Multi-exon Skipping Met behulp Cocktail antisense-oligonucleotiden in de Canine X-gebonden Muscular Dystrophy

Het algemene doel van dit experiment is om de werkzaamheid en toxiciteit van meerdere exon-skipping te onderzoeken met behulp van cocktail-antisense oligonucleotiden of AON's in een hondenmodel van Duchenne-spierdystrofie of DMD. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in translationeel onderzoek van antisense exon-skipping therapie, zoals of antisense oligonucleotiden meerdere exon-skipping kunnen induceren en dystrofie-expressie kunnen vernietigen in een groot diermodel. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van het hondenmodel in een studie is dat therapeutische resultaten bij grotere dieren betrouwbaarder kunnen worden geëxtrapoleerd naar DMD-patiënten.

Hoewel exon-skipping een veelbelovende therapie is voor DMD, kan het ook worden toegepast op andere genetische ziekten, zoals congenitale spierdystrofie en spierdystrofie van de ledematen. Het demonstreren van de in vitro experimenten zal worden gedaan door Dr. Yoshitsugu Aoki, onze laboratoriumchef, en het demonstreren van de in vivo experimenten zal worden gedaan door Dr. Mutsuki Kuraoka, een postdoctoraal onderzoeker uit mijn afdeling. Na het ontwerpen van AON's volgens het tekstprotocol, gebruik 6-well platen om een tot vijf keer 10 tot de derde per vierkante centimeter CXMD myoblasten te zaaien in drie milliliter DMEM met 10%FBS en 1%pen-strep.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius tot 60 tot 80%confluent. Wanneer de cellen de gewenste confluëntie bereiken, gebruik gereduceerd serummedium om een cationisch liposomentransfectiereagens te verdunnen tot een totaal volume van 100 microliter, en laat het mengsel 30 tot 45 minuten op kamertemperatuur staan. Verdun vervolgens met gereduceerd serummedium de AON's tot een eindvolume van 100 microliter.

Combineer het verdunde transfectiereagens met de verdunde AON's en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten. Verwijder ondertussen het medium van de cellen en gebruik vers medium om de cellen drie keer te wassen. Voeg vervolgens 0,8 milliliter medium toe aan het transfectiemengsel en voeg vervolgens de hele oplossing toe aan de vers gewassen cellen.

Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende drie uur. Voeg vervolgens differentiatiemedium of DM toe aan de cellen en incubeer maximaal 10 dagen voor differentiatie. Begin rond dag drie met het controleren op differentiatie.

Om morfolinotransfectie van hondenmyoblasten uit te voeren, kweek CXMD myoblasten zoals eerder in deze video is gedemonstreerd. Verwarm cocktail morfolinos gedurende 10 minuten op 65 graden Celsius. Voeg vervolgens een peptideleveringsreagens toe en pas de morfolino aan tot een eindconcentratie van drie tot zes micromolar.

Gebruik vervolgens DM om het medium in de myoblasten te vervangen en voeg de morfolino toe aan elke put met een eindconcentratie van één micromolar. Incubeer gedurende 16 tot 18 uur. Voeg vervolgens één milliliter guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform toe aan de cellen om ze los te maken van de plaat om de cellen te verzamelen voor RNA-extractie.

Nadat de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zijn geïncubeerd, breng de cellen over in 1,5-milliliter buisjes. Voeg 200 microliter chloroform toe aan elke buis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee minuten totdat drie afzonderlijke lagen zichtbaar zijn, de RNA-laag, de eiwitlaag en de DNA-laag. Centrifugeer de buisjes bij 12.000 keer g en vier graden Celsius gedurende 15 minuten.

Verwijder vervolgens de bovenste laag supernatant en breng over naar een buis met 500 microliter isopropanol. Draai de supernatantbuisjes voordat het supernatant wordt verwijderd en het RNA-pellet wordt bewaard. Gebruik ethanol om het pellet te wassen en centrifugeer bij 8.000 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Keer de buis om gedurende 15 minuten om het resterende ethanol te laten verdampen voordat 15 tot 30 microliter RNase-vrij water wordt toegevoegd. Gebruik vervolgens UV-Vis-spectroscopie bij 260 nanometer om het RNA te kwantificeren. Om RT-PCR uit te voeren, meng de volgende reagentia en voeg water toe tot een eindvolume van 25 microliter.

Plaats de monsters in een thermocycler en voer het volgende programma uit. Wanneer de run is voltooid, bewaar het product bij vier graden Celsius of 20 graden Celsius. Om een intramusculaire injectie uit te voeren, nadat het dier is voorbereid op de operatie en is verdoofd volgens het tekstprotocol, gebruik een scalpel om de huid ongeveer vijf centimeter langs de craniale tibiale of CT te snijden. Om de injectieplaatsen te markeren, gebruik een chirurgische naald en chirurgisch draad om de diepe fascia te naaien door twee steekmarkeringen op twee centimeter intervallen te maken.

Het is erg belangrijk om de injectieplaats met draad te markeren, omdat dit een nauwkeuriger biopsie mogelijk maakt. Injecteer vervolgens met een 27-gauge naald de gewenste concentratie AON's in de spier en laat de naald een minuut in de spier. Gebruik vervolgens een chirurgisch scalpel om een stuk spierweefsel van ongeveer twee centimeter lengte uit de CT-spier te verwijderen om een open spierbiopsie uit te voeren.

Leg het spierfascia terug over de spier en gebruik een 000 absorbeerbaar draad om het weefsel te sluiten. Gebruik vervolgens 000 nylondraad om de huid te sluiten. Gebruik een naald om een intramusculaire injectie van 0,02 milligram per kilogram buprenorfinehydrochloride toe te dienen.

Om een cocktail met gelijke hoeveelheden van elke AON in een ledemaatvene te injecteren, terwijl het dier wordt vastgehouden volgens het tekstprotocol, steek een veneuze indwellende naald in een ledemaatvene. Injecteer met behulp van een infuuspomp of spuitpomp 50 milliliter totaal bij 2,5 milliliter per minuut gedurende 20 minuten, volgens de instructies van de fabrikant. Herhaal de injecties wekelijks of tweewekelijks, omdat dystrofine-expressie zich zal ophopen bij herhaalde injecties.

Voer wekelijkse bloedtesten uit om toxiciteit te onderzoeken, gebruik een naald om drie milliliter bloed te verzamelen uit een van de subcutane a