Antilichaam bindende specificiteit voor Kappa (VK-) lichte keten bevattende de Mens (IgM) antilichamen: Polysialic Acid (PSA) Gehecht aan NCAM als Case Study
29 juni 2016
We presenteren een protocol om eiwitdeeltjes te identificeren die antigenen bevatten voor menselijke en muis IgM-antilichamen met specifieke kappa (Vκ) lichte ketens. Dit protocol is niet beperkt tot IgM-klasse antilichamen, maar is van toepassing op alle immunoglobuline isotypes die hun antigeen met voldoende hoge affiniteit targeten tijdens immunoprecipitaties.
Het algemene doel van deze procedure is om antigenen voor antilichamen met therapeutisch potentieel te identificeren met een focus op de IgM-isotype. Deze methode vult een kenniskloof in het biomedische veld en kan helpen bij het identificeren van nieuwe biomarkers en immunotherapeutische middelen voor kankeronderzoek en ziekten van het centrale zenuwstelsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de deur opent naar een verwaarloosde klasse van antilichamen met groot therapeutisch potentieel.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de diagnose en behandeling van alle ziekten die kunnen worden gericht door op antilichamen gebaseerde therapeutischa. Wat deze zaak kan inzicht bieden in antigenen van IgM-antilichamen en groeiend weefsel en subcultuur. Het kan ook een plaag zijn voor andere antilichaam-isotypen van alle soorten.
Ik had voor het eerst het idee voor deze methode toen ik specifieke en prominente binding van het IgM-antilichaam in verschillende biochemische toepassingen realiseerde. Het demonstreren van de procedure zal Robert Kahoud en Jens Watzlawik zijn. Om deze procedure te beginnen, maak een snede op de schedel naar de voorkant op het oorniveau en pel de schedel terug.
Plaats vervolgens voorzichtig de hersenen in een 15 milliliter buis en bewaar deze onmiddellijk op droog ijs. Na vijf minuten brengt u de hersenen over naar een schoon weegpapier en verwijdert u snel het cerebellum en de hersenstam met behulp van een schone scheermesjes. Weeg vervolgens het bevroren cerebrum voordat u het terugbrengt in de 15 milliliter buis op ijs.
Voeg ijskoud lysisbuffer toe tot een eindconcentratie van 150 microgram hersenweefsel per microliter lysisbuffer. Homogeniseer vervolgens de hersenen in lysisbuffer door trituratie door een pipettip van één milliliter gevolgd door trituratie door een spuit van vijf milliliter uitgerust met een naald van 27 gauge. Daarna incubeer de hersenlysaat gedurende nog eens 30 minuten op ijs om volledige weefsellisering mogelijk te maken.
Na 30 minuten verwijdert u detergent, onoplosbaar materiaal en hersenlipiden voor seriële centrifugatie. Gooi de myeline en celresten bevattende pellet weg, maar bewaar de supernatant na elke centrifugatiestap. Verdeel het hersenlysaat in porties en bewaar het bij 80 graden Celsius.
In deze stap bereidt u 200 milliliter IP-buffer met BSA en nog eens 200 milliliter IP-buffer zonder BSA. Voor de immunoprecipitatiereactie, brengt u 100 microliter Protein L agarose suspensie over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Voeg een milliliter IP-buffer met BSA toe aan de buis.
Meng het vervolgens handmatig door omkering. Was vervolgens Protein L agarose-kralen vier keer door centrifugatie. Verwijder daarna het supernatant zonder de agarose-pellet te verstoren en herhaal de wasprocedure nog drie keer.
Voeg vervolgens vers BSA-bevattend IP-buffer toe aan de Protein L agarose en incubeer het een nacht op een roller bij vier graden Celsius. In 800 microliter IP-buffer met BSA en 30 milligram gelyseerd hersenweefsel, voegt u 20 microgram experimenteel antilichaam, controle-antilichaam of PBS toe. Incubeer 30 milligram gelyseerd hersenweefsel in ijskoud IP-buffer met IgM-antilichaam in een 1,5 millimeter microcentrifugebuis een nacht bij vier graden Celsius.
De volgende dag draait u Protein L agarose-kralen neer in een tafelcentrifuge. Gooi het supernatant weg zonder de agarose-pellet te verstoren. Voeg vervolgens de gekoelde antilichaam-hersenlysaat-oplossing toe aan de Protein L agarose.
Incubeer het antilichaam-antigeen, Protein L agarose-suspensie gedurende twee uur op een roller bij vier graden Celsius. Was na twee uur het antilichaam-antigeencomplex dat aan agarose L is gehecht door centrifugatie. Gooi voorzichtig het supernatant weg zonder de pellet te verstoren en voeg een milliliter ijskoud IP-buffer met 0,2%BSA toe.
Herhaal de wasstap nog een keer met ijskoud IP-buffer met 0,2%BSA en nog twee keer met ijskoud IP-buffer zonder BSA. Spin daarna het antilichaam-antigeencomplex dat aan agarose L is gehecht. Gebruik een pipet van 200 microliter om het supernatant weg te gooien tot er ongeveer 50 microliter van de oplossing bovenop de Protein L agarose-pellet is. Gebruik vervolgens een pipet van 10 microliter om het volledig te verwijderen.
Houd alle monsters op ijs. Voeg vervolgens 40 microliter IP-elutiebuffer toe aan elke 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Tik zes keer met uw vinger op de buis en verwarm deze gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius.
Plaats daarna het monster gedurende twee minuten op ijs en draai het gedurende 30 seconden neer. Breng vervolgens 35 microliter van het supernatant over naar een nieuwe 1,5 millimeter microcentrifugebuis zonder de pellet te verstoren. Bevestig vervolgens de afwezigheid van Protein L agarose-kralen door een kleine hoeveelheid verdund monster op de binnenwand van de buis te spoelen.
Als er Protein L agarose-kralen aanwezig zijn, draai het monster nog eens 30 seconden bij 13.000 keer g en breng het supernatant over naar een schone buis. Herhaal deze stap totdat er geen agarose-kralen meer detecteerbaar zijn. Laad vervolgens 10-20 microliter verdund monster per putje op een SDS-polyacrylamidegel en een tris-glycine SDS-buffersysteem en laat de gel ongeveer een uur draaien bij 100 volt op de tafel zonder extra koeling.
Transfer vervolgens de eiwitten naar een PVDF-membraan. Eiwitten worden gedurende twee en een half uur in de koelkast bij 100 volt overgebracht met behulp van koud overdrachtsbuffer. Blokkeer het membraan met 10% gewicht per volume droge melkpoeder in PBS-T gedurende een uur bij 25 graden Celsius op een orbitale shaker op de tafel.
Was het twee keer gedurende 10 minuten met PBS-T. Probeer het membraan met primaire antilichamen in 5%BSA in PBS-T. Incubeer overnacht op een orbitale shaker in de koelkast.
De volgende ochtend wast u het membraan eenmaal met overtollig PBS-T bij 25 graden Celsius, gevolgd door drie wasbeurten met PBS-T gedurende 10 minuten elk op
Overzicht
Dit protocol identificeert eiwitfracties die antigenen bevatten voor humane en muize IgM-antilichamen, met de nadruk op specifieke kappa (V魏) lichte ketens. Het is toepasbaar op alle immunoglobuline-isotypen die tijdens immunoprecipitaties met een hoge affiniteit op antigenen zijn gericht.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Biotechnologie
Achtergrond
- IgM-antilichamen hebben een therapeutisch potentieel bij diverse ziekten.
- Deze methode vult een kennishia op bij het identificeren van antigenen voor deze antilichamen.
- Het kan leiden tot nieuwe biomarkers en immunotherapeutische middelen.
- De techniek kan worden uitgebreid naar andere antilichaamisotypes over verschillende soorten heen.
Doel van de studie
- Om antigenen te identificeren voor antilichamen met therapeutisch potentieel.
- Om het begrip van IgM-antilichamen in biomedisch onderzoek te vergroten.
- Om de ontwikkeling van op antilichamen gebaseerde therapieën te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van hersenweefsel en lysering met behulp van specifieke buffers.
- Immunoprecipitatie met Protein L agarose beads.
- Western blotting voor proteïnedetectie.
- Incubatie- en wasstappen om specificiteit en zuiverheid te waarborgen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van antigenen geassocieerd met IgM-antilichamen.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op diverse isotypes van immunoglobulinen.
- Potentieel voor het ontdekken van nieuwe therapeutische targets bij kanker en ziekten van het centrale zenuwstelsel.
Conclusies
- Dit protocol biedt een waardevol instrument voor onderzoekers in de immunologie.
- Het opent wegen voor verdere studies naar therapieën op basis van antilichamen.
- Toekomstig onderzoek kan verder ingaan op de implicaties van IgM-antilichamen.
Veelgestelde Vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Robuuste identificatie van IgM-antilichaamantegenen, in het bijzonder die gericht zijn op koolhydraatepitopen zoals PSA-NCAM, vult een kritiek hiaat in de vroege fase van therapeutische ontdekking voor CNS- en oncologiepijplijnen. Deze workflow maakt mechanische risicoreductie en targetvalidatie mogelijk voor antilichaamgebaseerde modaliteiten, wat bijdraagt aan voorspellende zekerheid op cruciale beslismomenten binnen de portfolio. Door de bindingsspecificiteit en antigeenafhankelijkheid te verduidelijken, verbetert deze methode de translationele continuïteit en biedt ze een basis voor risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Maakt functionele validatie mogelijk van de specificiteit van IgM-antilichamen tegen gedefinieerde glycoproteïnetargets.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door antigeenafhankelijkheid te bevestigen met behulp van knockout- en enzymatische digestiecontroles.
- Faciliteert de identificatie van nieuwe ziekterelevante epitopen voor de ontwikkeling van therapeutische antilichamen.
- Biedt een platform voor het onderzoeken van niet-eiwitantigenen, waardoor de targetruimte wordt uitgebreid voorbij conventionele eiwitten.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt gevalideerde immunoprecipitatie- en Western blot-protocollen voor reproduceerbare antigeendetectie.
- Stelt kwantitatieve en kwalitatieve read-outs vast voor antilichaam-antigeeninteracties in CNS-weefsel en celculturen.
- Maakt standaardisatie mogelijk van workflows voor antilichaamscreening voor targets met een lage affiniteit of complexe targets.
- Bereidt biologische systemen voor op downstream affiniteits- en specificiteitsassays, zoals Biacore SPR.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt antilichaamspecificiteitsgegevens uit met ziekterelevante CZS-modellen, wat translationele biomarkerstrategieën ondersteunt.
- Biedt continuïteit van antigeenontdekking tot preklinische validatie in modellen van MS en ALS.
- Vermindert biologische risico's in een laat stadium door target-engagement te bevestigen in relevante weefselcontexten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert op het snijvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie, waarmee antigeenvalidatie wordt verbonden met downstream screening en preklinische beoordeling.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing voor antilichaam-antigeenspecificiteit en betrokkenheid van signaalpaden in CNS-ziektemodellen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten van immunoprecipitatie en Western blot voor de evaluatie van kandidaat-antilichamen.
- Analytics: Biedt duidelijke statistische en vergelijkende uitkomsten voor specificiteit, inclusief knockout- en enzymatische controles.
- Translationeel onderzoek: Verbindt antigeenvalidatie met ziekterelevante systemen, wat bijdraagt aan biomarker- en therapeutische strategieën.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare workflow voor de doelwitvalidatie van IgM- en andere isotype-antilichamen over diverse programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van antilichaamdoelen en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standardiseert uitdagende IgM-workflows, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid voor R&D-teams worden verbeterd.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen en kapitaalallocatie mogelijk door target engagement in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van antilichaamgebaseerde activa die gericht zijn op complexe antigenen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in immunoprecipitatie, Western blotting en het verwerken van CNS-weefsel.
- Vereist toegang tot knockout-modellen en enzymatische reagentia voor specificiteitscontroles.
- Maakt cross-team standaardisatie van validatieprotocollen voor antilichamen en antigenen noodzakelijk.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende antilichaam-isotypen of weefselbronnen.
- Beperkt door de noodzaak van hoogwaardige antilichamen en gevalideerde detectiereagentia.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
General CNS Tissue Preparation
2:42
Protein L Agarose Bead Preparation
8:44
Results: Antibody Binding Specificity for Kappa Light Chain-containing Human Antibodies
9:54
Conclusion
3:43
Antibody-Antigen-Agarose L Complex Formation and Antigen Detection in Western Blots
