gestegen vergeleken met NT monsters (Figuur 8). In Vivo experimenten Om de efficiëntie van de verschillende AON behandeling voorwaarden vergelijken, CXMD honden - werden (0,5 5 jaar oud) een keer geïnjecteerd met 1,2 mg Ex6A of een cocktail van Ex6A, Ex6B en Ex8A bij verschillende doseringen. Twee weken na de injectie werden de spieren monsters verzameld en gekleurd met DYS-1 het aantal dystrofine positieve vezels vergelijken. All-cocktail behandelde monsters vertoonden verhoogde dystrofine-expressie in vergelijking met NT monsters. Dystrofine-positieve vezels verhoogd met AON dosering (figuur 9). Naar aanleiding van het systeemic injectie, wild-type (WT) en NT-cocktail behandelde CXMD spier monsters werden gekleurd met DYS-1 (Figuur 10). -Cocktail behandelde CXMD honden vertoonden verhoogde dystrofine expressie in vergelijking met NT CXMD honden, zowel in CT en hartspier samples. Echter, AON-behandelde skeletspier (CT) vertoonden veel hogere expressie van dystrofine opzichte behandeld hartspier. Een immunoblot vergelijken WT, NT, en diverse morfolino-cocktail behandeld spieren leidde tot dezelfde conclusie. Er was ook een groot aantal dystrofine in de skeletspier behandelde monsters (figuur 10). Hematoxyline en eosine (HE) kleuring onthulde dat behandeld CXMD honden vertoonden verbeterde histopathologie, met een significante afname in centraal kernhoudende vezels (CNF) ten opzichte van NT CXMD honden (figuur 11). Dit geeft aan dat er meer degeneratie / regeneratie plaatsvindt in het NT hond, een teken van dystrofische spier pathologie. Daarnaast behandelde honden sneller hadlooptijden en verbeterde scores op de klinische indelingsschema. Behandelde CXMD honden toonde beter scoort dan NT CXMD honden in alle categorieën (Figuur 12). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> Figuur 1. Mutatie Patroon van de CXMD Hond en Exons 6 -. 8 Skipping strategieën door middel van een antisense Cocktail CXMD honden hebben een punt mutatie in exon 6 leidt tot een verlies van exon 7 in dystrofische honden mRNA. Dit resulteert in het mRNA die out-of-frame en dystrofine eiwitproductie verloren. Korte AON sequenties zijn ontworpen om te binden met exon 6 en 8, waardoor mRNA splicing effectief skipping exons 6 - 8. De grijze balk in de AON-cocktail behandelde honden vertegenwoordigt korte AON sequenties. Exon 9 codeert voor een scharnier domein en wordt soms spontaan gesplitst met AONs tegen exon 6 en 8. De resulterende mRNA codeert voor dystrofine eiwitten die korter zijn, maar functieal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> Figuur 2. De belangrijkste klinische verschijnselen van een 1-jarige Canine X-gebonden Muscular Dystrophy (CXMD) Animal. Een 1-jarige wild-type beagle en een CXMD hond worden getoond. De betrokkenheid van proximale, de ledematen, en temporele spieren zijn meestal waargenomen vanaf 2 maanden oud. Joint contractuur en een verschuiving van het bekken zijn openlijke vanaf 4 maanden oud. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> Figuur 3. Algemene Anesthesie voor een hond. A) Intramuscular injecties en spierbiopten worden uitgevoerd onder algemene anesthesie met isofluraan. B) Het houden van het dier voor systemische injecties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> Figuur 4. Magnetic Resonance Imaging (MRI) van wild-type niet-behandelde CXMD en behandeld CXMD. MRI scans van de achterpoot bij 3 maanden en 5 maanden in WT en NT CXMD honden. Twee voorbeeldfoto&#39;s van de behandelde CXMD achterste ledematen MRI pre- (1 week voor de eerste injectie) en post-injectie van AON worden getoond. 2703MA werd behandeld met 7x wekelijks 200 mg / kg cocktail morpholinos. 2001MA werd behandeld met 5x wekelijkse intraveneuze injectie van 120 mg / kg cocktail morpholinos. Controle en behandelde honden waren dezelfde leeftijd. Behandelde honden tonen afgenomen T2 signalen. De beelden zijn ADAP<html> ted met toestemming van Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> Figuur 5. spierbiopsie Procedure voor een hond. A) Een lagere ledematen is vastgesteld voor spierbiopsie. B) Met behulp van een tang, de onderste ledematen wordt gehouden. C) De CT spier is blootgesteld. Open biopsie techniek wordt gebruikt om de spieren monsters van geïnjecteerde plaatsen te verkrijgen. Draden worden gebruikt voor biopsie monsters te houden. D) Muscle samples op tragantgom na dissectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; Figuur 6. Semi-droge overdrachtmethode. Een weergave van de halfdroge overdrachtmethode voor Western blotting wordt gepresenteerd. Drie papieren gedrenkt in geconcentreerde anode buffer zijn vastgelegd op de minpool vastgesteld; 3 papier gedrenkt in anode buffer gestapeld bovenop. De Mb PVDF papier wordt geweekt in methanol en vervolgens anode buffer alvorens het werd geplaatst bovenop de 6 papers. De gel, die gedrenkt is in kathode buffer wordt voorzichtig gelegd over de PVDF papier. Tenslotte papier gedrenkt in 3 kathode buffer gelegd bovenop de gel. De positieve terminal is gelegen op de top. 1 uur, 400 mA wordt uitgevoerd door het systeem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> Figuur 7. Exon Skipping in CXMD myoblasten. </strong&gt; CXMD myoblasten werden met Ex6A, Ex6B, Ex8A of Ex8B alleen, of een cocktail van alle vier. Een totaal van 600 nm werd gebruikt voor de enkelvoudige sequenties en de cocktail 600 nM elke sequentie werd gebruikt. A) 2&#39;OMePS behandeling CXMD hond myoblasten. Ex6A, Ex6B, en de-cocktail behandelde monsters vertonen een sterke banden bij de verwachte positie van de in-frame exon-overgeslagen transcripten. Ex8A toont een tussenliggende band, Ex8B toont een zwakke band, en NT niet een band te laten zien aan de in-frame positie. B) cDNA sequentie van Ex6A alleen 4 dagen na transfectie. Beelden worden aangepast met toestemming van Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> Figuur 8. Verhoogde Dystrophin Expressie in 2&#39;O-gemethyleerd fosforthioaat (2&#39;OMePS) Getransfecteerde CXMD myoblasten. CXMD myoblasten werden met Ex6A alleen of met een cocktail 2&#39;OMePS. DYS-2 (rood) en DAPI (blauw) vlekken worden getoond. De behandelde myoblasten worden vergeleken met wildtype (WT) en niet-behandelde (NT) myoblasten. Beelden worden aangepast met toestemming van Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 50 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> Figuur 9. Redding van Dystrofine Expression met intramusculaire injecties van Morpholinos in CXMD Dogs. Ofwel Ex6A alleen of een cocktail van Ex6A, Ex6B en Ex8A werden geïnjecteerd in de CT spieren van CXMD honden. Dystrofine (DSY-1) kleuring van wild-type(WT), niet-behandelde (NT) en behandeld CXMD honden zijn weergegeven. De honden werden behandeld met ofwel 1,2 mg Ex6A alleen of 1,2 mg cocktail. Beelden worden aangepast met toestemming van Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 100 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> Figuur 10. Verhoogde dystrofine Na systemische Cocktail morfolino behandeling in CXMD honden. Dystrofine (DYS-1) kleuring werd gebruikt om dystrofine vergelijken in wild type (WT) (positieve controle), onbehandeld (NT) (negatieve controle), en CXMD honden behandeld met 120 mg / kg morfolino cocktail (40 mg / kg per AON). De morfolino cocktail bevatte Ex6A, Ex6B en Ex8A. Honden werden intraveneus 5 keer geïnjecteerd weekly met deze cocktail. A) Een vergelijking van dystrofine craniale tibiale (CT) spieren van WT, NT en behandelde honden. B) Een vergelijking van dystrofine expressie in hartweefsel tussen NT en morfolino-cocktail behandelde honden. C) Immunoblot voor dystrofine met desmine als een laad controle getoond voor WT, NT, en morfolino-cocktail behandelde honden. De volgende spieren worden weergegeven voor behandelde honden: triceps brachii (TB), biceps brachii (BB), diafragma (DIA), slokdarm (ESO), CT, adductor (ADD), extensor digitorum longus (EDL), masseter (MAS), en het hart. Beelden worden aangepast met toestemming van Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 200 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> Figuur11. Verbeterde Histopathologie in CXMD honden die 7 weken met 240 mg / kg morfolino Cocktail. CXMD honden, variërend van een half jaar tot vijf jaar oud werden intraveneus geïnjecteerd met 240 mg / kg morfolino cocktail (Ex6A, Ex6B en Ex8A) eenmaal week gedurende 7 weken. Veertien dagen na de laatste injectie werden slokdarm spieren genomen hematoxyline en eosine (HE) kleuring werd uitgevoerd. HE kleuring van de slokdarm spieren van niet-behandelde (NT) en morfolino cocktail-behandelde (bewerkt) CXMD honden (40X objectief). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> Figuur 12. Verbeterde Scores op Clinical Grading en 15 m Running Time After morfolino Treatment. Morfolino-behandelde honden werden vergeleken met niet-behandelde (NT) nestgenoots. Error bars in de grafiek geven SEM. A) totaalscore op de klinische indeling examen berekend voor en na behandeling en behandelde dieren werden vergeleken met NT nestgenoten. B) Een vergelijking van 15 m looptijden van behandelde honden en NT. C) Net als B; werden echter jongere honden gebruikt. Beelden worden aangepast met toestemming van Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> antisense Oligonucleotide </td><td> nucleotide Sequence </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Antisense Oligonucleotide Design.

Exon skipping is momenteel een veelbelovende therapeutische optie voor Duchenne spierdystrofie (DMD). Om de toepasbaarheid voor DMD patiënten uit te breiden en de stabiliteit / functie van de resulterende afgeknotte dystrofine-eiwit te optimaliseren, een multi-exon skipping benadering met behulp van cocktail antisense oligonucleotiden werd ontwikkeld en we aangetoond systemische dystrofine redding bij een hond model.

Multi-exon Skipping Met behulp Cocktail antisense-oligonucleotiden in de Canine X-gebonden Muscular Dystrophy

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Het algemene doel van dit experiment is om de werkzaamheid en toxiciteit van meervoudige exon-skipping te onderzoeken met behulp van cocktail-antisense-oligonucleotiden of AON's in een hondmodel voor Duchenne spierdystrofie of DMD. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in translationeel onderzoek naar antisense exon-skipping-therapie, zoals de vraag of antisense-oligonucleotiden meervoudige exon-skipping kunnen induceren en de expressie van dystrofine kunnen herstellen in een groot diermodel. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van het hondmodel in een studie is dat therapeutische resultaten in grotere dieren betrouwbaarder kunnen worden geëxtrapoleerd naar DMD-patiënten.Hoewel exon-skipping een zeer veelbelovende therapie is voor DMD, kan het ook worden toegepast op andere genetische aandoeningen, zoals congenitale musculaire dystrofie en limb-girdle musculaire dystrofie. De demonstratie van de in vitro experimenten zal worden uitgevoerd door Dr. Yoshitsugu Aoki, ons laboratoriumhoofd, en de demonstratie van de in vivo experimenten zal worden uitgevoerd door Dr. Mutsuki Kuraoka, een postdoctoral fellow van mijn afdeling. Na het ontwerpen van de AON's volgens het tekstprotocol, worden 6-well platen gebruikt om 1 tot 5 × 10³ per vierkante centimeter CXMD myoblasten uit te zaaien in 3 mL DMEM met 10% FBS en 1% pen-strep.Incubeer de cellen bij 37 °C tot een confluentie van 60 tot 80%. Wanneer de cellen de gewenste confluentie hebben bereikt, gebruik dan medium met een verlaagd serumgehalte om een kationisch liposoom-transfectiereagens te verdunnen tot een totaal volume van 100 µL, en laat het mengsel 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur staan. Verdun vervolgens de AON's met medium met een verlaagd serumgehalte tot een eindvolume van 100 µL.Combineer het verdunde transfectiereagens met de verdunde AON's en incubeer dit gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder ondertussen het medium van de cellen en was de cellen drie keer met vers medium. Voeg vervolgens 0,8 milliliters medium toe aan het transfectiemengsel en voeg daarna de volledige oplossing toe aan de vers gewassen cellen.Incubeer gedurende drie uur bij 37 °C. Voeg vervolgens differentiatiemedium, of DM, toe aan de cellen en incubeer tot 10 dagen zodat differentiatie kan plaatsvinden. Controleer vanaf ongeveer dag drie op differentiatie.Om morpholino-transfectie van hondemyoblasten uit te voeren, kweekt u CXMD-myoblasten zoals eerder in deze video is gedemonstreerd. Verwarm de cocktail-morpholino's 10 minuten lang bij 65 °C. Voeg vervolgens een peptide-afleveringsreagens toe en breng de morpholino naar een eindconcentratie van 3 tot 6 µM.Vervolgens wordt DM gebruikt om het medium in de myoblasten te vervangen, waarna de morpholino aan elke put wordt toegevoegd tot een eindconcentratie van 1 µM. Incubeer gedurende 16 tot 18 uur. Voeg daarna, om de cellen te oogsten voor RNA-extractie, 1 mL guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform toe aan de cellen om ze van de plaat los te maken.Na het incuberen van de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, worden de cellen overgebracht naar 1,5-milliliter buisjes. Voeg 200 µL chloroform toe aan elk buisje en incubeer twee minuten bij kamertemperatuur totdat er drie afzonderlijke lagen zichtbaar zijn: de RNA-laag, de eiwitlaag en de DNA-laag. Centrifugeer de buisjes bij 12.000 ×g en 4 °C gedurende 15 minuten.Verwijder vervolgens de bovenste laag supernatant en breng deze over naar een buis met 500 µL isopropanol. Centrifugeer de buizen met supernatant voordat u het supernatant verwijdert en het RNA-pellet bewaart. Was het pellet met ethanol en centrifugeer bij 8,000 ×g en 4 °C gedurende vijf minuten.Keer de buis gedurende 15 minuten om om het resterende ethanol te laten verdampen voordat u 15 tot 30 µL RNase-vrij water toevoegt. Gebruik vervolgens UV-Vis spectroscopie bij 260 nm om het RNA te kwantificeren. Meng voor het uitvoeren van de RT-PCR de volgende reagentia en voeg water toe tot een eindvolume van 25 µL.Plaats de monsters in een thermocycler en voer het volgende programma uit. Wanneer de run is voltooid, bewaar het product bij vier graden Celsius of 20 graden Celsius. Om een intramusculaire injectie uit te voeren, gebruik na het voorbereiden van het dier voor de chirurgie en het anesthetiseren volgens het tekstprotocol een scalpel om de huid ongeveer vijf centimeter longitudinaal over de cranial tibial, of CT, in te snijden. Gebruik om de injectieplaatsen te markeren een chirurgische naald en chirurgisch garen om de diepe fascia te hechten door twee hechtingsmarkeringen aan te brengen met intervallen van twee centimeter.Het is zeer belangrijk om de injectieplaats met een draad te markeren, omdat dit een nauwkeuriger biopt mogelijk maakt. Injecteer vervolgens met een 27-gauge naald de gewenste concentratie AONs in de spier en laat de naald één minuut zitten. Voer daarna een open spierbiopt uit door met een chirurgisch scalpel een stuk spierweefsel van ongeveer twee centimeter lengte uit de CT-spier te verwijderen.Plaats de spierfascie terug over de spier en gebruik 000 absorbeerbare hechtdraad om het weefsel te sluiten. Sluit vervolgens de huid met 000 nylon hechtdraad. Dien met een naald een intramusculaire injectie toe van 0,02 milligram per kilogram buprenorfinhydrochloride.Om een cocktail met gelijke hoeveelheden van elk AON in een ledemaatader te injecteren, terwijl het dier volgens het tekstprotocol wordt vastgehouden, wordt een veneuze verblijfsnaald in een ledemaatader geplaatst. Injecteer met behulp van een infusiepomp of spuitendraaier in totaal 50 milliliters gedurende 20 minuten met een snelheid van 2,5 milliliters per minuut, in overeenstemming met de instructies van de fabrikant. Herhaal de injecties wekelijks of tweewekelijks, aangezien de dystrophine-expressie zal toenemen bij herhaalde injecties.Voer wekelijkse bloedtesten uit om de toxiciteit te onderzoeken door met een naald drie milliliters bloed af te nemen uit een van de subcutane venen van de voor- of achterpoot. Voer de volgende beoordelingen uit volgens de instructies van de fabrikant. Voer verdere analyses uit conform het tekstprotocol.Myoblasten werden getransfecteerd met verschillende 2'OMePS-behandelingscondities om de effectiviteit van elk AON te vergelijken. De hier getoonde gel representeert RT-PCR-monsters van RNA dat vier dagen na de behandeling is verzameld. Banden die hoger op de gel liggen, representeren out-of-frame DMD-producten en werden waargenomen in de niet-behandelde Ex8A- en Ex8B-behandelde myoblasten.Ex6A, Ex6B, Ex8A en de met de cocktail behandelde myoblasten vertoonden in-frame producten. cDNA-sequencing bevestigde dat exon 6 tot en met 9 waren overgeslagen. Zoals in deze figuur te zien is, onthulde immunocytochemie dat met AON behandelde hondencellen een toename van dystrofine-positieve vezels vertoonden in vergelijking met onbehandelde monsters.Om de effectiviteit van verschillende AON-behandelingscondities te vergelijken, kregen CXMD-honden injecties met Ex6A, of een cocktail van Ex6A, Ex6B en Ex8A in diverse doseringen. Spiermonsters gekleurd voor DYS1 vertonen een toename van de dystrofine-expressie in de met de cocktail behandelde monsters, waarbij het aantal dystrofine-positieve vezels toenam met de dosis dystrofine. Na systemische injecties vertoonden de met de cocktail behandelde CXMD-honden een verhoogde dystrofine-expressie vergeleken met NT CXMD-honden, zowel in CT- als in hartspiermonsters.Echter vertoonden AON-behandelde skeletspieren een veel hogere expressie van dystrofine vergeleken met behandelde hartspier. Bovendien vertoonden behandelde CXMD-honden een verbeterde histopathologie met een significante afname van centraal-gekernelde vezels in vergelijking met NT CXMD-honden. Zodra men de methode beheerst, kunnen zowel in vitro als in vivo experimenten in enkele uren worden voltooid indien ze correct worden uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de gezondheidstoestand van de hond zorgvuldig te bewaken. Na de ontwikkeling hiervan maakte systemische exon-skipping de weg vrij voor onderzoekers in dit veld om humane klinische studies bij DMD-patiënten te starten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe honden behandeld kunnen worden met antisense-oligonucleotiden.

multi-exon-skipping-using-cocktail-antisense-oligonucleotides-canine

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Verschillende antisense oligonucleotides (AONs) hebben aangetoond dat induceren exon integratie (splice modulatie) en SMN expressie voor spinale musculaire atrofie (SMA) te redden. Hier beschrijven we een protocol voor AON lipotransfection ertoe exon opneming in het SMN2 -gen en de evaluatiemethoden te bepalen van de werkzaamheid bij SMA patiënt fibroblasten.

Evaluatie van de opname van de Exon geïnduceerd door Splice switch Antisense Oligonucleotides in SMA patiënt fibroblasten

Hier bieden we een gedetailleerd protocol te verrichten in vivo cardiale gene bewerken in muizen met behulp van recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV)-gemedieerde levering van CRISPR. Dit protocol biedt een veelbelovende therapeutische strategie voor de behandeling van Dystrofe cardiomyopathie in Duchenne spierdystrofie en kan worden gebruikt voor het genereren van cardiale-specifieke knock-out in de postnatale muizen.

Adeno-Associated Virus-gemedieerde levering van CRISPR voor cardiale Gene bewerken in muizen

Hier presenteren we een protocol om Transient hartfunctie bij Duchenne spierdystrofie muizen door exosomes afgeleid van normale myogenic voorlopercellen verplanten.

Zuivering en transplanteren van Myogenic Progenitor cel afgeleid Exosomes ter verbetering van de hartfunctie bij Duchenne Muscular Dystrofe muizen

Hier presenteren we een Cas9-gebaseerd exon23 deletie protocol om Dystrofine expressie in iPSC te herstellen van DMDMDX Mouse-afgeleide huid fibroblasten en direct ipscs te onderscheiden in myogene voorlopercellen (MPC) met behulp van het Tet-on myod activeringssysteem.

CRISPR/Cas9 technologie in het herstellen van Dystrofine expressie in door iPSC afgeleide spier voorlopercellen

Hier presenteren we de moleculaire karakterisering van dystrofine 38 expressie met behulp van Sanger sequencing, RT-PCR, en westerse blotting in de klinische studie.

Karakteriseren exon overslaan efficiëntie in DMD patiënt monsters in klinische proeven van antisense oligonucleotiden

In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het efficiënt modelleren van Duchenne spierdystrofie met behulp van MYOD1-geconverteerdeurine-afgeleide cellen om het herstel van dystrofine mRNA en eiwitniveaus te evalueren na exon overslaan.

Exon Overslaan in direct geherprogrammeerd Myotubes verkregen uit menselijke urine-afgeleide cellen

Dit protocol beschrijft de omzetting van huidfibbroblasten in myoblasten en hun differentiatie in myotubes. De cellijnen zijn afgeleid van patiënten met neuromusculaire aandoeningen en kunnen worden gebruikt om pathologische mechanismen te onderzoeken en therapeutische strategieën te testen.

Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken

Beschrijven we een minimaal-invasieve en pijnloze methode om honden achterbeen spierkracht en spier reactie op de herhaalde excentrische contracties te meten.

In vivo Canine spierfunctie Assay

Een gestructureerd protocol wordt gepresenteerd voor een cel-gebaseerde test als een functionele test om de prognose van idiopathische scoliose te voorspellen met behulp van cellulaire diëlektrische spectroscopie (CDS). De test kan worden uitgevoerd met vers of ingevroren perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) en de procedure binnen 4 dagen.

Cel-gebaseerde test protocol voor de prognostische Voorspelling van Idiopathische scoliose met behulp van cellulaire diëlektrische spectroscopie

Dit protocol omvat gedetailleerde procedures voor de isolatie van urine-afgeleide cellen van patiënten met spierdystrofie; hun efficiënte en snelle herprogrammering door Sendai-virus transductie.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van spierdystrofie patiënten: Efficiënte-Integratie gratis herprogrammeren van Urine-afgeleide cellen

Leer multi-exon skipping met cocktail antisense-oligonucleotiden in een hondenmodel van Duchenne musculaire dystrofie. Deze methode toont systemische dystrofine-rescue en therapeutisch potentieel voor DMD-patiënten.

Multi-exon Skipping Met behulp Cocktail antisense-oligonucleotiden in de Canine X-gebonden Muscular Dystrophy

Meer video's verkennen