Name: Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Leer circulerende microRNA-kwantificering met droplet digital PCR voor kankerdiagnostiek. Deze methode detecteert zeldzame microRNAs zonder referentiegen en ondersteunt vroegtijdige kankeridentificatie in plasma of serum.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door de financiering van de Italiaanse Association for Cancer Research (AIRC) naar MF (MFAG 11.676) en MN (Special Program Molecular Clinical Oncology -. 5 per mille n 9980, 2010/15) en van het Italiaanse ministerie van instructie, universiteit en onderzoek FIRB 2011 MN (Project RBAPIIBYNP).

MicroRNA isolatie uit plasma of serum Opmerking: Plasma en serum voorbereiding is een belangrijke fase in circulerende miRNA kwantificering. Er is geen voorkeurswerkwijze voor plasma en serum bereiding. Het enige belangrijke ding om te overwegen is dat alle monsters van hetzelfde experiment moet worden verwerkt met behulp van exact dezelfde workflow. Start vanaf 200 pl serum of plasma. Totaal RNA kan worden geïsoleerd uit serum of plasma met behulp van commercieel verkrijgbare kits. 1. Protocol voor Total RNA (inclusief miRNA) Isolatie <ol><li> Dooi serum / plasma monsters op ijs. </li><li> Voeg 1 ml Lysis Reagent (bijv., QIAzol) aan 200 gl serum / plasma. </li><li> Door vortexen gemengd en plaats de buis met het homogenaat op de bank bij kamertemperatuur 5 minuten. </li><li> Voeg 3 ul van een 4,16 nM oplossing van het synthetische miRNA cel-miR-39-3p van C. elegans. </li><li> Voeg 200 pl chloroform. Schud de buis krachtig gedurende 15 seconden. plaats the buis op de bank bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. </li><li> Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C om de fasen scheiding te verkrijgen: de bovenste waterfase RNA. </li><li> Breng de waterige fase naar een nieuwe buis, ongeveer 700 pl, overdracht van enige witte interfase materiaal te voorkomen. </li><li> Voeg 1 ml 100% ethanol en mengen door omkeren. </li><li> Pipet up 700 pl monster in een mini spinkolom geplaatst op een 2 ml verzamelbuis. Sluit het deksel en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 15 sec. Gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Herhaal deze stap met behulp van de resterende monster. </li><li> Voeg 700 ul Buffer RWT de mini centrifugeerkolom, sluit het deksel en centrifugeer 15 sec bij 12.000 xg om de kolom te wassen. Gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Pipet 500 pi Buffer RPE in de mini spin-kolom. Sluit het deksel en centrifugeer 15 sec bij 12.000 tpm. Gooi het doorstroomkanaal. Herhaal deze stap opnieuw. </li><li> Centrifugeer de mini spinkolom op volle snelheid gedurende 2 minuten om de spinkolom droogmembraan van resterende ethanol. </li><li> Breng de mini spinkolom een ​​nieuwe 1,5 ml verzamelbuis en pipet 35 gl RNase-vrij water op het membraan van de kolom. </li><li> Centrifugeer 1 min bij 12.000 xg om het RNA te elueren. </li><li> Bewaar het RNA bij -80 ° C. Opmerking: Aangezien RNA-concentratie niet nauwkeurig kan worden bepaald, gebruik vast volumes als maat voor input bedrag. </li></ol> 2. MicroRNA reverse transcriptie <ol><li> Ontdooi de reverse transcriptie (RT) reagens mix componenten: 5x reactie buffer, nuclease-vrij water. Meng voorzichtig omkeren van de buizen en leg ze op ijs. Vlak voor het gebruik, verwijder het enzym mix uit de vriezer en plaats op ijs. Spin down alle reagentia. </li><li> Bereid het RT reagens in ijs zoals beschreven in Tabel 1. Bereid ten minste 10% overschrijden mix. </li><li> Meng de reactie door pipetteren, en dan spin down. </li><li> Incubeer gedurende 60 minuten bij 42 ° C. </li><li> Hitte-inactiveren de reverse transcriptase gedurende 5 minuten bij 95 ° C. </li><li> Onmiddellijk afkoelen tot 4 ° C. </li><li> Bewaar de cDNA bij -20 ° C. </li></ol> 3. cDNA Verwatering <ol><li> Verdunnen de hoeveelheid cDNA template die nodig zijn voor de geplande ddPCR reacties in nuclease vrij water. Verdun de cDNA reactie tussen 1:50 en 1: 500 in water, afhankelijk van de doelgroep miRNA overvloed. Bewaar de verdunde cDNA bij -20 ° C. Het verdunde cDNA bleek stabiel te zijn gedurende ten minste 3 maanden bij -20 ° C. </li></ol> 4. Droplet Generation en PCR Opmerking: Druppeltje generatie moet worden uitgevoerd op 8 monsters tegelijk. Technische replicaten zijn niet verplicht, vanwege de hoge reproduceerbaarheid van deze technologie 12,15 .A templateloze Control (NTC) monster moet worden uitgevoerd in elke plaat en voor elke verschillende ddPCR staat. <ol><li> Ontdooi en evenwicht van de master mix (bijv., EvaGreen Master Mix), microRNA primer set en cDNA bij RT. </li><li> Meng de Master Mix thoroughly door het buisje meerdere malen. Spin down alle reagentia. </li><li> Bereid de ddPCR mix zoals beschreven in Tabel 2. Wanneer meerdere ddPCR reacties worden uitgevoerd, stelt een ddPCR mix werkende oplossing. Maak minstens 10% meer dan mix. </li><li> Als alles in elkaar, meng en spin down de ddPCR mix. </li><li> Doseer 12 pi ddPCR mengen in een 96-well PCR plaat of PCR-buizen. </li><li> Voeg 8 ul van verdund cDNA template aan elke buis / well. </li><li> Steek de druppel generator cartridge in de houder. </li><li> Overdracht 20 ul van elk bereid monster tot monster putjes (middelste rij) van de druppel generator cartridge voorzichtig met vermijding van luchtbellen aan de bodem van de put. </li><li> Vul elke oliebron (onderste rij) met 70 pi druppel generator olie. </li><li> Haak de pakking over de patroonhouder en in te voegen in de druppel generator. </li><li> Sluit het deksel druppel generatie volgens gaan pr fabrikantotocol. Wanneer druppel generatie klaar is, opent u het deksel, verwijder de wegwerp pakking. Boven putjes van de cassette bevatten de druppeltjes. </li><li> Pipet langzaam en vloeiend 40 pl van de inhoud van de acht bovenste putjes (de druppeltjes) in één kolom van een 96-well PCR plaat. </li><li> Sluit de PCR-plaat met folie onmiddellijk na de overdracht van druppeltjes om verdamping te voorkomen. Gebruik doorboren is folie plaat afdichtingen die compatibel zijn met de naalden in de druppel lezer zijn. </li><li> Begin thermische fietsen (PCR) binnen 30 minuten van het afdichten van de plaat. </li><li> Voer de fietsen protocol volgens tabel 3. </li></ol> 5. Droplet Reading <ol><li> Schakel de druppel lezer. </li><li> Beweeg de plaat uit de PCR-apparaat aan de druppel lezer. </li><li> Plaats de 96-well PCR plaat met de post-PCR druppeltjes in de basis van de plaathouder. </li><li> Plaats de bovenkant van de plaathouder op de plaat PCR. Druk stevig op beide ontgrendelingslipjestot aan de PCR-plaat in de houder te verzekeren. </li><li> Start de software van het systeem PC. <ol><li> Klik op Instellingen om het experiment (Absolute kwantificering) te definiëren en klik vervolgens op Uitvoeren om de druppel lezen te starten. </li><li> Wanneer druppel lezen is voltooid, klikt u op &quot;Analyze&quot; knop om te openen en de gegevens te analyseren. </li><li> Gebruik de 2D-amplitude plot in de analyse software om de positieve druppeltjes (lasso tool) (Figuur 1B) te selecteren. </li><li> Gebruik het tabblad Events om het aantal positieve en de totale druppeltjes te controleren. Een totaal aantal van 18.000 - 21.000 druppels wordt meestal bereikt met tijdbasis ddPCR. </li><li> Zodra de positieve druppels worden geselecteerd, de uitvoer van de miRNA concentratie waarden met behulp van de optie export CSV uit het tabblad Concentratie. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Braicu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+divine+messengers%3A+are+they+the+Hermes+of+modern+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology.</a> Cell Death Differ. 22, 34-45 (2015).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Guay, C., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+novel+biomarkers+for+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 9, 513-521 (2013).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11, 145-156 (2014).</li>
<li>Moldovan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J Cell Mol Med. 18, 371-390 (2014).</li>
<li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+Using+Circulating+miRNAs+as+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Challenges in Using Circulating miRNAs as Cancer Biomarkers.</a> Biomed Res Int. 2015, 731479(2015).</li>
<li>Jarry, J., Schadendorf, D., Greenwood, C., Spatz, A., van Kempen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+validity+of+circulating+microRNAs+in+oncology%3A+five+years+of+challenges+and+contradictions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges and contradictions.</a> Mol Oncol. 8, 819-829 (2014).</li>
<li>Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+MicroRNA+Biomarker+Studies%3A+Pitfalls+and+Potential+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating MicroRNA Biomarker Studies: Pitfalls and Potential Solutions.</a> Clin Chem. 61, 56-63 (2015).</li>
<li>Miotto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Circulating+miRNAs+by+Droplet+Digital+PCR%3A+Comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-Based+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Quantification of Circulating miRNAs by Droplet Digital PCR: Comparison of EvaGreen- and TaqMan-Based Chemistries.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23, 2638-2642 (2014).</li>
<li>Ferracin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+cell-free+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomarker Research. , (2015).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nat Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11, 809-815 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Circulerende miRNAs aanwezig zijn in bloed bij extreem lage concentraties en de hoeveelheid RNA die kunnen worden geëxtraheerd uit plasma en serum monsters is laag. Daarom zijn ze moeilijk te kwantificeren met andere technieken zoals microarray en RNA sequentie. Bovendien is er een algemeen gebrek aan overeenstemming over gegevensnormalisatie en de aanwezigheid van endogeen &quot;referentie&quot; miRNAs in het bloed. In dit verband is een gevoelige techniek zoals druppeltje digitale PCR, staat het tellen van het aantal ...

MicroRNA's (miRNA's) worden door mogelijk alle cellen van het organisme vrijgegeven in de bloedcirculatie, als gevolg van actieve afgifte of necrotische en apoptotische processen. Celvrije miRNA's zijn gedetecteerd in de bloedbaan, hetzij als vrije stabiele moleculen of gebonden aan lipoproteïnen of omgeven in exosomen en microvesikels 1-3. Men gelooft dat ze functioneren als cel-tot-cel communicatoren 4, en hun hoeveelheid verandert in aanwezigheid van kanker, hartaandoeningen of auto-immuunziekten 5-7. Hun nauwkeurige en reproduceerbare kwantificering is de basis voor hun evaluatie als ziektebiomarkers. Echter, om verschillende redenen die elders al zijn beschreven 8,9, kan miRNA-kwantificering in serum of plasma, evenals andere lichaamsvloeistoffen, erg uitdagend zijn 10,11. We hebben onlangs een methode ontwikkeld voor de absolute kwantificering van circulerende miRNA's, gebaseerd op miRNA-specifieke LNA-primers en DNA-bindend kleurstof druppel digitale PCR (ddPCR) technologie 12. Deze methodologie is toegepast op de validatie van miRNA borstkanker biomarkers 13,14.
Na de verdeling van elk omgekeerd getranscribeerd miRNA-molecuul in een nanoliter-grootte druppel, is het mogelijk om het kopienummer van elk miRNA in elk monster te tellen, door in wezen het aantal groene, en dus positieve, fluorescente druppels te tellen. Zodra een PCR-reactie plaatsvindt, wordt een positieve telling bereikt, zonder de noodzaak om een standaardcurve vast te stellen of rekening te houden met de PCR-efficiëntie in de berekening van de doelhoeveelheid, zoals het gebeurt met kwantitatieve RT-PCR (RT-qPCR). Bovendien bleek ddPCR gevoeliger en nauwkeuriger te zijn dan RT-qPCR bij de kwantificering van circulerende miRNA's 15. In dit artikel presenteren we het gedetailleerde protocol van deze methodologie, waarbij de meest relevante stappen worden besproken en specifiek serum en plasma klinische monsters worden overwogen.

<table><tbody><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Kolommen voor totale RNA, inclusief miRNA, extractie uit serum/plasma</td></tr><tr><td>100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom</td><td>Sequentie: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG</td></tr><tr><td>Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td>Kit voor microRNA reverse transcriptie</td></tr><tr><td>MicroRNA LNA PCR primer set&nbsp;</td><td>Exiqon</td><td>204000-206xxx en 2100000-21xxxxx</td><td>Primers voor miRNA amplificatie binnen druppels</td></tr><tr><td>QX200 druppel generator</td><td>BioRad</td><td>186-4002</td><td>Instrument gebruikt voor het lezen van druppels</td></tr><tr><td>QX200 druppel lezer</td><td>BioRad</td><td>186-4003</td><td>Instrument gebruikt voor het genereren van druppels</td></tr><tr><td>QuantaSoft software</td><td>BioRad</td><td>186-3007</td><td>Software voor gegevensverzameling en analyse</td></tr><tr><td>PX1 PCR plaat sealer</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td>Plaat sealer</td></tr><tr><td>DG8 druppel generator cartridges en pakkingen</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td>Cartridges gebruikt om monster en olie te mengen om druppels te genereren</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen supermix</td><td>BioRad</td><td>186-4033/36</td><td>PCR supermix</td></tr><tr><td>QX200 druppel generator olie voor EvaGreen kleurstof</td><td>BioRad</td><td>186-4005</td><td>Olie voor druppelgeneratie</td></tr></tbody></table>

circulerende microrna kwantificering met behulp van dna-bindende dye chemistry and droplet digital pcr

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulerende (celvrij) microRNA&#39;s (miRNA&#39;s) zijn vrijgemaakt uit cellen in de bloedbaan. De hoeveelheid specifieke miRNA bij de omloop is gekoppeld aan een ziektetoestand en heeft het potentieel om te worden gebruikt als biomarker ziekte. Een gevoelige en nauwkeurige methode voor het circuleren van microRNA kwantificering met behulp van een op kleurstoffen gebaseerde chemie en druppeltje digitale PCR-technologie is onlangs ontwikkeld. Specifiek met behulp Locked Nucleic Acid (LNA) -gebaseerde miRNA-specifieke primers met een groen fluorescerend DNA-bindende kleurstof in een compatibel digitaal druppeltje PCR systeem is het mogelijk om de absolute kwantificering van specifieke miRNAs verkrijgen. Hier wordt beschreven hoe het uitvoeren van deze techniek om miRNA hoeveelheid in biologische vloeistoffen, zoals plasma en serum beoordelen, is haalbaar en effectief.

De absolute hoeveelheid specifieke miRNAs per ml plasma of serum kunnen worden bepaald met een groene fluorescerende DNA-bindende kleurstof en druppeltje digitale PCR techniek. Figuur 1 toont het proces van positieve-druppeltjes selectie, waarbij de uiteindelijke miRNA concentratie bepaalt (kopieën / pl ) in de amplificatiereactie berekend met de analysesoftware. De hoeveelheid van elk miRNA in het bloed zeer verschillend, waarbij sommige species miRNA overvloediger dan ...

Er wordt een gevoelige en nauwkeurige methode beschreven voor de kwantificering van celvrije microRNA's met behulp van een kleurstof-gebaseerde chemie en druppel digitale PCR-technologie.

Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van circulerende microRNA's in biologische vloeistoffen, zoals plasma of serum, met behulp van droplet digital PCR-technologie. De methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen binnen het veld van biomarkers, door het identificeren van diagnostische en prognostische biomarkers voor kanker.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge sensitiviteit. Het kan worden gebruikt om ook minder abundante microRNA's te kwantificeren zonder dat hiervoor een endogeen referentiegen vereist is. De implicaties van deze methode strekken zich uit tot de cancerdiagnostiek, omdat het de potentie heeft om personen met kanker in een vroeg stadium te identificeren.Het kan ook worden toegepast op andere ziekten, zoals neurologische of cardiale aandoeningen. Over het algemeen moeten personen aandacht besteden aan de manipulatie van de druppeltjes vóór de thermische cyclusering om disruptie te voorkomen. Daarom is een visuele demonstratie van de generatie van druppeltjes cruciaal, aangezien de druppeltjes kunnen worden vernietigd door onvoorzichtige manipulatie of te snel pipetteren.Begin deze procedure door microRNA's uit plasma of serum te isoleren. Voer vervolgens de reverse transcriptie en verdunning uit zoals beschreven in het bijbehorende document. Haal de EvaGreen master mix microRNA-primer set en het cDNA uit de vriezer en laat deze ontdooien bij kamertemperatuur.Nadat het is ontdooid, wordt de buis met de mastermix meerdere keren omgekeerd. Centrifugeer vervolgens alle reagentia kort. Bereid een werkoplossing van de droplet digital, of ddPCR-mix, volgens de instructies in het bijbehorende document.Bereid voldoende mengsel voor voor maximaal acht monsters met een controle zonder template voor elke conditie, plus een overschot van 10%. Zodra het mengsel is samengesteld, moet de ddPCR-mix grondig worden gemengd en gecentrifugeerd. Let op dat technische replica's niet nodig zijn vanwege de hoge reproduceerbaarheid van deze technologie. Verdeel na het centrifugeren 12 µL van de ddPCR-mix over elke put van een 96-well PCR-plaat.Voeg acht µL verdunde cDNA-template toe aan elke put. Plaats vervolgens de cartridge van de druppelgenerator in de cartridgehouder. Breng vervolgens zorgvuldig 20 µL van elk voorbereid monster over naar de middelste rij van de cartridge van de druppelgenerator.Voorkom dat er luchtbellen onderin de put terechtkomen. Vul elke olieput in de onderste rij met 70 µL droplet generator olie. Bevestig de pakking over de houder van de cartridges.Plaats in de druppelgenerator en sluit het deksel om de druppelgeneratie te starten. Wanneer de druppelgeneratie is voltooid, opent u het deksel, verwijdert u de cartridge uit de druppelgenerator en verwijdert u de wegwerppakking. De bovenste putjes van de cartridge bevatten de druppels.Breng langzaam en gelijkmatig 40 µL vanuit elk van de acht bovenste putjes over naar één enkele kolom van een 96-putjes PCR-plaat. Seal de plaat onmiddellijk met folie om verdamping te voorkomen. Start binnen 30 minuten na het sealen van de plaat met de thermische cycli volgens het PCR-protocol dat beschreven staat in tabel drie van het bijbehorende document.Zet de dropletreader aan. Verplaats vervolgens de plaat van de thermocycler naar de dropletreader. Plaats de PCR-plaat met 96 putjes die de post-PCR-druppels bevat in de basis van de plaathouder in de dropletreader.Plaats de bovenkant van de platenhouder op de PCR-plaat. Druk beide ontgrendelingspalen stevig naar beneden om de PCR-plaat in de houder te fixeren. Start de QuantaLife-software vanaf de pc van het systeem. Klik op Setup en open het sjabloongegevensbestand dat informatie bevat over de monsters, doelgenen en assays.Selecteer Run in de navigatiebalk aan de linkerkant. Er verschijnt een venster met Run Options. Selecteer EVA in het menu Dye Set en klik op OK om de droplet-meting te starten.Zodra de run is voltooid, gebruikt u de 2D-amplitudeplot in de analysesoftware om de positieve druppels te selecteren. Gebruik hiervoor het lasso-instrument in de navigatiebalk aan de linkerzijde. Klik vervolgens op het tabblad Events om het aantal positieve en totale druppels te controleren.Met sonde-vrije ddPCR wordt gewoonlijk een totaal aantal van 18 000 druppels bereikt. Klik vervolgens op het tabblad Concentration om de uiteindelijke concentratie van het monster te visualiseren. Gebruik tot slot Export.CSV om de microRNA-concentratiewaarden te exporteren. Het mRNA miR-181a-5p werd gekwantificeerd in twee plasmaproeven, S1 en S2, met een primerconcentratie van 0,5 en één microliter bij annealing-temperaturen van 58 en 60 °C. Deze figuur toont het aantal kopieën microRNA per microliter in de amplificatiereactie voor elke conditie.PCR-positieve druppels voor elk monster worden in het blauw weergegeven en negatieve druppels in het zwart. Zoals hier te zien is, heeft het controlemonster geen positieve druppels, zoals verwacht. Het uitvoeren van de PCR bij 60 °C met gebruik van 0.5 of 1 µL primer resulteerde in een betere scheiding van positieve en negatieve druppels.In deze figuur geven de foutenbalken het Poisson 95% betrouwbaarheidsinterval weer. Hier worden het aantal positieve druppels, in het blauw weergegeven, vergeleken met het totale aantal druppels, weergegeven in het groen. Samen tonen deze gegevens aan dat droplet digital PCR gebruikt kan worden om het absolute aantal kopieën van microRNA per microliter van een biologisch vloeistof te bepalen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een mRNA-kwantificering uitvoert met behulp van droplet digital PCR. Eenmaal beheerst kunnen 96 monsters in slechts enkele uren worden geanalyseerd, wat een optimale output is voor een klinische setting. Na elke verdere ontwikkeling plaveit deze techniek de weg naar het veld van de vloeibare biopsie om microRNA en andere nucleïnezuren als ziektebiomarkers te onderzoeken.

circulating-microrna-quantification-using-dna-binding-dye-chemistry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

In this video, we present a step-by-step procedure to generate emulsified nano-droplets to detect target nucleic acids by digital polymerase chain reaction or dPCR.

Droplet Digital Polymerase Chain Reaction: A Method to Generate Nanodroplet PCR Reactions for Detecting Rare Tumor Mutations

In this video, we demonstrate the duplex digital PCR (ddPCR) technique — a modification of the traditional PCR technique that is useful in detecting two different genetic markers simultaneously. A single PCR reaction is partitioned into nanoliter-sized emulsified droplets that are independently amplified, and the detection of differently colored fluorescence amplification signals from the fraction of droplets is used to compute the initial concentration of the target sequences.

Duplex Digital PCR for Simultaneous Quantification of Dual Genetic Markers

MicroRNA's (miRNA's) zijn een wijdverspreid geconserveerde klasse van regulerende moleculen. Hier beschrijven we een miRNA-kloonmethode die afhankelijk is van twee krachtige ligatiefasen gevolgd door high-throughput sequencing. Onze methode maakt nauwkeurige genoom-wide kwantificering van miRNA's mogelijk.

Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing

Circulerende microRNAs zijn onlangs naar voren gekomen als veelbelovend en nieuwe biomarkers voor verschillende vormen van kanker en andere ziekten. Het doel van dit artikel is om drie verschillende probes gebaseerde real-time PCR-platforms en methoden die beschikbaar zijn om te kwantificeren en te bepalen de overvloed aan circulerende microRNAs zijn te bespreken.

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

We beschrijven een digitale eindpuntassay voor het kwantificeren van nucleïnezuren met een vereenvoudigde (analoge) uitlezing. We meten bulkfluorescentie van druppelgebaseerde digitale assays met behulp van een standaard qPCR-machine in plaats van gespecialiseerde instrumenten en bevestigen onze resultaten door middel van microscopie.

Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen

Dit verslag beschrijft een protocol voor het meten van de absolute niveaus van plasma miRNA, kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie PCR gebruiken met of zonder voorafgaande versterking. Dit protocol biedt een beter begrip van de hoeveelheid plasma miRNAs en laat de kwalitatieve beoordeling van de bijbehorende gegevens uit verschillende studies of laboratoria.

Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR

Circulerende microRNAs is gebleken belofte als biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen en acuut myocardiaal infarcten. In deze studie beschrijven we een protocol voor extractie van miRNA, omgekeerde transcriptie en digitale PCR voor de absolute kwantificering van miRNAs in het serum van patiënten met hart-en vaatziekten.

Digitale PCR voor het kwantificeren van de circulerende MicroRNAs in acuut myocardinfarct en hart-en vaatziekten

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Hier presenteren we een protocol voor het meten van absolute mitochondriale (mt) DNA-kopienummer en mtDNA-deletie heteroplasmieniveaus in enkele cellen.

Het meten van eencellig mitochondriaal DNA-kopienummer en heteroplasmie met behulp van digitale druppelpolymerasekettingreactie

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde methode van digitale druppel PCR (dd-PCR) voor nauwkeurige kwantificering van circulaire RNA (circRNA) niveaus in cellen met behulp van divergente primers.

Kwantificering van circulaire RNA's met behulp van digitale druppel-PCR

Leer circulerende microRNA-kwantificering met droplet digital PCR voor kankerdiagnostiek. Deze methode detecteert zeldzame microRNAs zonder referentiegen en ondersteunt vroegtijdige kankeridentificatie in plasma of serum.

Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Meer video's verkennen