LC-MS analyse van menselijke bloedplaatjes als een platform voor het bestuderen van mitochondriaal Metabolisme
4 april 2016
Hier laten we geïsoleerde humane bloedplaatjes kan worden gebruikt als een toegankelijke ex vivo model metabole aanpassingen studeren in reactie op de remmer complex I rotenon. Deze benadering maakt gebruik van isotopische tracering en relatieve kwantificatie door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie en kan worden toegepast op een verscheidenheid van studieopzetten.
Het algemene doel van deze procedure is om te bepalen hoe een xenobiotische behandeling of een ziektetoestand het cellulaire metabolisme verandert. Deze methode heeft het potentieel om te onthullen hoe een ziektetoestand of een toegepaste toxine het cellulaire metabolisme beïnvloedt. En zodra dit bekend is, heeft onze methode de mogelijkheid om te onthullen of een soort interventie de defect kan corrigeren.
Het grootste voordeel van deze techniek is dat het niet afhankelijk is van getransformeerde cellijnen, dus het is waarschijnlijker dat het antwoorden biedt die direct relevant zijn voor de menselijke gezondheid. Om deze procedure te beginnen, bereid een 10 millimolair voorraadoplossing van rotenon in dimethylsulfoxide voor. Voer een seriële verdunning van de 10 millimolair rotenon voorraadoplossing uit om oplossingen te verkrijgen met rotenonconcentraties variërend van één nanomolair tot 100 micromolair.
Voeg vervolgens 50 microliter van elke voorraadoplossing toe aan vijf milliliter van een eerder bereide verrijkte Tyrode's bufferoplossing om oplossingen te bereiden met rotenonconcentraties variërend van 10 picomolair tot één micromolair. Voeg 50 microliter DMSO toe aan een van de bufferoplossingsmonsters om als voertuigccontrole te dienen. Om bloedplaatjes te isoleren van vol bloed, centrifugeer vol bloedmonsters bij 175 x g gedurende 15 minuten zonder pauzes.
Wanneer u klaar bent, brengt u één milliliter van de bovenste bloedplaatjerijke plasmalaag over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Zorg ervoor dat u bij het overbrengen van het bloedplaatjerijke plasma de buffycoat niet verstoort, zodat de bloedplaatjespellet niet besmet raakt met lymfocyten. Centrifugeer de bloedplaatjerijke plasmalaag gedurende vijf minuten bij 400 x g.
Zuig vervolgens het supernatant op. Gebruik niet minder dan drie biologische replica's voor elke conditie, suspendeer de bloedplaatjespellet in één milliliter van elke eerder bereide rotenonoplossing. Incubeer vervolgens de gesuspendeerde bloedplaatjes gedurende één uur in een met water gekoelde kooldioxide-incubator ingesteld op 95% luchtvochtigheid en 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius.
Op dit punt pellet de bloedplaatjes door de monsters gedurende drie minuten bij 3000 x g te centrifugeren. Na het afzuiging van het supernatant, voegt u de geschikte stabiele isotoop-gelabelde interne standaard toe. Resuspendeer vervolgens de bloedplaatjes in 750 microliter ijskoud 10% trichloroazijnzuur.
Pulseer elke monster 30 keer met 0,5 seconde pulsen met een sonische bewerking. Na centrifugatie, bevestig C18 vaste fase extractie kolommen aan een vacuüm manifold. Conditioner de kolommen met één milliliter methanol.
Vervolgens, breng de kolommen in evenwicht met één milliliter twee keer gedistilleerd water. Laat het monster-afgeleide supernatant door de kolommen lopen. Wanneer u klaar bent, was de kolommen met één milliliter water.
Laad vervolgens 10 milliliter glazen centrifugeerbuisjes in het vacuüm manifold om de elutiefracties te verzamelen. Eluteer de kolommen met één milliliter 25 millimolair ammoniumacetaat en methanol. Na het drogen van de eluaat onder stikstofgas, resuspendeer de droge residuen in 50 microliter 5% 5-sulfosalicylzuur en breng de monsters over naar HPLC-bestanden voor analyse.
Zoals eerder gerapporteerd in SH-SY5Y-cellen, wordt verondersteld dat veranderingen in relatieve niveaus van aceyl CoA thioesters in reactie op rotenon het gevolg zijn van de remming van complex een. Specifiek, er is een dosisafhankelijke afname van succinyl CoA met een gelijktijdige toename van beta-Hydroxybutyryl-CoA, terwijl acetyl CoA-niveaus onveranderd bleven. De analyse van humane bloedplaatjes behandeld met rotenon onthult zeer consistente resultaten en biedt een unieke reeks experimentele gegevens.
Het is belangrijk op te merken dat deze waarneming de mitochondriale afhankelijkheid van de respons op rotenon onderstreept omdat bloedplaatjes geen kernen hebben. Na het volgen van deze procedure, kunnen andere methoden zoals metabolisch traceren worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: Hoe beïnvloedt deze behandeling of ziektetoestand de substraatgebruik? Als we veranderingen in de niveaus van een bepaald metaboliet identificeren, waarom verandert het dan?
Welke stappen in de route zijn beïnvloed, en op welke manier? Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u bloedplaatjes uit vol bloed kunt isoleren, de gecontroleerde ex-vivo uitdaging kunt uitvoeren en de aceyl CoA thioesters kunt extraheren voor LCMS-analyse.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert het gebruik van geïsoleerde menselijke bloedplaatjes als ex vivo-model om metabole adaptaties te onderzoeken in reactie op de complex I-remmer rotenon. De methode maakt gebruik van isotopische tracing en vloeistofchromatografie-massaspectrometrie voor relatieve kwantificering, waardoor deze toepasbaar is op diverse onderzoeksontwerpen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Cellulair metabolisme
- Farmacologie
- Relevantie voor de menselijke gezondheid
Achtergrond
- Het begrijpen van hoe xenobiotica het cellulaire metabolisme beïnvloeden is cruciaal.
- Geïsoleerde menselijke bloedplaatjes bieden een relevanter model vergeleken met getransformeerde cellijnen.
- Deze aanpak kan helpen bij het identificeren van potentiële interventies voor metabole defecten.
- Rotenon wordt gebruikt als complex I-remmer om metabole veranderingen te bestuderen.
Doel van de studie
- Om de effecten van xenobiotische behandeling op het cellulaire metabolisme te bepalen.
- Om te onderzoeken hoe ziektestaten metabole processen veranderen.
- Om het potentieel van interventies om metabole defecten te corrigeren te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een 10 millimolaire voorraadoplossing van rotenon in dimethylsulfoxide.
- Seriële verdunning van de rotenon-voorraadoplossing om variërende concentraties te verkrijgen.
- Isotopische tracering voor metabole analyse.
- Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie voor kwantificering.
Belangrijkste resultaten
- Geïsoleerde bloedplaatjes vormen een effectief model voor metabole reacties op rotenon.
- Isotopische tracering onthult significante metabole adaptaties.
- Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie maakt nauwkeurige kwantificering mogelijk.
- De methode is toepasbaar op diverse experimentele ontwerpen.
Conclusies
- Geïsoleerde menselijke bloedplaatjes zijn een waardevol model voor het bestuderen van het metabolisme.
- Deze benadering kan leiden tot inzichten in ziektefacetten en potentiële therapieën.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om andere metabole routes te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Menselijke bloedplaatjes bieden een klinisch relevant, niet-getransformeerd model voor het bestuderen van het mitochondriale metabolisme en xenobiotische effecten, waarmee de beperkingen van kankercellijnen in metabolisch onderzoek worden aangepakt. Dit platform maakt reproduceerbare, donor-specifieke analyse van veranderingen in metabole pathways mogelijk, wat bijdraagt aan targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Schaalbaarheid via bloedbankbronnen faciliteert translationele continuïteit van fundamentele ontdekking naar preklinische en klinische studies.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het onderzoeken van therapeutische hypothesen mogelijk door mitochondriële responsen op complex I-remmers zoals rotenon te analyseren.
- Operationele waarde: Biedt een menselijk relevant systeem dat storende variabelen door metabole herprogrammering in getransformeerde cellijnen vermindert.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door consistente detectie van compensatoire metabole verschuivingen, zoals een toename van vetzuuroxidatie bij remming van de glycolyse.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve LC-MS-uitlezingen van acyl-CoA-thioesters, waardoor relatieve kwantificering en isotopische markering voor de beoordeling van route-specifieke activiteit mogelijk zijn.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare metabolietprofielen over biologische replica's, wat bijdraagt aan de standaardisatie van assays voor xenobiotica-screeningcampagnes.
- Schaalbaarheid: De isolatie van bloedplaatjes van individuele donoren of uit bloedbanken maakt schaalbare productie van metabolisch actieve monsters mogelijk voor high-content screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt ex vivo bloedplaatjesresponsen met in vivo metabole adaptaties, wat bijdraagt aan preklinische validatie op basis van biomarkers.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt of de waargenomen metabole veranderingen mitochondriaal afhankelijk zijn, zoals blijkt uit de responsen in anucleaire bloedplaatjes.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt evaluatie mogelijk van de effectiviteit van interventies bij het omkeren van metabole defecten, wat beslissingsprocessen (go/no-go) tijdens de lead-optimalisatie ondersteunt.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische evaluatie, in het bijzonder voor verbindingen die op mitochondriën gericht zijn en metabole modulatoren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van xenobiotische effecten op het cellulaire metabolisme door het isoleren van bloedplaatjesresponsen op dosisafhankelijke rotenonbehandeling.
- Screening: Maakt assay-klare preparatie van bloedplaatjes voor LC-MS-analyse mogelijk, wat reproduceerbare kwantitatieve resultaten oplevert voor screening van verbindingenbibliotheken.
- Analytics: Biedt relatieve kwantificatie van acetyl-CoA, succinyl-CoA en bèta-hydroxybutyryl-CoA thioesters, waardoor vergelijking van de metabolische flux onder verschillende condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door het modelleren van metabolische adaptaties die relevant zijn voor ziektestaten en therapeutische interventies.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerde workflow voor bloedplaatjesisolatie en metabolietextractie die toepasbaar is in meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij target-validatie door gebruik te maken van een fysiologisch relevant menselijk model dat artefacten van kankercellijnen vermijdt.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor plaatjesisolatie, ex vivo challenge en metabolietenextractie.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van metabole gebreken mogelijk te maken, waardoor uitval in een laat stadium door onvoorziene mitochondriële toxiciteit wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van hun effecten op kernmetabole paden in een mensrelevant systeem.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in plaatjesisolatie, steriel handwerken met cellen en LC-MS/MS metabolomics.
- Afhankelijk van toegang tot centrifugatieapparatuur, vacuümanifolds voor vastefase-extractie en HPLC-MS-systemen.
- Vereist standaardisatie van de bereiding van bloedplaatjesrijk plasma en de rotenon-dosering tussen laboratoria en donoren.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende xenobiotica en isotopische labelingschema's.
- Beperkt door de ex vivo levensvatbaarheid van bloedplaatjes en de noodzaak voor onmiddellijke verwerking na isolatie om de metabolische integriteit te behouden.
