Name: Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Leer de geoptimaliseerde NMDG-beschermende herstelmethode voor het voorbereiden van acute hersensneden. Deze techniek verbetert de neuronale preservatie aanzienlijk voor patch-clamp elektrofysiologie bij volwassen dieren en menselijk weefsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door het Allen Instituut voor hersenonderzoek. De auteurs bedank de Allen Instituut oprichters, Paul G. Allen en Jody Allen, voor hun visie, aanmoediging en ondersteuning. Wij danken ook het Allen Instituut technisch ondersteunend personeel voor het uitvoeren van dierenverzorgers, veehouderij en genotypering.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Nb + Spike-in verbetert Gigaohm zegel vorming en Patch-Clamp opname van succes De eerste versie van de beschermende herstelmethode van NMDG werd speciaal ontworpen voor veroudering en volwassen dieren2,5. Sommige vroege adopters hebben ook geprobeerd om te passen deze methode op jonge dierlijke hersenen snijden (dat wil zeggen, muizen < 30 dagen oud). Er heeft echter opgemerkt dat in tegenstelling tot het uitstekende visueel bevestigd neuronale behoud met de NMDG beschermende herstelmethode in deze leeftijdscategorie, gigaohm zegel vorming kan vaak kraam, leiden tot mislukte patch klem opname pogingen. Een hypothese is dat NMDG caties gemakkelijker in juvenile hersenen plakjes ten opzichte van de volwassen hersenen segmenten zitten en zegel vorming belemmeren kunnen; echter gigaohm zeehonden kunnen gemakkelijk vormen terwijl jonge hersenen segmenten zijn volledig ondergedompeld in NMDG aCSF (gegevens niet worden weergegeven), dus met de vermelding dat NMDG aCSF per se is niet belemmeren gigaohm zegel vorming.
De snelle overgang van laag naar hoog nb+ oplossing aan het einde van de eerste hersenen segment herstelstap veroorzaakt schade aan de neuronale membranen en ten van het proces van de vorming van zegel. Dit is intuïtief, gezien het feit dat de overgang van laag naar hoog nb+, koud-te-warm temperatuur, en dramatische verhoging van de Ca2 + naar verhouding Mg2 + gezamenlijk leiden tot een enorme opleving van de spontane activiteit van de synaptische. Deze remmende rebound-fase in de hersenen snijden procedure is waarschijnlijk te spiegelen reperfusie letsel na een ischemische belediging. Dus verder neuronale membraan schade te beperken in de eerste herstelfase die een geleidelijke nb+ spike-procedure is overgenomen waarin de verheffing van nb+ concentratie in de NMDG beschermende herstel incubatie zaal langzaam is en reproducibly verhoogde met precieze timing. Net als in de oorspronkelijke beschermende invorderingsprocedure is de temporele dissociatie van nb+ hoogte van temperatuur en Ca2 +/Mg2 + verhouding hoogte gunstig. Maar daarnaast de nb+ spike-procedure leidt tot kleine incrementele verhoogt in extracellulaire nb+ concentratie over de vroege tijdstippen en forse stijgingen van de richting van de late tijd punten, waardoor het hersenweefsel bieden een kans om beter tegemoet aan de stijgende niveaus van de nb+ . Deze procedure is dat een alternatief voor geleidelijke oplossing uitwisseling gecontroleerd door een perfusie pomp of zwaartekracht infuus lijnen die leiden tot de constante stijgingen van de nb+ niveaus en vereist aandacht voor zowel instroom en uitstroom te vermijden van de overloop van de segment-kamer. Met name in deze nb+ stijgt spike-procedure de osmolaliteit van de oplossing in de zaal segment geleidelijk gedurende enkele minuten voordat de segmenten zijn teruggekeerd naar normale osmolaliteit oplossing, maar dit geen nadelige gevolgen de segment-gezondheid hebben heeft of patch-clamp opname van succes. Een hoge osmolaliteit snijden oplossing is eerder gebruikt voor veroorzaakt segment voorbereidingen om beter behouden dopamine neuronen voor patch klem opnames57,58, aldus aan te tonen dat dit tijdelijke hyperosmolality kan zinvol zijn in sommige contexten.
Door de uitvoering van een geoptimaliseerde procedure combineren de NMDG beschermende herstelmethode en geleidelijke nb+ heeft spike-in stap het nut van deze hersenen segment methodologie uitgebreid tot jonge door volwassen volwassen dier eeuwen heen. Dit bijgewerkte protocol is nu geschikt voor een breed scala van dierlijke leeftijden met behulp van een enkele optimale NMDG aCSF formulering en de procedure. Indien nodig, de nb+ spike-procedure kan worden toegepast met een geleidelijk langer vertraging en/of langzamer tijdsverloop ter verbetering van de levensvatbaarheid van de segmenten van de hersenen van oudere dieren, en we hebben verstrekt een basisgids van aanbevolen spike-in schema's volgens aan dier leeftijd (Zie tabel 2). Terwijl we een fundamenteel kader geschikt voor een breed scala aan toepassingen hebt opgegeven, kunnen aanvullende geavanceerde stappen voor verdere verbetering van de levensvatbaarheid en duurzaamheid van hersenen segmenten van veroudering en volwassen dieren worden onderzocht. Bijvoorbeeld, glutathion restauratie strategieën zijn in dit opzicht bijzonder effectief en kunnen worden toegepast zoals elders beschreven2,6.
Verbetering van de doorvoer voor de aanhouding van experimenten De analyse van de synaptische verbinding door patch klem opname is een veeleisende toepassing waarvoor uitstekende behoud van zowel de neuronale structuur en de functie met het oog op een hoge betrouwbaarheid van succes. Als het aantal neuronen worden tegelijkertijd geregistreerd stijgt lineair, de technische moeilijkheidsgraad supra-lineair omhoog gaat. Er zijn talrijke mislukking modi, en een van de meest voorkomende oorzaken van mislukkingen is het onvermogen om formulier voldoende gigaohm zeehonden op een of meer van de gerichte cellen. Dit kan dramatisch traag vooruitgang, met name wanneer drie of meer neuronen gelijktijdig moeten worden geregistreerd. Overeenstemming is met het vinden van snellere gigaohm zegel vorming tijd met de geoptimaliseerde NMDG beschermende herstelmethode, er was een aanzienlijke verbetering van het slagingspercentage en de productie van meerdere neuron patch klem opname experimenten met zowel volwassene transgene muis hersenen segmenten en segmenten van de volwassen menselijke neurochirurgische hersenen. De verbeterde efficiëntie is vrijwel zeker toe te schrijven aan zowel de snellere en betrouwbare gigaohm zegel vorming en het verbeterde neuronale behoud van de plakjes met dit protocol. Hoewel dit protocol is gericht op de voordelen expliciet voor patch-clamp opnemen toepassingen, worden vergelijkbare voordelen verwacht voor andere uitdagende experimentele toepassingen waar hersenen segment levensvatbaarheid primordiaal is.

De acute hersenen segment voorbereiding is een essentiële experimentele modelsysteem in de neurowetenschappen. Voor ongeveer de helft van een eeuw heeft dit platform dynamische functionele studies van de levende hersenen over een breed scala aan anatomische hersengebieden en diersoorten. Of de beoogde toepassing biochemie, functionele beeldvorming, morfologie of electrofysiologie is, is het van het grootste belang om optimale integriteit en de levensvatbaarheid van het gesneden weefsel. Het is daarom dat de uiterst robuuste jonge knaagdieren hersenen segment voorbereiding (d.w.z., jonger dan postnatale dag 30 voor muizen) de meest aangewezen tot nu toe is geweest. De moeilijkheid in het verkrijgen van voldoende gezonde hersenen plakjes van volwassen volwassene en veroudering van dieren heeft bewezen een formidabele uitdaging voor de meeste en ernstige beperkingen voor de studie van de functionele architectuur van de volwassen hersenen heeft opgelegd. Dit geldt met name voor patch klem opnemen, een techniek die uitstekende morfologische en functionele behoud vereist en is onmisbaar voor het karakteriseren van gedetailleerde intrinsieke en synaptische eigenschappen van geïdentificeerde één neuronen. Voor de afgelopen decennia, hebben de overgrote meerderheid van patch klem electrophysiologists vertrouwd op een 'beschermende snij'-methode met behulp van sacharose-gesubstitueerde lage nb+ aCSF1 voor het voorbereiden van gezonde hersenen segmenten van jonge, en in veel mindere mate, jonge volwassen dieren. Deze methode is gebaseerd op de vooronderstelling dat passieve nb+ -instroom en latere water ingang en cel zwelling tijdens het segment snijden stap is de overheersende belediging die leidt tot slechte voortbestaan van neuronen, met name voor die neuronen gelegen de oppervlakkige lagen die waarschijnlijk direct trauma van de blade-beweging ondersteunen. Echter, de beschermende snij-methode laat nog veel te wensen overlaat voor hersenen segment bereiding op basis van volwassen volwassen dieren ongeacht de formulering van de bijzondere aCSF geïmplementeerd.
Een eenvoudige maar effectieve oplossing voor dit probleem is beschreven van2,3,,4,,5,6 en aangeduid als de ' beschermende ' brain slice herstelmethode. De oorspronkelijke versie van deze methode gebruikt een NMDG-gesubstitueerde aCSF, zoals NMDG werd geïdentificeerd als de meest veelzijdige en effectieve onder verschillende andere kandidaat-natrium ion substituten (met inbegrip van sacharose, glycerol, choline en Tris). De formulering van de media werd verder versterkt door de toevoeging van HEPES bieden sterkere pH7buffer te weerstaan hersenen segment oedeem, evenals de toevoeging van aanvullingen op het tegengaan van de schadelijke effecten van oxidatieve stress (tabel 1). Het werd empirisch bepaald dat een eerste herstel incubatie stap in lage nb+, lage Ca2 +, en hoge Mg2 + NMDG aCSF onmiddellijk na de volwassen hersenen weefsel snijden was noodzakelijk en voldoende zijn voor neuronale verbeterd behoud over een brede waaier van hersengebieden, celtypes, en dierlijke leeftijden3,5,6.
Met name kunnen vroegere incarnaties van wat nu de beschermende herstelmethode is gesynchroniseerd worden gevonden in de literatuur1,8,9,10,11,,12, 13, hoewel de mogelijkheden voor oudere volwassene en veroudering van dierlijke hersenen segment en patch klem opname was niet herkend of aangetoond in deze eerdere werken. Bovendien blijven de genuanceerde procedurele variaties ontstaan ter ondersteuning van specifieke experimentele toepassingen4,14,15,16. Het collectieve orgaan van het werk van deze talrijke onderzoeksgroepen imparts hoog vertrouwen in de robuustheid van de beschermende herstelmethode voor verbeterde weefsel behoud. De NMDG beschermende herstelmethode is nu wijd goedgekeurd en geïmplementeerd in talrijke gepubliceerde onderzoeken met behulp van volwassen dier hersenen segment preparaten. Deze acute segment studies omvatten neocortical3,17,18, hippocampal15,19,20,21, striatale22 , 23 , 24, veroorzaakt25,26,27,28,29, en hindbrain30,31,32, 33 , 34 regio's, en diverse soorten neurotransmitter en neuromodulator met inbegrip van glutamaterge4,30, GABAergic18,20,31,35 ,36, Dopaminerge24,29,37,38, cholinerge14,37,38, 39, noradrenergic40, en serotonerge27,28 transmissie. De methode is ook geschikt voor optogenetic controle van neuronale activiteit in plakjes afgeleid van transgene dieren3,39 of na in vivo virale injecties17,27, 28,40,41,42,43, als goed zo functioneel Ca2 + beeldvorming van neuronale activiteit2,44 ,45,46. Analyses van zowel de korte termijn plasticiteit4,47,48 en de verschillende vormen van langdurige plasticiteit16,-35,48 geweest gemeld. Een recente studie toegepast de NMDG beschermende herstelmethode om uitgebreide en systematische sonderen van synaptische verbinding in de visuele cortex in volwassen volwassen muis hersenen plakjes met behulp van de octopatch configuratie49 opnemen — een krachtige demonstratie van het nut en de degelijkheid van deze methode. De beschermende herstelmethode is zelfs met succes toegepast in eerder onvoorziene experimentele contexten, zoals verbeterde behoud van therapieën en pericytes in volwassen corticale hersenen segmenten50, patch-clamp opnemen vanaf interneuron populaties in 1-1,5 jaar oud van Alzheimer muis modellen20, en een met mensenhandel assay van volwassen hersenen segment receptor51getransplanteerd.
Het volgende protocol worden stapsgewijze procedures voor de uitvoering van een geoptimaliseerde NMDG beschermende herstelmethode van hersenen segment voorbereiding ter verbetering van de levensvatbaarheid van acute hersenen segmenten beschreven. De beginselen voor betere neuronale behoud worden besproken, evenals de demonstratie van de duidelijke voordelen van deze methodologie voor complexe multi neuron patch klem opnemen van experimenten in zowel jonge volwassen transgene muis hersenen segmenten en volwassen volwassene neurochirurgische hersenen segmenten. Het volgende protocol is gevalideerd voor muizen van 21 dagen oud tot meer dan één jaar oud, ook wat betreft menselijke neurochirurgische specimens afgeleid van volwassen patiënten.

<table><tbody><tr><td>Compresstome VF-200</td><td>Precisionary Instruments</td><td>VF-200</td><td>Vibrating tissue slicer (aanbevolen)</td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>aCSF-bestanddeel</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>aCSF-bestanddeel</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>aCSF-bestanddeel</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate monobasic dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71505</td><td>aCSF-bestanddeel</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>aCSF-bestanddeel</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>aCSF-bestanddeel</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td>aCSF-bestanddeel</td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>aCSF-bestanddeel</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td>aCSF-bestanddeel</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5280</td><td>aCSF-bestanddeel</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td>aCSF-bestanddeel</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880</td><td>aCSF-bestanddeel</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoethanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td>Anesthetisch onderdeel 1</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td>Anesthetisch onderdeel 2</td></tr><tr><td>Gebogen botte pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11065-07</td><td>Hersendissectie-instrumenten</td></tr><tr><td>Fijne dissectieschaar (supercut)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Hersendissectie-instrumenten</td></tr><tr><td>Grote zware schaar 7''</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18</td><td>Hersendissectie-instrumenten</td></tr><tr><td>Metalen spatel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z511455-1PAK</td><td>Hersendissectie-instrumenten</td></tr><tr><td>Vuilnismesjes</td><td>VWR</td><td>89031-954</td><td>Hersendissectie-instrumenten</td></tr><tr><td>Brain Slice Keeper-4</td><td>Automate Scientific</td><td>S-BSK4</td><td>hersensnedehouder</td></tr><tr><td>Nylon netwerk&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td>Voor het bouwen van kleine hersnede-herstelkamers</td></tr><tr><td>Pyrex glazen bekers (250 mL)</td><td>VWR</td><td>89090-434</td><td>Voor het bouwen van kleine hersnede-herstelkamers</td></tr><tr><td>35 mm plastic schotel, rond</td><td>VWR</td><td>100488-376</td><td>Voor het bouwen van kleine hersnede-herstelkamers</td></tr><tr><td>Gas diffuser stenen (10 &micro;m)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59277</td><td>Voor constante carbogenatie (fijne bellen)</td></tr><tr><td>Agarose Type I-B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0576</td><td>Voor het inbedden van hersenspecimens</td></tr><tr><td>Micro loader tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491229</td><td>Voor het vullen van patch clamp-elektroden</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td>Voor het maken van een aangepaste dissectieschijf</td></tr><tr><td>Hydrochloorzuur&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>Voor pH-aanpassing van media</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-25G</td><td>Voor pH-aanpassing van media</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td>Voor pH-aanpassing van media</td></tr><tr><td>Kunststof overdrachtpipetten 3 mL gegradueerd</td><td>VWR</td><td>89497-676</td><td>Voor plakoverdracht</td></tr><tr><td>Zirconium keramische injectorblades</td><td>Cadence Specialty Blades</td><td>EF-INZ10</td><td>http://cadenceinc.com/</td></tr><tr><td>KG-33 borosilicaatglas capillair met filament</td><td>King Glass Company</td><td>aangepaste offerte</td><td>ID: 0.87mm, OD 1.50mm</td></tr><tr><td>Biocytine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td>Interne pipetoplossing</td></tr><tr><td>Fosfocreatine dinatrium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>Interne pipetoplossing</td></tr><tr><td>Kaliumgluconaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4500-100G</td><td>Interne pipetoplossing</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Interne pipetoplossing</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>Interne pipetoplossing</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51120</td><td>Interne pipetoplossing</td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>Interne pipetoplossing</td></tr><tr><td>Verwarmd waterbad (2.5L)</td><td>VWR</td><td>13491-060</td><td>Diverse</td></tr><tr><td>Filterpapierrondjes</td><td>VWR</td><td>28456-022</td><td>Diverse</td></tr><tr><td>Cyanoacrylaatlijm</td><td>Amazon</td><td>B000BQRBO6</td><td>Diverse</td></tr><tr><td>Glazen petrischaal</td><td>VWR</td><td>89000-326</td><td>Diverse</td></tr><tr><td>10X fosfaatgebufferd zoutoplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Diverse</td></tr><tr><td>30 mL spuiten</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td>Diverse</td></tr><tr><td>1 mL spuiten</td><td>VWR</td><td>BD-309628</td><td>Diverse</td></tr><tr><td>25 5/8 gauge naalden</td><td>VWR</td><td>89219-292</td><td>Diverse</td></tr><tr><td>Thermomixer (met 1,5 mL buisblok)</td><td>VWR</td><td>89232-908</td><td>Om agarose gesmolten te houden&nbsp;</td></tr></tbody></table>

voorbereiding van acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde n-methyl-d-glucamine beschermende herstelmethode

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Dit protocol is een praktische gids voor de N-methyl-D-glucamine (NMDG) beschermende herstelmethode van hersenen segment voorbereiding. Talrijke recente studies hebben het nut van deze methode voor het verbeteren van de neuronale behoud en algehele hersenen segment levensvatbaarheid gevalideerd. De tenuitvoerlegging van deze techniek door vroege adopters heeft vergemakkelijkt gedetailleerde onderzoeken hersenfunctie met behulp van uiteenlopende experimentele toepassingen en verspreid over een breed scala van dierlijke leeftijden, hersengebieden en celtypes. Stappen worden beschreven voor het uitvoeren van de beschermende herstel hersenen segment techniek met behulp van een geoptimaliseerde NMDG kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) media formulering en de uitgebreide procedure op betrouwbare wijze het verkrijgen van gezonde hersenen segmenten voor patch klem electrofysiologie. Met deze bijgewerkte aanpak een substantiële verbetering wordt waargenomen in de snelheid en betrouwbaarheid van gigaohm zegel formatie tijdens gerichte patch klem opname van experimenten met behoud van uitstekende neuronale behoud, teneinde uitdagende experimentele toepassingen. Representatieve resultaten zijn voorzien van multi neuron patch klem opname experimenten te assay synaptische verbinding in neocortical hersenen plakjes bereid uit jonge volwassen transgene muizen en volwassen volwassen menselijke neurochirurgische specimens. Bovendien is de geoptimaliseerde NMDG beschermende herstelmethode van het snijden van de hersenen is compatibel met zowel jonge als volwassen dieren, dus het oplossen van een beperking van de oorspronkelijke methode. Kortom, kunnen een één medium formulering en hersenen snijden procedure worden geïmplementeerd in verschillende soorten en leeftijden om uitstekende levensvatbaarheid en weefsel behoud.

Dit protocol laat zien op de uitvoering van een geoptimaliseerde N-methyl-D-glucamine (NMDG) beschermende herstelmethode van hersenen segment voorbereiding. Een formulering van één medium wordt gebruikt om op betrouwbare wijze het verkrijgen van gezonde hersenen segmenten van dieren van alle leeftijden en voor diverse experimentele toepassingen.

Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Het algemene doel van deze procedure is om gezonde hersenslices voor te bereiden van volwassen dieren die geschikt zijn voor patch clamp elektrofysiologie experimenten. Dus deze geoptimaliseerde NMDG Beschermende Herstel Methode voor hersenslice voorbereiding stelt onderzoekers in staat om de intrinsieke en synaptische eigenschappen van hersencellen te onderzoeken in vele verschillende hersengebieden en voor dieren van vrijwel elke leeftijd. Dus het belangrijkste voordeel van deze specifieke techniek is dat het mogelijk maakt om hersenslices te bereiden die een hogere mate van neuronale behoud hebben in vergelijking met eerdere methodologieën.En ook dat deze hersenslices geschikter zijn voor patch clamp opnames. Deze methode werd geoptimaliseerd voor volwassen muizenhersenweefsel. Het kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan andere soorten, inclusief neurochirurgisch verwijderd menselijk hersenweefsel.Om deze procedure te beginnen, zet de snijstatiop met de weefselsnijmachine en chirurgische instrumenten op. Bevestig een zirkonium keramische injectormes aan de mesarm met snelle kleefstof. Plaats vervolgens de monstershouder en lijn de voorste rand van het mes uit met de rand van de monstershouder.Laat een kleine opening om ervoor te zorgen dat het mes het metaal niet schraapt. Vul een 250 milliliter beker met 200 milliliter NMDG HEPES aCSF. En koel het vooraf aan op ijs met constante carbogenatie gedurende meer dan 10 minuten.Stel vervolgens de eerste hersenslice herstelkamer in door deze te vullen met 150 milliliter NMDG HEPES aCSF. En plaats de kamer in een waterbad op 32 tot 34 graden Celsius. Om een hersenslice houderkamer in te stellen, vul de reservoir met 450 milliliter HEPES aCSF en laat het opwarmen tot kamertemperatuur onder constante carbogenatie tot gebruik.Bereid vervolgens gesmolten agarose voor voor weefselinbedding door een blok van 2% agarose uit een eerder bereide schaal te snijden met behulp van de open kant van een 50 milliliter kegelvormige fles. Dek de kegelvormige fles losjes af en verwarm het vervolgens 10 tot 30 seconden in de magnetron tot de agarose begint te smelten. Oververhit niet.Pour de gesmolten agarose in 1,5 milliliter buisjes. Houd de agarose in de gesmolten toestand met behulp van een thermomixer ingesteld op 42 graden Celsius met krachtig schudden. En zorg er zorgvuldig voor dat de gesmolten agarose niet voortijdig stolt.Koel de accessoire koelblok voor de snijder op dit moment vooraf af op ijs. In deze procedure, maak een snede op de huid van het hoofd om de schedelkap bloot te leggen. Gebruik vervolgens fijne supersnijders om de huid boven de schedelkap weg te snijden.En maak kleine sneden lateraal aan beide zijden van de caudale ventrale basis van de schedel. Maak aanvullende ondiepe sneden beginnend bij de caudale dorsale aspect van de schedel in de rostrale richting omhoog de dorsale middenlijn. Zorg ervoor dat de onderliggende hersenen niet worden beschadigd.Na dat, maak een laatste T-snede loodrecht op de middenlijn op het niveau van de reukbollen. Gebruik vervolgens de ronde punttang om de schedel te grijpen beginnend bij de rostrale mediale aspect en pel in de caudale laterale richting aan één kant. Herhaal deze procedure voor de andere kant om open te kraken.En verwijder de dorsale helften van de schedelkap om de hersenen bloot te leggen. Schep voorzichtig de intacte hersenen in de beker met vooraf gekoelde NMDG HEPES aCSF. En laat de hersenen ongeveer een minuut uniform afkoelen.Gebruik nu een grote spatel om de hersenen van de beker over te brengen naar de petrischaal bedekt met filterpapier. Trim en monteer de hersenen volgens de gewenste snijshoek en gewenste hersengebied van belang. Werk snel om langdurige zuurstofgebrek tijdens de behandeling te voorkomen.Daarna bevestig de hersenblok aan de monstershouder met behulp van kleefstof. Trek het binnenste deel van de monstershouder terug om de hersenblok volledig naar binnen te trekken. Giet vervolgens de gesmolten agarose direct in de houder tot de hersenblok volledig bedekt is met agarose.Klem vervolgens het vooraf gekoelde accessoire koelblok rond de monstershouder gedurende tien seconden tot de agarose gestold is. Plaats de monstershouder in de receptak op de snijmachine en controleer de juiste uitlijning. Vul vervolgens het reservoir met de resterende vooraf gekoelde geoxideerde NMDG HEPES aCSF uit de 250 milliliter beker en plaats de bubbelsteen in het reservoir gedurende de snijduren om voldoende oxygenatie te garanderen.Stel vervolgens de micrometer in om de agarose ingebedde hersenspecimen te beginnen te laten bewegen. Start de snijder en pas de voortgangssnelheid en oscillatiefrequentie empirisch aan tot het gewenste niveau. Blijf het weefsel in stappen van 300 micrometer laten bewegen en snijden totdat het hersengebied van belang volledig is gesneden.De totale tijd voor de snijdprocedure zou minder dan 15 minuten moeten zijn. Voor initiële NMDG herstel. Na voltooiing van de snijdprocedure verzamel alle slices met behulp van een afgesneden plastic weidepijp en breng ze over in een herstelkamer van 34 graden Celsius gevuld met 150 milliliter NMDG HEPES aCSF.De timing van de acute hersenslice herstelstap is erg belangrijk om een balans te kunnen bereiken tussen morfologische behoud en de functionele herstel van de elektrofysiologische eigenschappen van elke neuron. Na het bepalen van het optimale natrium spike-in schema, volgens de leeftijd van de muis, voer de stap Y natrium spike-in procedure uit door de aangegeven volumes van natrium spike-in oplossing toe te voegen op de aangegeven tijden. Voeg de natrium spike-in oplossing direct toe in de bubbeler schoorsteen van de initiële herstelkamer om snelle menging te vergemakkelijken.Het natrium spike-in schema dat werd verstrekt met een verscheidenheid van verschillende leeftijdsbereiken is een heel goed startpunt. Maar het zou geoptimaliseerd en gebruikt moeten worden voor uw eigen specifieke experimentele ontwerp. Breng vervolgens alle slices over naar de HEPES aCSF langetermijnhouderkamer die op kamertemperatuur wordt gehouden.Laat

preparation-acute-brain-slices-using-an-optimized-n-methyl-d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video describes a protocol to obtain brain slices using an N-Methyl-D-glucamine (NMDG)-based protective recovery method. A dissected brain is incubated in an aCSF with NMDG and HEPES to minimize neuronal cell death and damage during the sectioning. The section is allowed to recover in the aCSF to restore the cellular...

Preparation of Brain Sections Using a NMDG-Based Protective Recovery Method

We beschrijven twee methoden voor visualisatie en kwantificering van dendritische arborisatie in de hippocampus van muizenmodellen: real-time en extended depth of field beeldvorming. Terwijl de eerste methode geavanceerd topografisch traceren en kwantificering van de mate van vertakking toelaat, biedt de laatste snelle visualisatie van de dendritische boom.

Beoordeling van Dendritische arborization in de gyrus dentatus van de hippocampus regio in Muizen

Dit protocol beschrijft de stabilisatie van het zuurstofgehalte in een klein volume van gerecycled buffer en methodologische aspecten van de opname van de activiteit-afhankelijke synaptische plasticiteit in verzonken acute hippocampal plakjes.

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Microglia, de resident immuuncellen van de hersenen, reageren snel met de morfologische veranderingen voor wijzigingen van hun omgeving. Dit protocol wordt beschreven hoe u twee-foton microscopie te bestuderen van de aantrekkingskracht van microglial processen naar serotonine of ATP in acute hersenen plakjes van muizen.

Twee-foton beeldvorming van Microglial processen attractie naar ATP of serotonine in Acute hersenen plakjes

Dit is een protocol voor acute slice voorbereiding van volwassen en veroudering muis hippocampi die gebruik maakt van transcardiale perfusie en slice snijden met ijskoude NMDG-aCSF om hypoxische schade aan het weefsel te verminderen. De resulterende plakjes blijven gedurende vele uren gezond en zijn geschikt voor langdurige patch-clamp en field-recordings.

Het minimaliseren van Hypoxie in Hippocampal Slices van volwassen en oudere muizen

Dit artikel is bedoeld om een systematisch protocol te beschrijven om horizontale hippocampale hersenplakken bij muizen te verkrijgen. Het doel van deze methodologie is om de integriteit van hippocampale vezelroutes te behouden, zoals het perforantpad en het bemoste vezelkanaal om deukende gyrusgerelateerde neurologische processen te beoordelen.

Horizontale Hippocampal Plakjes van de Hersenen van de Muis

We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.

Voorbereiding van acute plakjes van Dorsale Hippocampus voor hele celopname en neuronale reconstructie in de dentaat gyrus van volwassen muizen

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) wordt toegepast op beeld en analyseren van dendritische stekels in de muriene hippocampus.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) voor de studie van dendritische stekels

Hier wordt gedemonstreerd hoe een wakker gesloten-hoofdletselmodel kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de effecten van herhaald licht traumatisch hersenletsel (r-mTBI) op synaptische plasticiteit in de hippocampus. Het model repliceert belangrijke kenmerken van r-mTBI bij patiënten en wordt gebruikt in combinatie met in vitro elektrofysiologie.

Het beoordelen van veranderingen in synaptische plasticiteit met behulp van een wakker gesloten-hoofdletselmodel van mild traumatisch hersenletsel

Deze studie presenteert een protocol voor het opstellen van een zeer reproduceerbaar diermodel van hemorragische transformatie (HT) met behulp van occlusie/reperfusie van de middelste hersenslagader (MCAO/R) bij C57BL/6-muizen met acute hyperglykemie.

Een muismodel van hemorragische transformatie geïnduceerd door acute hyperglykemie in combinatie met voorbijgaande focale ischemie

Leer de geoptimaliseerde NMDG-beschermende herstelmethode voor het voorbereiden van acute hersensneden. Deze techniek verbetert de neuronale preservatie aanzienlijk voor patch-clamp elektrofysiologie bij volwassen dieren en menselijk weefsel.

Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode

Meer video's verkennen