Name: Antilichaam bindende specificiteit voor Kappa (VK-) lichte keten bevattende de Mens (IgM) antilichamen: Polysialic Acid (PSA) Gehecht aan NCAM als Case Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Leer hoe u antigeen-eiwitten identificeert voor therapeutische IgM-antilichamen met immunoprecipitatie en Western blotting. Deze methode opent nieuwe mogelijkheden voor immunotherapie en biomarkeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 en R21 NS073684), de National Science Foundation (LOOPBAAN Award), de Minnesota Partnership Award voor Biotechnologie en Medische Genomics, de National Multiple Sclerosis Society (CA1060A) , en de Mayo Clinic Centrum voor Klinische en Translationeel Science (CCATS). De auteurs erkennen de steun van de Applebaum, Hilton, Peterson en Sanford Foundations, de Maan en Marilyn Park Directorship Fonds en de familie McNeilus.

Patenten voor antilichamen die remyelinering en hersenherstel bevorderen, worden uitgegeven en zijn eigendom van Mayo Clinic. Auteurs hebben een potentieel belangenconflict.

Menselijke natuurlijke IgM auto-antilichamen zijn aantrekkelijk kandidaten voor immuuntherapie en therapeutisch potentieel voor de behandeling van diverse ziekten waaronder kanker en CZS 1-7 geïllustreerd. Met voordeel zullen deze antilichamen geen immuunrespons waarbij het opwekken van neutraliserende antilichamen in hoofdzaak effectieve therapeutische dosis en werkzaamheid vermindert wekken. Belangrijk is dat alle antilichamen met therapeutische potentie van het IgM isotype zijn en behoren tot de NAb repertoire 3-5,8,9,37,40,42-45. Een belangrijke hindernis voor de potentiële klinische toepassing van IgM antilichamen het identificeren van de antigenen, die onbepaald vaak. Standaardtechnieken toegepast voor IgG antilichamen zijn vaak niet op een IgM het antigeen te identificeren. Dit protocol beschrijft de identificatie van PSA-NCAM als antigeen voor de regeneratieve humaan IgM-antilichaam HIgM12, in diermodellenMS en ALS 15-18. De gebruikte methode is vooral van toepassing op alle humane antilichamen met specifieke VK-lichte ketens VκI, VκIII en VκIV en muis antilichamen met VκI lichte ketens, ongeacht isotype van het antilichaam. De meest kritische stap in dit protocol is het gebruik van IgM antilichamen in affiniteitschromatografie toepassingen. Meer in het bijzonder, zijn succesvol antilichamen nodig om op te treden als pull-down agenten in immunoprecipitaties te isoleren of om een ​​antigeen te verrijken uit complexe weefsel- of celcultuur lysaten. Verrijkte fracties antigeen kan worden vergeleken met immunoprecipitaties van isotype controle antilichamen en vervolgens geanalyseerd op verschillen door massaspectrometrie. Een essentiële voorwaarde of beperking van deze stap is de aanwezigheid van het juiste antilichaam VK-lichte keten en gastheer (mens, muis) antilichaam in staat te binden aan eiwit L agarose. Gebruik van mannan-bindend eiwit gebonden aan agarose (ook called mannose-bindend lectine) in plaats van eiwit L agarose is een potentieel alternatief voor IgM&#39;s immunologisch zonder specifieke VK-lichte ketens. Echter, zoals door Arnold et al. 35, antigeen IgM-antilichamen niet binden aan mannan-bindend eiwit, als het doel glycan lijken ontoegankelijk wordt wanneer het IgM is gebonden aan het antigeen ervan. Op basis van deze bevindingen mannan-bindend eiwit kan niet worden gebruikt als een bindende matrix immunoprecipiteren antigengeladen IgM moleculen 35. Andere mogelijke alternatieven kan het gebruik van secundaire-agarose gebonden anti-IgM IgG-antilichamen 46,47 of het gebruik van oppervlakte geactiveerde magnetische korrels 48 worden. IgG antilichamen tegen IgM kan chemisch verknoopt agarose A of G agarose om de omvang van geëlueerde antilichaam verminderen samen met het antigeen van belang. Een goede vergelijking tussen verschillende varianten van IgM immunoprecipitatie met betrekking tot succes geïdentificeerde proteïnes iis moeilijk omdat de meeste immunoprecipitaties werden uitgevoerd om te isoleren of afbrekende IgM&#39;s zonder verdere interesse in hun antigenen. Daarnaast werden immunoprecipitaties gebruik IgM hoofdzakelijk gebruikt om een reeds bekende of verwachte blootstelling enkel antigeen antilichaam tegen gezuiverde antigenen 49 te bevestigen. Een nadeel van agarose-gekoppelde IgG&#39;s gericht tegen humaan IgM is een zeer lage opbrengst (10-15%) van immunogeprecipiteerd serum IgM-moleculen in vergelijking met het uitgangsmateriaal 50. Daarentegen werden oppervlak-geactiveerde magnetische korrels met succes toegepast om antilichamen van verschillende isotypen waaronder IgM naar scrapie associated fibrils 48 immunoprecipitatie. Deze methode is niet beperkt tot specifieke kappa (VK-) of lambda (λ) ketens of een bepaalde gastheer en kan het spectrum van IgM antilichamen die in hoofdzaak immunoprecipitaties verbreden. Een andere belangrijke stap in het protocol is het vermogen van het antilichaam om te functioneren als een detecterende antilichaam (primair antilichaam) in Western blots of andere screening platforms. Succesvolle antilichamen moeten hun antigeen gericht met voldoende hoge affiniteit om antigeen binding in aanwezigheid van niet-ionische of mogelijk ionische detergentia. Antilichamen met hoge affiniteit komen veel voor bij-affiniteit gerijpt IgG antilichamen, maar minder vaak tussen antilichamen van het IgM isotype, wat een van de redenen waarom er relatief weinig in de handel verkrijgbaar IgM antilichamen detecteren agenten in biochemische instellingen. Hoge affiniteit binden van antilichamen is een vereiste voor immunoprecipitaties moleculaire antigenen en Western blotting. Het verlagen van detergent concentraties of het volledig ontbreken van wasmiddelen in IP buffers en lysis buffers laat antigen gericht door lage affiniteit antilichamen via de Fab-domein. Daarentegen wordt het vermogen van het antilichaam om doeleiwit L agarose via het Fc gedeelte niet wezenlijk beïnvloed bij isotype controles op een aantal verschillende detergens concentraties. De lage detergens concentratie in lysisbuffer en IP buffer voorkomt celmembraan verstoring en isolatie van specifieke moleculen. Ook een lage detergens concentratie Western blot wasbuffers (bijvoorbeeld PBS-T) maakt antigeenbindend lage affiniteit antilichamen maar tegelijkertijd neemt aspecifieke binding en is dus geen optie. De aanwezigheid van een antigeen eiwitkern is een eis voor deze methode. Eiwitten met posttranslationele modificaties (bijvoorbeeld, glycoproteïnen, lipoproteïnen) en ongemodificeerde eiwit, maar niet uitsluitend lipiden of koolhydraten, detecteerbaar in Western blots. Het is niet mogelijk om lipiden (bijvoorbeeld sfingolipiden) uit weefsel of immunoprecipitatie van cellysaten in aanwezigheid of afwezigheid van detergentia. De fysicochemische eigenschappen van detergentia en lipiden te lijken op selectieve lipide-antilichaam interacties mogelijk, terwijl tegelijkertijd wasmiddelen essentieel te verstorenmembranen om selectieve isolatie van specifieke moleculen toelaten. Naar ons beste weten, immunoprecipitaties uitsluitend bestaande uit koolhydraten, in afwezigheid van een eiwitkern, zijn niet eerder beschreven. Dit is bijzonder relevant omdat dikwijls IgM-antilichamen gericht koolhydraten en glycolipiden, die niet noodzakelijk in verband met een eiwit unit. Andere chromatografische technieken vereist voor de scheiding en immunologische identificatie van lipiden en koolhydraten in de afwezigheid van een eiwitkern. Zo kan dunnelaagchromatografie (TLC) van cellulaire lipiden latere detectie van antistoffen op de TLC plaat (immuno-TLC) uitgevoerd 51,52. Andere anti-PSA-antilichamen zijn beschreven in eerdere studies en resultaten vergeleken met HIgM12 en in de handel verkrijgbare anti-PSA IgM (kloon 2-2B). De meest gebruikte antilichaam in het gebied van de PSA een IgG-antilichaam (kloon 735) beschikbaar als muis monoclonal of konijn polyklonaal antilichaam 53. Deze anti-PSA-antilichaam IgG gedetecteerd PSA op SynCAM en NCAM verschillende neuronale celtypen zoals microgliacellen 41. In tegenstelling tot de anti-PSA-antilichaam IgG, humane IgM antilichamen HIgM12, HIgM42 en de anti-PSA-muis IgM (kloon 2-2B) zijn niet PSA richten op SynCAM (maar NCAM) bij verschillende embryonale en vroege postnatale fase in muizen , terwijl niet-polysialylated SynCAM gemakkelijk detecteerbaar 15. De IgM-antilichamen die ook niet kunnen PSA te detecteren op microgliacellen (figuren 3 + 4). Een mogelijke verklaring voor verschillen waargenomen tussen antilichaam isotypes kunnen lage PSA-SynCAM niveaus vergeleken met niveaus van PSA-NCAM combinatie met de potentieel lagere affiniteit binding van IgM-antilichamen in vergelijking met de anti-PSA IgG. Om deze hypothese te testen, voerden wij immunoprecipitaties in NCAM KO dieren bij embryonaal stadium E17 met enorme hoeveelheden SynCAM heden en gebruikt HIgM12 als een &quot;pull-down-middel&quot; &lt;sup&gt; 15. In E17 WT littermate controls HIgM12 immunogeprecipiteerd PSA-NCAM in een mate die vergelijkbaar intensiteiten van &quot;afgebroken&quot; PSA-NCAM opzichte van de IgM zware keten gedetecteerd door densitometrie van Western blot latere gebruik geëlueerd antigenen vertoonden. Dit resultaat suggereerde ten minste een voldoende affiniteit van HIgM12 om zijn doel PSA. In tegenstelling tot WT hetzelfde nest bestuurt HIgM12 niet PSA in NCAM KO dieren verbonden SynCAM detecteren. Identieke resultaten werden verkregen in immunoprecipitaties met het menselijke anti-PSA IgM HIgM42. HIgM12 en HIgM42, en de muizen anti-PSA IgM (kloon 2-2B) konden richten op PSA SynCAM in Western blots van WT en NCAM KO dieren in embryonale en postnatale ontwikkelingsstadia. Gezien de geringe hoeveelheid benodigde HIgM12 (0,1 ug / ml) specifiek detecteren PSA in Western blots gebruik van kleine hoeveelheden van CZS-weefsel (0,1 pg per putje CZS) verbonden NCAM 15 lijkt het onwaarschijnlijk dat lage affiniteiten alleen wordenbelast absoluut geen PSA-SynCAM detectie door HIgM12 drie verschillende methodes. We concluderen dat er significante verschillen tussen de anti-PSA-antilichamen IgM en de vaak gepubliceerde anti-PSA-IgG-antilichaam (kloon 735). Het is niet duidelijk waarom de handel verkrijgbare anti-PSA-antilichamen IgM niet vaker gebruikt in het verleden verkregen met antiPSA IgG antilichaam 735. Dit is met name interessant omdat HIgM12 al werkzaamheid aangetoond in diverse ziektemodellen bevestigen. Terwijl andere anti-PSA IgM antilichamen vergelijkbare therapeutische effecten kan hebben het blijft onduidelijk of de anti-PSA IgG-antilichaam (kloon 735) heeft een vergelijkbare therapeutische resultaat in modellen van MS en ALS. In het kort werden hier beschreven methoden voornamelijk gebruikt om het antigeen van de regeneratieve menselijke antilichaam HIgM12 potentiële klinische trials voor MS en mogelijk andere neurodegeneratieve ziekten ondersteunen identificeren. De identificatie van de mierigens op antilichamen met biologische activiteit is als essentiële stap om hun werkingsmechanisme begrijpen. Dit is bijzonder relevant in de context van een groot aantal monoklonale antilichamen momenteel getest op veiligheid en werkzaamheid bij humane proeven. Terwijl het aantal klinisch getest IgM-antilichamen tot nu toe is klein, recente vooruitgang in hybridoma technologie voor een groeiend aantal studies over het therapeutische potentieel van deze antilichaamklasse 1-10,37,40,42-45 dringt de ontwikkeling van nieuwe of gewijzigde methoden van toepassing op niet-eiwit IgM antigenen te identificeren.

Antilichamen van de IgM isotype tonen groot therapeutisch potentieel voor de behandeling van diverse ziekten waaronder kanker en aandoeningen van het CZS 1-7. De Vollmers &#39;groep welke verschillende antilichamen in kankerpatiënten voor potentieel gebruik als tumor-specifieke biomarkers of actieve therapeutische middelen die kunnen kwaadaardige cellen te doden door het induceren apoptoseroutes 4,8,9 zijn. Interessant alle geïdentificeerde antilichamen met therapeutische potentie zijn de IgM isotype en behoren tot de groep van &quot;natuurlijke auto-antilichamen&quot; (NAbs). Ook de Rodriguez groep welke muis en humane antilichamen die remyelinisatie stimuleren chronisch gedemyeliniseerde ruggenmergletsels in modellen van multiple sclerose (MS). Identiek aan antilichamen met anti-kanker effecten, alle remyelinisatie bevorderen antilichamen NAbs en de IgM isotype 1,6,7,10. De precieze antigenen voor de meeste geïdentificeerde IgM&#39;s zijn nog steeds undetermined met inbegrip van de mens-remyelination bevorderen antilichaam rHIgM22, momenteel in Fase I klinische studies voor MS-patiënten 11. Ondanks herhaalde pogingen door deskundigen op het gebied van vetten en koolhydraten onderzoek, zowel in de academische setting en in samenwerking met de industrie 11, probeert te identificeren rHIgM22&#39;s antigen zijn niet succesvol geweest. Het falen van standaard technieken voor antigenen van IgG-antilichamen te identificeren met IgM antilichamen identificeert een absolute noodzaak om specifieke werkwijzen voor deze antilichamen die waarschijnlijk doelwit koolhydraat of lipide antigenen verfijnen. De focus van dit manuscript is de menselijke regeneratieve antilichaam HIgM12 en de experimentele procedures gebruikt om zijn antigeen te identificeren. HIgM12 antilichaam werd geïdentificeerd uit patiënten met macroglobulinemie Waldenström, stimuleert neurietuitgroei in vitro 12-14 en doelen polysialic acid (PSA) gekoppeld aan de neurale cel adhesiemolecuul (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 verlengt levensduur in een muismodel van ALS 17 en verbetert de functionele uitkomst in Theiler&#39;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) geïnfecteerde muizen. Concreet HIgM12 stimuleert spontane horizontale en verticale motorische activiteit bij chronisch gedemyeliniseerde muizen en verhoogt het aantal kleine en middelgrote diameter ruggenmerg axonen acht weken na een eenmalige, lage dosis intraperitoneaal geïnjecteerd antilichaam 18. De neurale cel adhesiemolecuul (NCAM) is een glycoproteïne van de immunoglobuline (Ig) superfamilie tot expressie gebracht op het celoppervlak van neuronen, glia, skeletspier en natuurlijke killer cellen 19-25. De drie belangrijkste NCAM isovormen genoemd NCAM180, NCAM140 en NCAM120, alternatieve splice varianten van een primair transcript die alleen verschillen in hun cytoplasmatische domein. In het CZS, NCAM de belangrijkste polysialylated molecuul (&gt; 95%) met lange, negatief geladen siaalzuur homopolymeren. Polysialic eencid met n&gt; 10 wordt genoemd PSA maar korter oligomere structuren bestaan ​​die ook biologisch relevant. Andere polysialylated eiwitten tot expressie gebracht in het centrale zenuwstelsel zijn SynCAM1 26, neuropiline-2 (NHP-2) 27,28 en een natrium kanaal subunit 25 (zie voor een overzicht 29). De hier beschreven methoden toe antigeen identificatie van mens en muis immunoglobulinen met specifieke kappa (VK-) lichte ketens (VκI, VκIII of VκIV lichte ketens voor menselijke antilichamen en VκI lichte ketens voor muizen antilichamen), ongeacht isotype van het antilichaam (bijvoorbeeld IgG, IgM , IgA, IgD of IgE). Deze beperking is van het gebruik van proteïne L agarose voor immunoprecipitaties met antilichamen van het IgM isotype. Alternatieve strategieën kunnen omvatten mannose bindende lectines en secundaire IgG anti-IgM-antilichamen covalent gebonden aan kralen agarose, die de toepasbaarheid van deze werkwijze kan worden uitgebreid tot meer IgM antilichamen incLuding mensen met een lambda (λ) lichte ketens (zie bespreking). Verhoudingen van serum IgM VK-lichte ketens vergeleken met IgM λ lichte ketens afkomstig van gezonde individuen zijn 1,5: 1 30. Op basis van de chromatografische methode hier gebruikt scheiden, verrijken en immunologisch detecteren bepaalde moleculen 31 zijn alle antigenen moeten ten minste een kleine eiwitdomein omvatten. Specifieke binding epitoop van het antilichaam kan binnen of buiten het eiwitdomein (bijvoorbeeld in glycoproteïnen, lipoproteïnen). Initial biochemische stappen gebruikt om de specifieke antigeen identificeren HIgM12, respectievelijk om een ​​beperking van de lijst van potentiële kandidaten, zijn de meest cruciale stappen in deze methode. celtype specifieke preparaten en cel morfologie gebaseerde karakteriseringen worden beschreven gliacellen maar deze werkwijze kan worden geëxtrapoleerd naar andere celtypen binnen of buiten het CZS tegemoet. Er is een dringendemoeten nieuwe of gewijzigde technieken toepasbaar voor het toenemende aantal IgM antilichamen met therapeutische potentie voor andere menselijke ziekten met name in die gevallen (de meeste antigenen IgM) wanneer het antilichaam doelen koolhydraat of lipide structuren.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-013-CVRF</td><td>Hoge glucose, met glutamine, met natriumpyrovaat, 500 ml</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml, L-glutamine, natriumpyrovaat, hoge glucose</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml, 100 ml</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>serumvrij, 10 ml</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Steriele water voor irrigatie</td><td>Baxter Healthcare</td><td>#2F7114</td><td>USP-1.000 ml, 12/CA</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P7886-50MG</td><td>D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys &middot; xHBr, moleculair gewicht 30.000-70.000 g/mol, 50 mg</td></tr><tr><td>bovine serumalbumine fractie V</td><td>Sigma</td><td>A-3294-100G</td><td>hitteshockfractie, proteasevrij, pH 7,&nbsp; zuiverheid 98%, 100 g</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td>C6H12O6, moleculair gewicht: 180,16 g/mol, ACS reagens, 500 g</td></tr><tr><td>Trypsine uit runderpancreas</td><td>Sigma</td><td>T9935-100mg</td><td>vrijwel zout-vrij, gelyofiliseerd poeder, 9.000 BAEE eenheden/mg proteïne</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I uit runderpancreas</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td>Type IV, gelyofiliseerd poeder, 2.000 Kunitz eenheden/mg proteïne</td></tr><tr><td>Recombinant Rat FGF basic Protein</td><td>R&amp;D systems</td><td>3339-FB-025</td><td>BSA als dragereiwit, 25 &#181;g, gelyofiliseerd, > 95%, 16,2 kDa</td></tr><tr><td>Recombinant Rat PDGF-AA Protein</td><td>R&amp;D systems</td><td>1055-AA-50</td><td>zonder dragereiwit, 50 &#181;g, gelyofiliseerd, > 97%, E. coli-afgeleid, 12,5 kDa</td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td>500 ml, Geen Glutamine, Geen Asparaginezuur, Geen Glutaminezuur</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>kristallijn, 1 kg, reagenskwaliteit, moleculair gewicht 30,03 g/mol (als monomeer)</td></tr><tr><td>Tris[hydroxymethyl]aminomethaan (Tris bas</td><td>Biorad</td><td>#1610719</td><td>1 kg, 99,8% zuiver, poeder</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>Biorad</td><td>#1610302</td><td>1 kg, poeder</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-381-5</td><td>C2H5NO2, moleculair gewicht: 75,07 g/mol, wit kristallijn poeder, 5 kg</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>NaCl, moleculair gewicht: 58,44 g/mol, 5 kg</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma</td><td>S0751-500G</td><td>NaH2PO4, moleculair gewicht: 119,98 g/mol, 500 g</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde oplossing 1x (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-040-CV</td><td>Zonder calcium en magnesium, 6 x 500 ml</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm TC-behandelde celcultuurschaal</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#353002</td><td>60 mm celcultuurschaal, TC-behandeld polystyreen, 20/verpakking, sterieel</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm x 15 mm Petri-schaal</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#351007</td><td>Niet TC-behandelde bacteriologische Petri-schaal, 20/verpakking</td></tr><tr><td>6 wel celcultuurplaten</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3516</td><td>6 wel, platte bodem (Afzonderlijk verpakt), gamma-bestraald, groeigebied 9,5 c</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; weefselcultuurflacon</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430720U</td><td>75 cm&sup2; U-vormige hoekige hals celcultuurflasco met Plug Seal-dop</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Protein L Plus Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#20520</td><td>2 ml, verknoopt 6% korrelvormig agarose (CL-6B), bindcapaciteit: 10 tot 20 mg IgG</td></tr><tr><td>4 - 20% Mini-PROTEAN TGX voorgevormd gel</td><td>Biorad</td><td>456-1094</td><td>10-wel, 50 &micro;l, voor gebruik met Mini-PROTEAN elektroforesecellen</td></tr><tr><td>Immobilon-P Membraan</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF, 0,45 &micro;m, 26,5 cm x 3,75 m rol</td></tr><tr><td>Anti-Polysialic Acid-NCAM Antilichaam, klon</td><td>Millipore</td><td>MAB5324</td><td>50 microliter, Gastheer: muis, monoklonaal IgM</td></tr><tr><td>4x Laemmli-monsterbuffer</td><td>Biorad</td><td>#1610747</td><td>10 ml, 4x voorgemengde eiwitmonsterbuffer</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Biorad</td><td>#1610710</td><td>25 ml, 98% zuiver, 14,2 M</td></tr><tr><td>Endoneuraminidase-N (Endo-N)</td><td>ABC Scientific</td><td>ABC0020</td><td>50 microliter, 200 &micro;g/ml, 3.500 U/mg</td></tr><tr><td>25 mm glazen dekpotten</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Kringen nr. 1; Dikte: 0,13 tot 0,17 mm; Maat: 25 mm</td></tr><tr><td>HEPES-bufferoplossing</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>100 ml, 1 M</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-022-CV</td><td>50

antilichaam bindende specificiteit voor kappa (vk-) lichte keten bevattende de mens (igm) antilichamen: polysialic acid (psa) gehecht aan ncam als case study

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Antilichamen van het IgM-isotype worden vaak verwaarloosd als potentiële therapieën in menselijke onderzoeken, diermodellen van menselijke ziekten, evenals detectiemiddelen in standaard laboratoriumtechnieken. In tegenstelling hiermee hebben verschillende humane IgM's bewijs van werkzaamheid aangetoond in kankermodellen en modellen van CNS-stoornissen, waaronder multiple sclerose (MS) en amyotrofische laterale sclerose (ALS). Redenen voor hun gebrek aan overweging omvatten moeilijkheden om IgM-antilichamen tot expressie te brengen, te zuiveren en te stabiliseren, uitdagingen om (niet-eiwit) antigenen te identificeren, lage affiniteitsbinding en fundamentele kennisgaten in koolhydraat- en lipidenonderzoek. 
Dit manuscript gebruikt HIgM12 als voorbeeld om een gedetailleerd protocol te bieden om antigenen te detecteren door Western blotting, immunoprecipitatie en immunocytochemie. HIgM12 richt zich op polysialische zuur (PSA) dat is bevestigd aan het neurale celadhesiemolecuul (NCAM). Vroeg postnataal muizenhersenweefsel van wild type (WT) en NCAM knockout (KO) muizen die de drie belangrijkste centrale zenuwstelsel (CZS)-splicevarianten NCAM180, 140 en 120 missen, werd gebruikt om de belangrijkheid van NCAM voor binding aan HIgM12 te evalueren. Verdere enzymatische vertering van CZS-weefsel en gekweekte CZS-cellen met behulp van endoneuraminidases leidde ons tot de identificatie van PSA als het specifieke bindingsepitop voor HIgM12.

In dit gedeelte worden voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen door het bestuderen van humaan IgM-specifieke PSA-antigenen in het CNS. Het gebruik van menselijke IgM antilichamen met specifieke VK-lichte ketens in biochemische instellingen en door tl-immunocytochemie wordt getoond. HIgM12 immunoprecipitaten zijn antigeen van cerebrale hersenen lysaten en fungeert als detectiemiddel (primair antilichaam) in Western blots. Noch isotype controle antilichaam of L agarose korrels immunoprecipitatie eenzelfde antigeen, die de specificiteit van het pull down (figuur 1) toont. Western blots met behulp CNS lysaten van WT en NCAM KO muizen tonen de specificiteit van binding aan HIgM12-PSA-NCAM bevattende (Figuur 2A). Enzymatische vertering van CZS-weefsel van WT-muizen gebruikt ENDO-NF identificeert PSA verbonden NCAM het specifiek bindende epitoop voor HIgM12 (Figuur 2B). Met de werkwijze die hierin beschreven worden IBA-1-positieve rat microgliale kweken van hoge zuiverheid verkregen (figuur 3). Commercieel beschikbare anti-PSA antilichaam (kloon 2-2B) niet labelen celoppervlak of inwendige PSA pools in vaste en gepermeabiliseerd IBA-1-positieve microglia cellen door fluorescentie microscopie. In overeenstemming met eerder gepubliceerde literatuur, die geen celoppervlak expressie van PSA-NCAM in microglia 16,41 HIgM12 niet celoppervlak antigenen in gezuiverde rat microglia label verslagen. Interessant HIgM12 etikettering van vaste en gepermeabiliseerd microglia resulteert in een intracellulaire, perinucleair patroon dat niet is beperkt tot specifieke organellen (figuur 3). De resultaten zijn in tegenstelling met die verkregen onder toepassing van een anti-PSA-IgG-antilichaam (kloon 735) 26 die PSA-SynCAM richt in microglia op het niveau van het Golgi 41. In tegenstelling tot microglia, HIgM12en A2B5 doelceloppervlak antigenen sterk verrijkt rat OPC kweken onder omstandigheden levende cellen (figuur 4). OPC kweken bevatten ~ 5% contaminerende microgliacellen. Figuur 5 toont een nagenoeg identieke cel-oppervlak kleurpatroon tussen HIgM12 en anti-PSA mAb (kloon 2-2B) in GFAP-positieve astrocyten (Figuur 5A). Immunofluorescente etikettering van ENDO-NF-gedigereerde WT astrocyten vergeleken met controle behandelde WT astrocyten buffer gebruikt HIgM12 toont de aanwezigheid van astrocytaire PSA (figuur 5B). De aanwezigheid van PSA-positieve astrocyten in vivo nog moet worden bevestigd. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig1.jpg" /> Figuur 1: HIgM12 fungeert als een &quot;pull-down&quot; Agent in Immunoprecipitaties Immunoprecipitaties van totale brein lysaat van drie maanden oude muizen met behulp van HIgM12, menselijke isotype controle HIgM.126 of agarose L kralen alleen als &quot;pull down&quot; agenten. Geëlueerde eiwitten werden uitgevoerd in Western blots met membranen gesondeerd tegen HIgM12. Molecuulgewichten geëlueerde eiwitten van HIgM12 beklede korrels waren in het bereik van 160-200 kDa naast de IgM zware keten (~ 65-73 kDa). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van J. Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig2.jpg" /> Figuur 2: HIgM12 Doelen de Polysialic Acid (PSA) groep aan NCAM. A. Brain homogenaten van P7, P13, P16 en P27 NCAM totaal KO muizen en heterozygote littermate controles werden uitgevoerd in Western blots met membranen gesondeerd tegen HIgM12, PSA en β-actine als het laden van controle. <strong&gt; B. 10 ug volwassen WT muizenhersenen lysaat in 1% NP40 in PBS, pH 6,5 werd behandeld met endoneuraminidase N (endo-N) (exo) neuraminidase met α2-3 polysialic zuur polymeer specificiteit (Sialidase) of PBS overnacht bij 37 ºC, draaien als wambuizen in Western blots en onderzocht tegen HIgM12, PSA en β-actine als het laden van controle. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van J. Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig3.jpg" /> Figuur 3: De afwezigheid van PSA op Rat Microglia wordt weerspiegeld door een gebrek aan HIgM12 Labeling Rat microglia werden gekweekt gedurende 48 uur op poly-D-lysine gecoate dekglaasjes en ofwel live-gelabeld op ijs met HIgM12 of na fixatie met HIgM12 of anti. -PSA mAb (kloon 2-2B). Cellen werden triple gelabeld met microglia marker IBA-1 (groen), HIgM12 / PSA (rood) en DAPI (blauw). Afbeeldingen uitwijzen dat de microgliale celoppervlakbinding behulp HIgM12 (bovenste rij) en het gebrek aan anti-PSA binding (kloon 2-2B) aan het celoppervlak en de interne opslag in primaire rat microglia (onderste rij). Op basis van de bipolaire morfologie en afwezigheid van IBA-1 kleuring, werd de kleine PSA-positieve cel (onderste rij) stelde voor om een ​​OPC zijn. In vaste cellen, HIgM12 kleuring resulteerde in een punctated, perinucleaire patroon dat niet is beperkt tot specifieke organellen en werd beschouwd als niet-specifieke binding (middelste rij). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig4.jpg" /> Figuur 4: HIgM12 Doelen celoppervlak PSA-NCAM op Rat Rat OPC OPC&#39;s en microglia waren cultu.rood voor 4 dagen in de proliferatie medium op poly-D-lysine gecoat glas dekglaasjes en driedubbele live-gelabeld op ijs met HIgM12 of A2B5 (groen), interne macrofaag / monocyt marker CD68 (kloon ED-1) (rood) en DAPI (blauw) . Beelden tonen celpopulaties majorly positief voor OPC marker A2B5 (bovenste rij) en HIgM12 (onderste rij) met weinig CD68-positieve microglia (~ 5%). Fase contrast en DAPI afbeeldingen werden toegevoegd aan de cel integriteit en mobiele nummers voor elke populatie te onthullen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig5.jpg" /> Figuur 5: HIgM12 en anti-PSA mAb co-label een astrocyten subpopulaties in muis Mixed Glia. A. Mouse gemengde gliacellen van WT en NCAM totaal KO dieren die astrocyten, oligodendrocyt-lineage cellen en microglia werden gekweekt gedurende 3 dagen en live gelabeld op ijs met HIgM12 (groen), anti-PSA mAb (kloon 2-2B) (rood) en vervolgens gedurende astrocytaire marker GFAP (paars) en DAPI (blauw). HIgM12 en anti-PSA blijkt dat er een virtueel identieke kleurpatroon op GFAP-positieve astrocyten WT maar gebrek aan binding aan gekweekte astrocyten van NCAM knock-out muizen. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van J. Neurochem. 15. B. gemengde glia gelijk werden gekweekt zoals beschreven onder A. en overnacht behandeld met endoneuraminidase-NF (vriendelijk verschaft door Dr. Martina Muehlenhoff) of PBS controle. De cellen werden live-gelabeld op ijs met HIgM12 (groen) en vervolgens gekleurd voor interne markers GFAP (rood) en DAPI (blauw). HIgM12 richt celoppervlak antigenen op PBS-controle behandelde gemengde gliale culturen, maar niet endoneuraminidase-NF behandeld gemengde glia. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van JNSCI 16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig5large.jpg" target="_blank">Pl</a>verlichten klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Alle beelden werden genomen bij 60X vergroting met behulp van hetzelfde instrument instellingen en op identieke wijze verwerkt. <img alt="tafel 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139table1.jpg" /> Tabel 1:. Buffer en Solution Recipes <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/Table1.xls">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> CNS weefsel </td><td> ENDO-NF / PBS </td><td> lysisbuffer </td><td> Totale volume </td></tr><tr><td> 1. WT muis </td><td> 67 g (0,45 ui) </td><td> 2 pi (12 ug) ENDO-NF </td><td> 7.55 ul </td><td> 10 gl </td></tr><tr><td> 2. WT muis </td><td> 67 g (0,45 ui) </td><td> 2 pl PBS </td><td> 7.55 ul </td><td> 10 gl </td></tr><tr><td> 3. WT muis </td><td> 67 g (0,45 ui) </td><td> geen PBS of ENDO-NF </td><td> 9.55 ul </td><td> 10 gl </td></tr><tr><td> 4. NCAM KO muis </td><td> 67 g (0,45 ui) </td><td> 2 pi (12 ug) ENDO-NF </td><td> 7.55 ul </td><td> 10 gl </td></tr><tr><td> 5. NCAM KO muis </td><td> 67 g (0,45 ui) </td><td> 2 pl PBS </td><td> 7.55 ul </td><td> 10 gl </td></tr><tr><td> 6. NCAM KO muis </td><td> 67 g (0,45 ui) </td><td> geen PBS of ENDO-NF </td><td> 9.55 ul </td><td> 10 gl </td></tr></tbody></table> Tabel 2: ENDO-NF digestie van CZS-weefsel van WT en P7 NCAM KO muizen.

We presenteren een protocol om eiwitdeeltjes te identificeren die antigenen bevatten voor menselijke en muis IgM-antilichamen met specifieke kappa (Vκ) lichte ketens. Dit protocol is niet beperkt tot IgM-klasse antilichamen, maar is van toepassing op alle immunoglobuline isotypes die hun antigeen met voldoende hoge affiniteit targeten tijdens immunoprecipitaties.

Antilichaam bindende specificiteit voor Kappa (VK-) lichte keten bevattende de Mens (IgM) antilichamen: Polysialic Acid (PSA) Gehecht aan NCAM als Case Study

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van antigenen voor antilichamen met therapeutisch potentieel, met een focus op het IgM-isotype. Deze methode vult een kennishiaat in het biomedische veld en kan helpen bij het identificeren van nieuwe biomarkers en immunotherapeutische middelen voor kankeronderzoek en ziekten van het centrale zenuwstelsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de deur opent naar een verwaarloosde klasse antilichamen met een groot therapeutisch potentieel.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose en behandeling van alle ziekten die kunnen worden aangepakt met antilichaamgebaseerde therapieën. Deze methode kan inzicht bieden in antigenen van IgM-antilichamen en groeiend weefsel en subculturen. Het kan ook worden toegepast op andere antilichaam-isotypes van alle soorten.Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik merkte dat de IgM-antilichamen een specifieke en prominente binding vertoonden in verschillende biochemische toepassingen. Robert Kahoud en Jens Watzlawik zullen de procedure demonstreren. Om met deze procedure te beginnen, maakt u een incisie in de schedel aan de voorzijde ter hoogte van het oor en pelt u de schedel terug.Plaats de hersenen vervolgens voorzichtig in een buis van 15 milliliter en bewaar deze onmiddellijk op droogijs. Na vijf minuten wordt de hersenen overgebracht naar een schoon weegpapiertje, waarna het cerebellum en de hersenstam snel worden verwijderd met een schoon scheermesje. Weeg daarna de bevroren cerebrum voordat deze wordt teruggeplaatst in de buis van 15 milliliter op ijs.Voeg ijskoud lysisbuffer toe tot een eindconcentratie van 150 micrograms hersenweefsel per microliter lysisbuffer. Homogeniseer vervolgens de hersenen in lysisbuffer door trituratie met een pipetteertip van één milliliter, gevolgd door trituratie met een spuit van vijf milliliter voorzien van een naald van 27 gauge. Incubeer het hersenlysaat daarna nog 30 minuten op ijs om volledige weefsellysis mogelijk te maken.Verwijder na 30 minuten het detergent, onoplosbaar materiaal en hersenlipiden door middel van seriële centrifugatie. Gooi het pellet dat myeline en celresten bevat weg, maar behoud het supernatant na elke centrifugatiestap. Verdeel het hersenlysaat in aliquoten en bewaar deze bij 80 °C.Bereid in deze stap 200 milliliters IP-buffer met BSA en nog eens 200 milliliters IP-buffer zonder BSA. Breng voor de immunoprecipitatiereactie 100 microliters Protein L agarose-suspensie over in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Voeg één milliliter IP-buffer met BSA toe aan het buisje.Meng het vervolgens handmatig door omkeeren. Was daarna de Protein L agarose beads vier keer door centrifugatie. Verwijder vervolgens het supernatant zonder het agarose pellet te verstoren en herhaal de wasprocedure nog drie keer.Voeg vervolgens verse BSA-bevattende IP-buffer toe aan de Proteïne L-agarose en incubeer dit gedurende de nacht op een roller bij vier graden Celsius. Voeg aan 800 µL IP-buffer bevattend BSA en 30 mg gelyseerd hersenweefsel 20 µg experimenteel antilichaam, controle-antilichaam of PBS toe. Incubeer 30 mg gelyseerd hersenweefsel in ijskoude IP-buffer met IgM-antilichaam in een 1,5 mm microcentrifugebuis gedurende de nacht bij vier graden Celsius.Centrifuge de Protein L agarose-beads de volgende dag in een benchtop centrifuge. Verwijder het supernatant zonder het agarose-pellet te verstoren. Voeg vervolgens de gekoelde antilichaam-hersenlysaatoplossing toe aan de Protein L agarose.Incubeer het antilichaam-antigeen, Protein L agarose-suspensie gedurende twee uur op een roller bij vier graden Celsius. Was na twee uur het aan agarose L gebonden antilichaam-antigeencomplex via centrifugatie. Verwijder voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren en voeg één milliliter ijskoud IP-buffer met 0,2% BSA toe.Herhaal de wasstap nogmaals met ijskoud IP-buffer met 0,2% BSA en nog twee keer met ijskoud IP-buffer zonder BSA. Centrifugeer daarna het antilichaam-antigeencomplex dat gebonden is aan agarose L. Gebruik een 200 microliter pipette om het supernatant te verwijderen totdat er ongeveer 50 microliters van de oplossing bovenop de Protein L agarose pellet overblijft. Gebruik vervolgens een 10 microliter pipette om dit volledig te verwijderen.Houd alle monsters op ijs. Voeg vervolgens 40 µL IP-elutiebuffer toe aan elke 1,5 ml microcentrifugebuis. Tik met de vinger zes keer tegen de buis en verhit deze gedurende vijf minuten bij 95 °C.Plaats het monster daarna twee minuten op ijs en centrifugeer het 30 seconden. Draag vervolgens 35 µL van het supernatant over naar een nieuw 1,5 mm microcentrifugebuisje zonder het pellet te verstoren. Bevestig vervolgens de afwezigheid van Protein L agarose-beads door een kleine hoeveelheid verdunderd monster langs de binnenwand van het buisje te spoelen.Indien er Protein L agarose-beads aanwezig zijn, centrifugeer het monster dan nogmaals 30 seconden bij 13.000 ×g en breng het supernatant over naar een schone buis. Herhaal deze stap totdat er geen agarose-beads meer detecteerbaar zijn. Laad vervolgens 10-20 µL van de verdunde monsters per put op een SDS-polyacrylamidegel met een tris-glycine SDS-buffersysteem en laat de gel ongeveer één uur lopen bij 100 V op het aanrecht zonder extra koeling.Breng de eiwitten vervolgens over naar een PVDF-membraan. De eiwitten worden gedurende twee en een half uur in de koelruimte overgebracht bij 100 volt met behulp van koude transferbuffer. Blokkeer het membraan gedurende één uur bij 25 °C op een orbital shaker op het aanrecht met 10% w/v droge melkpoeder in PBS-T.Was het twee keer gedurende 10 minuten per keer met PBS-T. Incubeer het membraan met het primaire antilichaam in 5% BSA in PBS-T. Incubeer dit gedurende de nacht in de koelruimte op een orbitale schudder.Was de volgende ochtend het membraan eenmaal met een overmaat PBS-T bij 25 °C, gevolgd door drie wasbeurten met PBS-T van elk 10 minuten op een orbitale schudmachine. Voeg vervolgens secundair antilichaam en 5% droge melkpoeder in PBS-T toe aan het membraan en incubeer dit gedurende één uur bij 25 °C op een orbitale schudmachine. Was het membraan daarna eenmaal met een overmaat PBS-T bij 25 °C, gevolgd door drie wasbeurten met PBS-T van elk 10 minuten op een orbitale schudmachine.Meng één milliliter gekoelde enhanced chemiluminescence HRP-substraatcomponent A met één milliliter component B bij 25 °C. Plaats het membraan op een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen. Droog vervolgens de container met papieren handdoeken voordat u het membraan er opnieuw in overbrengt.Voeg onmiddellijk twee milliliter van het vooraf gemengde enhanced chemiluminescence HRP-substraat toe aan het membraan en incubeer dit gedurende twee minuten bij 25 °C. Kantel de houder elke 20 seconden handmatig om het membraan gelijkmatig te bevochtigen. Plaats het membraan daarna in een transparante plastic hoes en verwijder overtollige vloeistof en luchtbellen met papieren handdoeken.Plak de plastic huls in de cassette en sluit deze. Deze figuur laat zien dat HigM12 zijn antigeen immunoprecipiteert uit cerebrale hersenlysaten en fungeert als detectiemiddel in Western blots. Noch het isotype controle-antilichaam noch de agarose L-beads immunoprecipiteren een soortgelijk antigeen, wat de specificiteit van de pull-down aantoont.Hier tonen Western blots met gebruik van CNS-lysaten van wild-type en NCAM-knockoutmuizen de specificiteit aan van de binding van HIgM aan PSA-bevattend NCAM. Enzymatische digestie van CNS-weefsel van wild-type muizen met gebruik van ENDO-NF identificeert PSA gebonden aan NCAM als het specifieke bindingsepitoop voor HIgM12. Met de hierin beschreven methode worden IBA-1-positieve rattenmicroglia-culturen van hoge zuiverheid verkregen. In tegenstelling tot microglia waren HIgM12- en A2B5-doelwitantigenen op het celoppervlak sterk verrijkt in ratten-OPC-culturen onder levende celcondities.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze binnen 13 werkuren worden uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals Biacore of surface plasmon resonance-technologie, worden ingezet om de bindingsaffiniteiten van de antilichamen aan associatie- en dissociatieconstanten te identificeren. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van kankeronderzoek, immunotherapieën en natuurlijke autoantilichamen om koolhydraatepitopen op eiwitten te identificeren als antigenen voor therapeutische IgM-antilichamen bij mensen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u glycoproteïne-antigenen identificeert voor onderzoek met menselijke IgM-antilichamen. De gegevens bieden een nieuw doelwit voor MS-therapie. PSA ENCAP, de antilichaambehandeling die wij hebben ontwikkeld, is een van de eerste die functionele verbetering laat zien in een activiteitsbox met gebruik van het rigoureuze model dat de ziekte nabootst en deze evalueert, vergelijkbaar met Multiple Sclerose.

antibody-binding-specificity-for-kappa-v-light-chain-containing-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In deze studie beschrijven we een verbeterde protocol een gemultiplexte high-throughput antilichaam microarray met lectine detectiemethode die gebruikt kan worden in de glycosylering profilering van specifieke eiwitten. Dit protocol is voorzien van nieuwe betrouwbare reagentia en vermindert de tijd, kosten en lab-apparatuur eisen ten opzichte van de vorige procedure.

Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van twee IgG-klasse monoklonale antilichamen (mAbs) die sterk reageren op myoglobine van cetacean. Deze mAbs worden toegepast op een colloïdaal goud immunochromatografische teststrip op basis van het sandwich-formaat om het Mb van cetacean te onderscheiden van zeehond en andere dieren.

Ontwikkeling van een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatographic teststrip voor detectie van walvisachtigen Myoglobin

Hier presenteren de auteurs een eenvoudig en efficiënt protocol om een lineair antigeen epitoop te definiëren met behulp van een gezuiverd monoklonaal antilichaam en peptide scanning door dot-blot hybridisatie. De geïdentificeerde epitoop kan vervolgens worden gebruikt in therapeutische en diagnostische toepassingen.

Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding en de evaluatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten voor gebruik in verschillende immunoassay. Deze procedure omvat immunisatie, celfusie, indirecte competitieve ELISA voor positieve kloon screening en monoclonal hybridoma voorbereiding. De specificaties voor de karakterisering van het antilichaam met behulp van MALDI-TOF-MS en ELISA analyses zijn ook beschikbaar.

Generatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten

Hier presenteren we een protocol om te produceren een antilichaam bispecifieke GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Het gezuiverde GPC3-S-Fab heeft krachtige cytotoxiciteit tegen GPC3 positieve lever kankercellen.

Een GPC3-targeting bispecifieke antilichaam, GPC3-S-Fab, met krachtige cytotoxiciteit

Benaderingen voor de biofysische en structurele karakterisatie van glycoproteïnen presenteren wij met de immunoglobuline vouw door biolayer interferometrie, isothermische titratie calorimetrie en röntgendiffractie.

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

Genetische code uitbreiding wordt toegepast voor de introductie van een onnatuurlijk aminozuur met een biorthogonale functionele groep op een drager eiwit op een gedefinieerde site. De biorthogonale functie wordt verder gebruikt voor de plaatsselectieve koppeling van een koolhydraatantgeen om een homogeen glycoconjugaatvaccin te bieden.

Homogene Glycoconjugaat geproduceerd door gecombineerde onnatuurlijke aminozuur integratie en click-chemie voor vaccindoeleinden

Hier wordt een methode beschreven om de bindingsaffiniteit (KD) van radioactief gelabelde antilichamen tegen geïmmobiliseerde antigenen te bepalen. KD is de evenwichtsdissociatieconstante die kan worden bepaald uit een verzadigingsbindingsexperiment door de totale, specifieke en niet-specifieke binding van een radioactief gelabeld antilichaam in verschillende concentraties aan zijn antigeen te meten.

Bepaling van bindingsaffiniteit (KD) van radioactief gelabelde antilichamen tegen geïmmobiliseerde antigenen

Dit protocol beschrijft single-antibody labeling (SAL) om de nanoschaal ruimtelijke organisatie van plasmamembraaneiwitten op te lossen. Door cumulatieve antilichaam-epitoopinteracties op het niveau van één molecuul te benutten, brengt membraan SAL (mSAL) lokale epitoopverdelingen in kaart terwijl het tegelijkertijd het bindingsgedrag van antilichamen in de natuurlijke cellulaire omgeving vastlegt.

Single-molecule localisatiemicroscopie van membraaneiwitten met single-antibody labeling

Leer hoe u antigeen-eiwitten identificeert voor therapeutische IgM-antilichamen met immunoprecipitatie en Western blotting. Deze methode opent nieuwe mogelijkheden voor immunotherapie en biomarkeronderzoek.

Antilichaam bindende specificiteit voor Kappa (VK-) lichte keten bevattende de Mens (IgM) antilichamen: Polysialic Acid (PSA) Gehecht aan NCAM als Case Study (Video) | JoVE Journal

Antilichaam bindende specificiteit voor Kappa (VK-) lichte keten bevattende de Mens (IgM) antilichamen: Polysialic Acid (PSA) Gehecht aan NCAM als Case Study

Meer video's verkennen