Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Het algemene doel van deze procedure is om circulerende microRNA's en biologische vloeistoffen, zoals plasma of serum, te kwantificeren met behulp van droplet digital PCR-technologie. De methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van de biomarkt. Door diagnostische en prognostische biomarketingkanker te identificeren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge gevoeligheid. Het kan ook worden gebruikt om de minder abundantie microRNA's te kwantificeren zonder een verwijzingsgen te vereisen. De implicatie van deze methode strekt zich uit tot kankerdiagnose omdat het de potentie heeft om mensen met vroegstadiumkanker te identificeren.

Het kan ook worden toegepast op andere ziekten zoals neurologische of hartaandoeningen. Over het algemeen moeten individuen aandacht besteden aan de manipulatie van druppels vóór de thermische cyclusstap om hun verstoring te voorkomen. Daarom is een visuele demonstratie van de druppelgeneratie van cruciaal belang omdat de druppels kunnen worden vernietigd door onzorgvuldige manipulatie of te snel pipetteren.

Begin deze procedure door plasma of serum microRNA's te isoleren. Transkribeer vervolgens achteruit en verdun ze zoals beschreven in het bijbehorende document. Verwijder de EvaGreen master mix microRNA primer set en cDNA uit de vriezer en laat ze op kamertemperatuur ontdooien.

Nadat het is ontdooid, draai de master mix tube meerdere keren om. Draai vervolgens alle reagentia naar beneden. Bereid een droplet digital of ddPCR mix werkoplossing voor volgens de instructies in het bijbehorende document.

Bereid genoeg voor tot acht monsters met een controle zonder sjabloon voor elke conditie plus een overschot van 10%. Zodra geassembleerd, meng de ddPCR mix grondig en draai hem naar beneden. Merk op dat technische replica's niet vereist zijn vanwege de hoge reproduceerbaarheid van deze technologie. Na het draaien, doseer 12 microliters van ddPCR mix in elk putje van een 96-putjes PCR-plaat.

Voeg acht microliters van verdund cDNA-sjabloon toe aan elk putje. Plaats vervolgens de druppelgenerator cartridge in de cartridgehouder. Breng voorzichtig 20 microliters van elk voorbereide monster over naar de middelste rij van de druppelgenerator cartridge.

Vermijd het introduceren van luchtbellen in de bodem van het putje. Vul elk van de olie-putjes in de onderste rij met 70 microliters druppelgeneratorolie. Haak de afdichtring over de cartridgehouder.

Plaats in de druppelgenerator en sluit het deksel om de druppelgeneratie te starten. Wanneer de druppelgeneratie is voltooid, opent u het deksel, verwijdert u de cartridge uit de druppelgenerator en verwijdert u de wegwerpafdichtring. De bovenste putjes van de cartridge bevatten de druppels.

Breng langzaam en soepel 40 microliters van elk van de acht bovenste putjes over in een enkele kolom van een 96-putjes PCR-plaat. Verzegeld de plaat onmiddellijk met folie om verdamping te voorkomen. Binnen 30 minuten na het verzegeld van de plaat, begint u met thermisch cyclus met behulp van het PCR-protocol dat in tabel drie van het bijbehorende document wordt beschreven.

Schakel de druppellezer in. Verplaats vervolgens de plaat van de thermische cycler naar de druppellezer. Plaats de 96-putjes PCR-plaat met de post-PCR druppels in de basis van de plaathouder in de druppellezer.

Plaats de bovenkant van de plaathouder op de PCR-plaat. Druk beide ontgrendelingsknoppen stevig naar beneden om de PCR-plaat in de houder te bevestigen. Start de QuantaLife software vanaf de systeempc. Klik op Instellen en open het sjabloonbestand met gegevens dat informatie bevat over de monsters, doelgenen en assays.

Selecteer vanaf de linkernavigatiebalk Uitvoeren. Er verschijnt een Uitvoeropties venster. Selecteer uit het Verfset menu EVA en klik op OK om het druppellezen te starten.

Zodra de uitvoering is voltooid, gebruikt u de 2D Amplitude plot in de analysesoftware om de positieve druppels te selecteren. Om de positieve druppels te selecteren, gebruikt u de lasso-tool vanaf de linkernavigatiebalk. Klik vervolgens op het tabblad Gebeurtenissen om het aantal positieve en totale druppels te controleren.

Een totaal aantal van 18.000 druppels wordt meestal bereikt met sondevrije ddPCR. Klik vervolgens op het tabblad Concentratie om de uiteindelijke concentratie van het monster te visualiseren. Gebruik ten slotte de Export.

CSV om de microRNA-concentratiewaarden te exporteren. De mRNA miR-181a-5p werd gekwantificeerd in twee plasmamonsters, S1 en S2, met behulp van 0,5 en één microliter primerconcentratie bij annealingatemperaturen van 58 en 60 graden Celsius. Deze figuur presenteert de kopieën van microRNA per microliter in de amplificatiereactie voor elke conditie.

PCR positieve druppels voor elk monster worden in blauw weergegeven en negatieve druppels worden in zwart weergegeven. Zoals hier te zien is, heeft het controlemonster geen positieve druppels zoals verwacht. Het uitvoeren van de PCR bij 60 graden Celsius met behulp van een 0,5 of één microliter primer resulteerde in een betere scheiding van positieve en negatieve druppels.

In deze figuur vertegenwoordigen de foutbalken het Poisson 95% betrouwbaarheidsinterval. En hier worden de aantal positieve druppels, weergegeven in blauw, vergeleken met het totale aantal druppels, weergegeven in groen. Samen genomen tonen deze gegevens aan dat de droplet digital PCR kan worden gebruikt om het absolute aantal kopieën van microRNA per microliter van een biologische vloeistof te bepalen.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben over hoe een mRNA-kwantificering te verrichten met behulp van droplet digital PCR. Eenmaal beheerst, kunnen 96 monsters in slechts enkele uren worden geanalyseerd, wat een optimale output is voor een klinische omgeving. Na elke ontwikkeling, baant deze techniek de weg naar het gebied van vloeistofbiopsie om microRNA en andere nucleïnezuren als ziekte biomarkers te verkennen.