Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode

Het algemene doel van deze procedure is om gezonde hersenslices voor te bereiden van volwassen dieren die geschikt zijn voor patch clamp elektrofysiologie experimenten. Dus deze geoptimaliseerde NMDG Beschermende Herstel Methode voor hersenslice voorbereiding stelt onderzoekers in staat om de intrinsieke en synaptische eigenschappen van hersencellen te onderzoeken in vele verschillende hersengebieden en voor dieren van vrijwel elke leeftijd. Dus het belangrijkste voordeel van deze specifieke techniek is dat het mogelijk maakt om hersenslices te bereiden die een hogere mate van neuronale behoud hebben in vergelijking met eerdere methodologieën.

En ook dat deze hersenslices geschikter zijn voor patch clamp opnames. Deze methode werd geoptimaliseerd voor volwassen muizenhersenweefsel. Het kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan andere soorten, inclusief neurochirurgisch verwijderd menselijk hersenweefsel.

Om deze procedure te beginnen, zet de snijstatiop met de weefselsnijmachine en chirurgische instrumenten op. Bevestig een zirkonium keramische injectormes aan de mesarm met snelle kleefstof. Plaats vervolgens de monstershouder en lijn de voorste rand van het mes uit met de rand van de monstershouder.

Laat een kleine opening om ervoor te zorgen dat het mes het metaal niet schraapt. Vul een 250 milliliter beker met 200 milliliter NMDG HEPES aCSF. En koel het vooraf aan op ijs met constante carbogenatie gedurende meer dan 10 minuten.

Stel vervolgens de eerste hersenslice herstelkamer in door deze te vullen met 150 milliliter NMDG HEPES aCSF. En plaats de kamer in een waterbad op 32 tot 34 graden Celsius. Om een hersenslice houderkamer in te stellen, vul de reservoir met 450 milliliter HEPES aCSF en laat het opwarmen tot kamertemperatuur onder constante carbogenatie tot gebruik.

Bereid vervolgens gesmolten agarose voor voor weefselinbedding door een blok van 2% agarose uit een eerder bereide schaal te snijden met behulp van de open kant van een 50 milliliter kegelvormige fles. Dek de kegelvormige fles losjes af en verwarm het vervolgens 10 tot 30 seconden in de magnetron tot de agarose begint te smelten. Oververhit niet.

Pour de gesmolten agarose in 1,5 milliliter buisjes. Houd de agarose in de gesmolten toestand met behulp van een thermomixer ingesteld op 42 graden Celsius met krachtig schudden. En zorg er zorgvuldig voor dat de gesmolten agarose niet voortijdig stolt.

Koel de accessoire koelblok voor de snijder op dit moment vooraf af op ijs. In deze procedure, maak een snede op de huid van het hoofd om de schedelkap bloot te leggen. Gebruik vervolgens fijne supersnijders om de huid boven de schedelkap weg te snijden.

En maak kleine sneden lateraal aan beide zijden van de caudale ventrale basis van de schedel. Maak aanvullende ondiepe sneden beginnend bij de caudale dorsale aspect van de schedel in de rostrale richting omhoog de dorsale middenlijn. Zorg ervoor dat de onderliggende hersenen niet worden beschadigd.

Na dat, maak een laatste T-snede loodrecht op de middenlijn op het niveau van de reukbollen. Gebruik vervolgens de ronde punttang om de schedel te grijpen beginnend bij de rostrale mediale aspect en pel in de caudale laterale richting aan één kant. Herhaal deze procedure voor de andere kant om open te kraken.

En verwijder de dorsale helften van de schedelkap om de hersenen bloot te leggen. Schep voorzichtig de intacte hersenen in de beker met vooraf gekoelde NMDG HEPES aCSF. En laat de hersenen ongeveer een minuut uniform afkoelen.

Gebruik nu een grote spatel om de hersenen van de beker over te brengen naar de petrischaal bedekt met filterpapier. Trim en monteer de hersenen volgens de gewenste snijshoek en gewenste hersengebied van belang. Werk snel om langdurige zuurstofgebrek tijdens de behandeling te voorkomen.

Daarna bevestig de hersenblok aan de monstershouder met behulp van kleefstof. Trek het binnenste deel van de monstershouder terug om de hersenblok volledig naar binnen te trekken. Giet vervolgens de gesmolten agarose direct in de houder tot de hersenblok volledig bedekt is met agarose.

Klem vervolgens het vooraf gekoelde accessoire koelblok rond de monstershouder gedurende tien seconden tot de agarose gestold is. Plaats de monstershouder in de receptak op de snijmachine en controleer de juiste uitlijning. Vul vervolgens het reservoir met de resterende vooraf gekoelde geoxideerde NMDG HEPES aCSF uit de 250 milliliter beker en plaats de bubbelsteen in het reservoir gedurende de snijduren om voldoende oxygenatie te garanderen.

Stel vervolgens de micrometer in om de agarose ingebedde hersenspecimen te beginnen te laten bewegen. Start de snijder en pas de voortgangssnelheid en oscillatiefrequentie empirisch aan tot het gewenste niveau. Blijf het weefsel in stappen van 300 micrometer laten bewegen en snijden totdat het hersengebied van belang volledig is gesneden.

De totale tijd voor de snijdprocedure zou minder dan 15 minuten moeten zijn. Voor initiële NMDG herstel. Na voltooiing van de snijdprocedure verzamel alle slices met behulp van een afgesneden plastic weidepijp en breng ze over in een herstelkamer van 34 graden Celsius gevuld met 150 milliliter NMDG HEPES aCSF.

De timing van de acute hersenslice herstelstap is erg belangrijk om een balans te kunnen bereiken tussen morfologische behoud en de functionele herstel van de elektrofysiologische eigenschappen van elke neuron. Na het bepalen van het optimale natrium spike-in schema, volgens de leeftijd van de muis, voer de stap Y natrium spike-in procedure uit door de aangegeven volumes van natrium spike-in oplossing toe te voegen op de aangegeven tijden. Voeg de natrium spike-in oplossing direct toe in de bubbeler schoorsteen van de initiële herstelkamer om snelle menging te vergemakkelijken.

Het natrium spike-in schema dat werd verstrekt met een verscheidenheid van verschillende leeftijdsbereiken is een heel goed startpunt. Maar het zou geoptimaliseerd en gebruikt moeten worden voor uw eigen specifieke experimentele ontwerp. Breng vervolgens alle slices over naar de HEPES aCSF langetermijnhouderkamer die op kamertemperatuur wordt gehouden.

Laat