Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

Het algemene doel van dit protocol is om een eenvoudige procedure te bieden om de relatieve abundantie van histon post-translationele modificaties te beoordelen, die essentiële rollen spelen in de chromatinebiologie, zoals regulering van genregulatie en chromosoomcondensatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van chromatinebiologie. Bijvoorbeeld, welke histonmodificaties veranderen hun relatieve abundantie bij stimulatie of behandeling van bepaalde cellen of weefsels.

Het grootste voordeel van deze techniek is dat we, door gebruik te maken van massaspectrometrie-gebaseerde proteomics, tegelijkertijd de meeste bekende PTM's op bekende eiwitten kunnen kwantificeren in een enkele analyse. Histonmodificatie-analyse heeft tal van toepassingen, waaronder het schatten van epigenetische veranderingen en chromatinewerking van individuen of modelsystemen na behandeling met geneesmiddelen of stress. Naast Simone zullen twee andere leden van mijn laboratorium de procedures van dit protocol demonstreren.

Natarajan Bhanu, een onderzoeksspecialist, en Kelly Karch, een afstudeerstudent. Zoals te zien is in deze workflow, is dit een 10-stappenprotocol dat histonzuivering uit celculturen of weefsels omvat, histonderivatisatie, vertering en ontzouting, en massaspectrometrie-analyse met behulp van nanoflow vloeistofchromatografie. Alleen geselecteerde procedures worden in deze video gedemonstreerd.

Om de procedure voor het isoleren van kernen uit intacte cellen te starten, ontdooi op ijs cellen die eerder werden geoogst en bewaard bij min 80 graden Celsius. En bereid de kernisolatiebuffer, of NIB, voor zoals beschreven in de protocoltekst. Verwijder een vijfde volume NIB en voeg NP-40 Alternative toe tot een eindconcentratie van 0,2%. Het resterende viervijfde volume wordt gebruikt voor wasbeurten.

Was de celpellet met NIB zonder NP-40 Alternative, met een 1:10 verhouding van celpelletvolume tot buffervolume. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 700 RCF en verwijder de supernatant. Lyseer de celpellet door deze op ijs te plaatsen en NIB met 0,2%NP-40 Alternative toe te voegen met een 1:10 verhouding van celpelletvolume tot buffervolume.

Homogeniseer de cellen door voorzichtig te pipetteren. Incubeer de gehomogeniseerde cellen op ijs gedurende vijf tot 10 minuten om de cellen te lyseren en de kernen vrij te maken. Centrifugeer gedurende vijf tot 10 minuten bij 1000 RCF en op vier graden Celsius.

De pellet zal voornamelijk celkernen bevatten, terwijl de supernatant voornamelijk cytoplasmatische componenten zal bevatten. Bewaar de cytoplasmatische fractie indien gewenst. Was de kernenpellet door deze voorzichtig te resuspenderen in NIB zonder NP-40 Alternative, met een 1:10 verhouding van pelletvolume tot buffervolume.

Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1000 RCF en op vier graden Celsius, en verwijder de supernatant. Nadat NP-40 Alternative volledig uit de kernenpellet is verwijderd, voeg ijskoud 0,2 molair zwavelzuur toe in een 1:5 verhouding van kernenvolume tot zwavelzuurvolume. Resuspendeer de kernen in het zwavelzuur door voorzichtig te pipetteren.

Incubeer het monster met constante rotatie, of zacht schudden gedurende twee tot vier uur op vier graden Celsius. Centrifugeer vervolgens het monster bij 3400 RCF op vier graden Celsius gedurende vijf minuten en breng de supernatant over naar een nieuwe buis. Centrifugeer opnieuw en breng de supernatant over naar een nieuwe buis om eventueel onoplosbaar materiaal te verwijderen.

Om de histonen te precipiteren, voegt u gekoeld, 100% trichloroazijnzuur, of TCA, toe aan het verzamelde supernatant in een verhouding van 1:3 volume. De aanwezigheid van histonen wordt aangegeven doordat het monster troebel wordt. Meng door de buis een paar keer om te draaien.

Incubeer het mengsel op ijs gedurende minimaal een uur. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 3400 RCF. Na centrifugatie zullen de histonen de zijden van de buis bedekken en ook op de bodem afzetten.

Er zal zich ook een witte, onoplosbare pellet vormen op de bodem van de buis, die voornamelijk niet-histon-eiwitten en andere biomoleculen bevat. Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie, zonder de zijden van de buis of de pellet op de bodem van de buis te schrapen. Met behulp van een glazen Pasteur-pipet spoelt u de buis met 100% ijskoud aceton plus 0,1% zoutzuur, zodat de geprecipiteerde eiwitten die de zijden en de bodem bedekken, worden bedekt.

Centrifugeer gedurende twee minuten bij 3400 RCF. Aspiseer het supernatant voorzichtig, zonder de zijden of de pellet te schrapen. Spoel de buis met 100% ijskoud aceton, centrifugeer opnieuw en verwijder het supernatant zonder de zijden of de pellet te schrapen.

Vervolgens wordt histonkwantificering en zuiverheidsanalyse uitgevoerd zoals beschreven in de protocoltekst. Een optionele fractionering van histonvarianten door omgekeerde fase HPLC kan ook worden uitgevoerd vóór histonderivatisatie. Begin deze procedure door de histonmonsters op te lossen in 40 microliter 50 millimolair ammoniumbicarbonaat, pH 8,0.

Controleer de pH door een P10 pipettetip in het monster te steken zonder aspiratie en de pipettetip aan een pH-indicatorstrip te raken. Gebruik ammoniumhydroxide en mierenzuur om de pH op 8,0 aan te passen. Vanaf nu moeten alle stappen waarbij propioniezuuranhydride wordt gebruikt, in een afzuigpunt worden uitgevoerd.

Verwerk maximaal drie tot vier monsters tegelijk om propioniezuuranhydride reactief te houden. Bereid vers propionyleringsreagens voor door propioniezuuranhydride met acetonitril te mengen in een volumeverhouding van 1:3. Voeg het propionyleringsreagens toe aan elk monster in een volumeverhouding van 1:4.

Voeg snel ammoniumhydroxide toe om de pH 8,0 in de oplossing te herstellen. Meestal is het toevoegen van ammoniumhydroxide aan het monster met een volumeverhouding van 1:5 geschikt om de pH 8,0 te herstellen. Meng onmiddellijk door te vortexen.

Controleer de pH. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Nadat alle monsters propionylering hebben ondergaan, droog de monsters tot 10 tot 20 microliter in een vacuümconcentrator.

Resuspendeer of verdun monsters met ddH20 tot